Name: Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Poznaj metodę EPA 1615 do wykrywania enterowirusów i norowirusów w wodzie pitnej i środowiskowej za pomocą RT-qPCR. Technika ta zapewnia niezawodną ilościową ocenę wirusów dla celów ochrony zdrowia publicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Ericowi Rhodesowi za przygotowanie klonów użytych do opracowania odczynnika o krzywej standardowej, Brianowi McMinnowi za pomoc w przetwarzaniu próbek, Larry'emu Wymerowi za analizę statystyczną, Dr. Markowi Borchardtowi, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, za dostarczenie serotypu 3 wirusa polio Sabin użytego w tym badaniu oraz Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, na mysiego norowirusa. Autorzy dziękują również Gretchen Sullivan za pomoc w przygotowaniu podstawowych odczynników laboratoryjnych, dr Mohammadowi Karimowi za rozmnażanie zapasów mysiego norowirusa oraz lokalnym prywatnym właścicielom studni i zakładom użyteczności publicznej za umożliwienie nam pobrania próbek wody. Mimo że praca ta została zrecenzowana przez EPA i zatwierdzona do publikacji, niekoniecznie musi odzwierciedlać oficjalną politykę Agencji. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.

Uwaga: Należy używać arkuszy danych do śledzenia wszystkich etapów protokołu; przykładowe arkusze danych znajdują się w materiałach uzupełniających, Tabele S2-S4.
1. Przygotowanie krzywej wzorcowej
<ol>
	<li>Przygotować roztwór roboczy odczynnika do krzywej wzorcowej (np. Armored RNA EPA-1615), rozcieńczając go z koncentracji dostarczonej przez producenta do stężenia 2.5 x 108 particles/ml (2.5 x 108 GC/ml) przy użyciu buforu TSM III. Rozdzielić roztwór roboczy na aliquoty o objętości 250 µl do probówek mikrocentryfużkowych 1.5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące przygotowania roztworów roboczych wirusa i plazmidów do wykorzystania jako alternatywne odczynniki do krzywej wzorcowej znajdują się w kroku S1 protokołu materiałów uzupełniających.</li>
	<li> rozmrozić jedną lub więcej aliquot roztworu roboczego. Przygotować pięć 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych w probówkach mikrocentryfużkowych 1.5 ml, aby uzyskać stężenia 2.5 x 107, 2.5 x 106, 2.5 x 105, 2.5 x 104 oraz 2.5 x 103 GC/ml.
	<ol>
		<li>Przygotować pierwsze rozcieńczenie, dodając 25 µl roztworu roboczego o stężeniu 2.5 x 108 GC/ml do 225 µl buforu TSM III. Mieszać przez 5–15 s za pomocą wstrząsarki vortex.</li>
		<li>Przygotować kolejne rozcieńczenie, dodając 25 µl rozcieńczenia przygotowanego w kroku 1.2.1 do 225 µl buforu TSM III. Ponownie wymieszać i kontynuować analogiczną procedurę w celu przygotowania trzech kolejnych 10-krotnych rozcieńczeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Niezwłocznie wyizolować RNA z roztworu roboczego do krzywej wzorcowej oraz z pięciu rozcieńczeń, stosując procedurę opisaną w sekcji 3.</li>
</ol>
2. Koncentracja trzeciorzędowa
<ol>
	<li>Przygotować koncentrator wirowkowy (próg odcięcia masy cząsteczkowej 30 000) dla każdej pobranej próbki, dodając co najmniej 10 ml 1x PBS z 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do górnej komory na próbkę. Upewnić się, że roztwór wypełnił wąską komorę koncentracyjną, a następnie przechowywać przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Odlać ciecz. Przepłukać koncentrator jednokrotnie co najmniej 10 ml sterylnej wody klasy odczynnikowej w celu usunięcia nadmiaru BSA, a następnie odlać wodę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do oddzielnych koncentratorów wirowkowych dodać ilość drugiego koncentratu wodnego z każdej próbki testowej równą S, czyli objętości próbki do analizy (Assay Sample Volume).
	<ol>
		<li>Obliczyć S korzystając z równania 1, 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> 
		Gdzie D to objętość analizowanej oryginalnej próbki wody (Volume of Original Water Sample Assayed), TSV to całkowita objętość próbki (Total Sample Volume), a FCSV to końcowa objętość skoncentrowanej próbki (Final Concentrated Sample Volume). Przykład obliczenia S znajduje się w materiałach uzupełniających S2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować każdą próbkę testową z przyspieszeniem 3 000–6 000 x g w temperaturze 4 °C w rotorze z koszyczkami w pozycji skośnej przez 20–30 min. Sprawdzić objętość w wąskiej komorze koncentracyjnej.
	<ol>
		<li>Jeśli objętość przekracza 400 µl, wirować ponownie przez 20 min lub dłużej. Kontynuować wirowanie do momentu, aż objętość próbki w wąskiej komorze koncentracyjnej zostanie zredukowana do mniej niż 400 µl. Nie usuwać nadsączu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć ścianki koncentratora wirowkowego 1 ml sterylnego 0,15 M fosforanu sodu, pH 7–7,5, aby zwiększyć odzysk wirusa. Wirować ponownie przy 3 000–6 000 x g i 4 °C, aż objętość próbki zostanie zredukowana do mniej niż 400 µl. Powtórzyć ten etap płukania jeszcze raz.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety 100-200 µl ostrożnie odmierzyć i przenieść każdą skoncentrowaną próbkę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml (tj. przenieść 200 µl do probówki, a następnie odmierzyć pozostały koncentrat, regulując mikropipetę do momentu, aż pozostała ciecz zostanie całkowicie zaciągnięta do końcówki pipety). Dodać 0,15 M fosforan sodu, pH 7–7,5, aby dostosować końcową objętość do 400 ± 2 µl.</li>
	<li>Niezwłocznie wyizolować kwasy nukleinowe, przechodząc do kroku 3. W przypadku próbek skoncentrowanych, których nie można przetworzyć natychmiast, przechowywać je w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez 24 hr.</li>
</ol>
3. Izolacja kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Do oddzielnych, oznakowanych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 200 µl buforu do ekstrakcji przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 3.3 oraz 200 µl koncentratu trzeciorzędowego z każdej próbki testowej z kroku 2.5 lub rozcieńczenia krzywej wzorcowej z kroku 1.3. Pozostałe koncentraty trzeciorzędowe zamrozić w temperaturze -70 °C lub niższej. Wyekstrahować kwasy nukleinowe z każdej próbki zgodnie z instrukcją producenta zestawu do ekstrakcji kwasów nukleinowych dla protokołu wirowego dla próbek krwi, z następującymi wyjątkami.</li>
	<li>Nie dodawać proteazy do próbek wody ani nie używać buforu do ekstrakcji dostarczonego w zestawie do ekstrakcji kwasów nukleinowych.</li>
	<li>Przygotować bufor do ekstrakcji z RNA nośnikowym
	<ol>
		<li>Do fiolki zawierającej 310 µg RNA nośnikowego dodać 310 µl buforu do rozcieńczania RNA nośnikowego. Wymieszać do rozpuszczenia, a następnie podzielić na 6 aliquotów zawierających około 50 µl każdy. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodać 28 µl rozmrożonego RNA nośnikowego na 1 ml buforu do ekstrakcji, aby uzyskać stężenie RNA nośnikowego 0,027 µg/µl. Użyć buforu do ekstrakcji z dodatkiem RNA nośnikowego zamiast buforu dostarczonego w zestawie do ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór główny buforu do elucji poprzez dodanie inhibitora rybonukleazy (RNase) do końcowego stężenia 400 jednostek/ml do buforu do elucji dostarczonego w zestawie do ekstrakcji.
	<ol>
		<li>Eluować RNA z wirowej kolumny do wiązania kwasów nukleinowych, nanosząc na kolumnę 50 µl buforu do elucji z inhibitorem RNase. Odczekać 1 min, a następnie wirować przy 6 000 x g przez 1 min w temperaturze RT.</li>
		<li>Powtórzyć krok 3.4.1, a następnie wyjąć i zutylizować kolumnę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować aliquoty ekstraktów RNA z kroku 3.4.2. Przygotować 6 aliquotów roztworu roboczego krzywej wzorcowej oraz każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej, zawierających co najmniej 15 µl każdy. Przygotować 4 aliquoty wszystkich pozostałych próbek RNA, zawierających co najmniej 22 µl każdy. Przechowywać jeden aliquot każdej próbki i kontroli krzywej wzorcowej w temperaturze 4 °C, jeśli mogą one zostać poddane odwrotnej transkrypcji w ciągu 4 h; w przeciwnym razie wszystkie aliquoty przechowywać w temperaturze -70 °C lub niższej.</li>
</ol>
4. Odwrotna transkrypcja (RT)
<ol>
	<li>Przygotować 100 µM roztwory stokowe każdego startera oligonukleotydowego i sondy wymienionej w Tabeli 1, dodając do każdej fiolki objętość wody klasy PCR w mikrolitrach równą dziesięciokrotności liczby nanomoli (nmol) oligonukleotydu znajdującego się w fiolce (zgodnie z etykietą fiolki lub kartą specyfikacji producenta (np. starter zawierający 36,3 nmol rozpuścić w 363 µl)). Wymieszać do całkowitego rozpuszczenia.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwory 100 µM w stosunku 1:10 wodą klasy PCR, aby przygotować roztwory robocze 10 µM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować RT Master Mix 1 i 2 w pomieszczeniu czystym, korzystając z wytycznych w Tabeli 2. Do każdego dołka płytki PCR pipetować 16,5 µl RT Master Mix 1 za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Rozmrozić (jeśli były zamrożone) ekstrakty kwasów nukleinowych z każdej próbki terenowej oraz z matrycy próbek wzbogaconych laboratoryjnie (Lab Fortified Sample Matrix, LFSM; t.j. próbki matrycy wodnej zaszczepionej materiałem).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć każdą próbkę terenową oraz LFSM w stosunku 1:5 i 1:25 w buforze eluującym zawierającym 400 jednostek/ml inhibitora RNazy.</li>
		<li>Rozmrozić (jeśli były zamrożone), ale nie rozcieńczać: próbki kontrolnej białej wzbogaconej laboratoryjnie (Lab Fortified Blank, LFB; t.j. pozytywna kontrola jakości z wykorzystaniem zaszczepionej wody klasy reagentowej), próbki kontrolnej białej reagentowej (Lab Reagent Blank, LRB; t.j. negatywna kontrola jakości z wykorzystaniem wody klasy reagentowej), próbki do oceny wydajności (Performance Evaluation, PE; t.j. próbki zaszczepionej wody klasy reagentowej używane do oceny wydajności laboratorium przed rozpoczęciem badania), próbki testu wydajności (Performance Test, PT; t.j. próbki zaszczepionej wody klasy reagentowej o mianie nieznanym analitykowi, używane do oceny wydajności laboratorium w trakcie badania), negatywną kontrolę ekstrakcji serii NA lub wyekstrahowane RNA z zestawu krzywej wzorcowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do oddzielnych dołków płytki PCR nanieść po 6,7 µl RNA z każdej próbki badawczej, kontroli i krzywej wzorcowej, stosując triplikaty dla próbek badawczych i kontroli oraz duplikaty dla krzywych wzorcowych (przykład płytki RT znajduje się na Rysunku S1).
	<ol>
		<li>Do oddzielnych dołków płytki PCR nanieść po 6,7 µl buforu eluującego dla kontroli bez matrycy (no template controls, NTC). Uwzględnić od 2 do 8 NTC na płytkę RT, stosując dwie dla pierwszej próbki i kolejne dwie dla każdej czwartej dodatkowej próbki.</li>
		<li>Rozmieścić negatywne kontrole ekstrakcji oraz kontrole NTC na całej powierzchni płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszczelnić płytkę PCR termoodporną folią uszczelniającą. Mieszać próbki przez 5–10 s, a następnie krótko wirować przy ≥ 500 x g.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 4 min w temperaturze 99 °C, a następnie szybko schłodzić do 4 °C w termocyklerze. Ponownie krótko wirować przy ≥ 500 x g.</li>
	<li>Ostrożnie zdjąć folię uszczelniającą i dodać 16,8 µl RT Master Mix 2 do każdego dołka. Ponownie uszczelnić płytkę folią termoodporną, wymieszać i krótko wirować przy ≥ 500 x g.</li>
	<li>Umieścić płytkę w termocyklerze i prowadzić cykl: 15 min w 25 °C, następnie 60 min w 42 °C, 5 min w 99 °C, a na koniec cykl podtrzymania w 4 °C.</li>
	<li>Przetworzyć natychmiast lub w ciągu 8 h metodą qPCR (Krok 5) lub przechowywać próbki w temperaturze -70 °C lub niższej do czasu przetworzenia. Próbki, które mogą zostać przetworzone w ciągu 8 h, przechowywać w 4 °C.</li>
</ol>
5. Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)
<ol>
	<li>Przed analizą próbek testowych wyznaczyć średnią wartość Cq dla zapalenia wątroby G dla każdej partii odczynników do wykrywania zapalenia wątroby G.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić analizę RT, wykorzystując 10 powtórzeń przygotowanych zgodnie z opisem dla kontroli NTC (krok 4.1.1). Wykonać analizę qPCR dla zapalenia wątroby G zgodnie z opisem poniżej (kroki 5.2 do 5.5.3). Obliczyć średnią wartość Cq dla 10 powtórzeń.</li>
		<li>Jeśli jest to konieczne, dostosować ilość odczynnika do wykrywania zapalenia wątroby G w RT Master Mix 1 (Tabela 2), aby uzyskać średnią wartość Cq między 25 a 32 jednostkami. Skompensować zwiększoną lub zmniejszoną ilość, zmieniając objętość dodawanej wody, aby utrzymać końcową objętość RT Master Mix 1 na poziomie 16,5 µl na analizę.</li>
		<li>Potwierdzić wprowadzone korekty, powtarzając kroki 5.1.1 do 5.1.2, a następnie zaktualizować Tabelę 2, aby odzwierciedlała skorygowane ilości.&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaniny master mix do qPCR w pomieszczeniu czystym, korzystając z wytycznych zawartych w Tabeli 3 dla enterowirusów, Tabeli 4 i Tabeli 5 dla norowirusów genogrupy I, Tabeli 6 dla norowirusów genogrupy II, Tabeli 7 dla norowirusa mysiego (norowirus genogrupy V) oraz Tabeli 8 dla zapalenia wątroby G. Wymieszać każdy master mix, a następnie krótko odwirować przy ≥ 500 x g.</li>
	<li>Nanieść master mixy do PCR do odpowiednich dołków oznakowanej optycznej płytki reakcyjnej, stosując 14 µl na dołek i oddzielne płytki dla każdej analizy qPCR (możliwy układ analizy qPCR oparty na układzie RT z Rysunku S1 przedstawiono na Rysunku S2).</li>
	<li>Jeśli płytka RT z kroku 4.8 była zamrożona, rozmrozić ją w temperaturze pokojowej. Wymieszać za pomocą mieszadła do płytek, a następnie krótko odwirować przy ≥ 500 x g.</li>
	<li>Nanieść 6 µl odpowiedniego cDNA do właściwych dołków optycznej płytki reakcyjnej. Wymieszać próbki na optycznej płytce reakcyjnej i krótko odwirować przy ≥ 500 x g.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić analizę qPCR dla zapalenia wątroby G na nierozcieńczonych i rozcieńczonych próbkach terenowych oraz próbkach LFSM przed wykonaniem wszystkich pozostałych analiz qPCR. Użyć najniższego rozcieńczenia próbki terenowej lub LFSM, którego wartość Cq jest o &#60;1 jednostkę wyższa niż średnia wartość Cq dla zapalenia wątroby G w analizach qPCR dla enterowirusów i norowirusów.</li>
		<li>Skonfigurować oprogramowanie termocyklera do ilościowej PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Zidentyfikować próbki krzywej wzorcowej jako standardy i dla każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej wprowadzić wartości kopii genomicznych podane w Tabeli 9.</li>
		<li>Inkubować płytkę w termocyklerze do ilościowej PCR przez 10 min w 95 °C, a następnie przeprowadzić 45 cykli: 15 s w 95 °C i 1 min w 60 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustalić, czy każda krzywa wzorcowa spełnia dopuszczalne wartości podane w Tabeli 10. Przykłady znajdują się w sekcji S3 materiałów dodatkowych.
	<ol>
		<li>Obliczyć całkowite odchylenie standardowe (StdDev) dla krzywej wzorcowej, korzystając z Równania 2, 
		<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> 
		gdzie Cq jest wartością raportowaną dla każdego powtórzenia krzywej wzorcowej, Cq jest wartością średnią dla każdego zestawu powtórzeń, #Cq to całkowita liczba wartości Cq dla wszystkich powtórzeń kontroli wzorcowej, które mają wartości dodatnie (tzn. nie są niezdeterminowane), a #Stds to liczba kontroli wzorcowych, które mają wartości dodatnie.</li>
		<li>Jeśli oprogramowanie termocyklera do ilościowej PCR nie oblicza nachylenia dla każdej krzywej wzorcowej, obliczyć nachylenie za pomocą Równania 3, 
		<img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> 
		gdzie Cq jest wartością średnią dla najwyższego i najniższego użytego rozcieńczenia, a log GC jest logarytmem wartości kopii genomicznych dla najwyższego i najniższego rozcieńczenia użytego z Tabeli 9.&#160;</li>
		<li>Obliczyć wartość R2 za pomocą Równania 4. 
		<img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> 
		gdzie Cq jest średnią ze wszystkich wartości Cq, a Log GC jest średnią wartości Log GC dla każdego powtórzenia.</li>
		<li>Obliczyć wydajność % za pomocą Równania 5: 
		<img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarejestrować wartości GC obliczone przez oprogramowanie termocyklera dla wszystkich próbek testowych na podstawie krzywych wzorcowych spełniających kryteria określone w Tabeli 10 oraz średnie wartości GC dla każdej próbki. Powtórzyć analizę wszystkich próbek, których krzywe wzorcowe nie spełniają kryteriów w Tabeli 10 lub w których którakolwiek z kontroli negatywnych (LRB, NA Batch negative extraction control lub NTC) jest dodatnia. Ponownie przetworzyć wszystkie próbki, które nie spełniają kryteriów lub wykazują fałszywie dodatnie kontrole podczas powtórnej analizy.</li>
	<li>Wyznaczyć liczbę kopii genomicznych na litr (GCL) dla każdej próbki testowej za pomocą Równania 6: 
	<img alt="Równanie 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> 
	gdzie GC jest średnią liczbą kopii genomicznych z kroku 5.7, czynnik „199” jest całkowitym czynnikiem rozcieńczenia dla redukcji objętości występujących podczas trzeciorzędowego zagęszczania, ekstrakcji RNA i etapów RT-qPCR, DF jest czynnikiem rozcieńczenia kompensującym inhibicję, a D jest objętością oryginalnej próbki wody poddanej analizie w litrach. Przykład obliczenia GCL znajduje się w sekcji S4 materiałów dodatkowych.</li>
	<li>Obliczyć całkowitą liczbę GC próbek LFB i LRB, mnożąc średnią wartość GC z kroku 5.5 przez 199 i dzieląc przez 0,3.</li>
</ol>

<ol><li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li>
<li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li>
<li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li>
<li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li>
<li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus%2C+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li>
<li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li>
<li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22820-F-12-058%3A+Recreational+Water+Quality+Criteria%22">820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria</a>. , 1-63 (2012).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66(2010).</li>
<li>Fout, G. S., et al. Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , U. S. Environmental Protection Agency. 1-91 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li>
<li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus%2C+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li>
<li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li>
<li>Sen, K., et al. EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , U.S. Environmental Protection Agency. 1-56 (2004).</li>
<li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li>
<li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction. Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1990 Nov 11-15, , 833-853 (1990).</li>
<li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li>
<li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li>
<li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment%2C+using+real-time+reverse+transcription-PCR%3A+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li>
<li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li>
<li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li>
<li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li>
<li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay%2C+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li>
<li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li>
<li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li>
<li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria%2C+MS2+and+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , U.S. Environmental Protection Agency. (1996).</li>
<li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li>
<li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteroviruses%2C+adenoviruses%2C+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li>
<li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li>
<li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li>
<li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water%2C+using+Salmonella+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt%2C+humic+acid%2C+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zakrojone na szeroką skalę krajowe badania nad zanieczyszczeniem wirusowym wód źródłowych i pitnych wymagają wykorzystania wielu laboratoriów analitycznych. W tych warunkach potrzebna jest standardowa metoda w celu zapewnienia porównywalności danych uzyskanych przez wiele laboratoriów. Istnieje wiele opublikowanych metod molekularnych wykrywania wirusów, ale bardzo niewiele jest znormalizowanych metod molekularnych. Metoda EPA 1615 jest znormalizowaną metodą zaprojektowaną specjalnie do wykrywania enterowirusów i norowirusów w matrycach wodnych metodą RT-qPCR. Dostępne są znormalizowane metody molekularne do wykrywania wirusów w żywności (CEN/ISO TS 15216-1 i CEN/ISO TS 15216-2; 7 kwietnia 2013 r.)16,17 i zostały zastosowane do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu A i norowirusa w wodzie źródlanej16. Wszystkie standardowe metody muszą obejmować kontrole i kryteria jakości, aby zminimalizować różnice między- i wewnątrzlaboratoryjne oraz wyniki fałszywie dodatnie spowodowane zanieczyszczeniem laboratoryjnym. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć liczbę fałszywych danych, metoda EPA 1615 jest zgodna z wytycznymi EPA dotyczącymi metod molekularnych,18 które przewidują rozdzielenie pracy podczas przetwarzania i jednokierunkowy przepływ pracy. Obejmuje kontrolę wewnętrzną przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu G1,19 oraz procedury mające na celu zminimalizowanie wyników fałszywie ujemnych spowodowanych inhibitorami RT-qPCR15. Wykorzystuje testy ilościowe wraz ze znormalizowanymi objętościami zarówno pobranej wody, jak i wody analizowanej, tak aby wszystkie dane terenowe były wyrażone w kopiach genomowych na litr próbki pola lub wody pitnej. Chociaż skuteczne testy RT-PCR z pojedynczą probówką (jednoetapowe) są dostępne na rynku, metoda celowo wykorzystuje oddzielne testy. Ma to tę wadę, że minimalizuje ilość próbki, którą można oznaczyć w każdej reakcji, ale daje większą elastyczność w stosowaniu wielu zestawów starterów. Testy RT-qPCR są ograniczone i tylko tak dobre, jak użyte startery i sondy, i prawdopodobnie żaden zestaw starterów nie wykryje wszystkich wariantów wirusa w grupie. Zestaw starterów enterowirusów został wybrany, ponieważ jest ukierunkowany na konserwatywny region 5'-non kodujący,20,21 wykrywa szeroką gamę serotypów enterowirusów, a wykryte przez niego wirusy są związane ze skutkami zdrowotnymi wynikającymi ze spożycia nieoczyszczonych wód gruntowych1. Do wykrywania norowirusów genogrupy I stosuje się dwa zestawy starterów22,23. Pierwszy z nich został wybrany ze względu na silną korelację między skutkami zdrowotnymi u małych dzieci a wykrytym wirusem1. Wybrano drugi zestaw starterów genogrupy I oraz zestaw starterów stosowanych dla norowirusów genogrupy II, ponieważ wykrywają one najszerszą różnorodność szczepów24,25.
Pomimo głównych zalet procedur qPCR i RT-qPCR w wykrywaniu wirusowego RNA w wodzie, istnieje kilka ograniczeń. Po pierwsze, zarówno zakaźne, jak i niezakaźne cząsteczki wirusa, w tym te inaktywowane przez środki dezynfekujące, mogą zostać wzmocnione przez te procedury. Wyniki badania Borchardta sugerują, że stanowi to mniejszy problem w przypadku nieoczyszczonych wód podziemnych pochodzących z warstw wodonośnych podobnych do tych w badanych zbiorowiskach niż w przypadku zdezynfekowanych wód powierzchniowych1. W przypadku wirusów hodowlanych problem ten można przezwyciężyć za pomocą PCR w połączeniu z hodowlą26,27. Problem ten został również rozwiązany w przypadku niektórych wirusów poprzez zastosowanie środków sieciujących kwasy nukleinowe28-30. To ostatnie podejście jest bardziej skuteczne w przypadku wirusów inaktywowanych przez podchloryn i nieskuteczne w przypadku wirusów inaktywowanych przez promieniowanie UV.
Drugim ograniczeniem tych procedur molekularnych jest to, że objętość zagęszczonej próbki, którą można oznaczyć, jest zazwyczaj znacznie mniejsza niż ta stosowana w procedurach hodowli6,31. Problem ten jest często rozwiązywany albo przez zastąpienie standardowego stężenia wtórnego procedurą opartą na glikolu polietylenowym za pomocą flokulacji organicznej, która pozwala na ponowne zawieszenie próbki w mniejszej objętości, albo przez dodanie trzeciorzędowego kroku stężenia próbki6,32,33. Metoda 1615 wykorzystuje ultrafiltrację odśrodkową w celu zapewnienia stężenia trzeciorzędowego. Ultrafiltracja odśrodkowa usuwa wodę i składniki o masie mniejszej niż 30 000 daltonów, co skutkuje zarówno koncentracją dowolnego wirusa w próbkach testowych, jak i zmniejszeniem inhibitorów o małej masie cząsteczkowej w testach molekularnych. Ten trzeciorzędowy krok stężenia daje ogólny współczynnik stężenia >10,5 dla każdego wirusa, który był obecny w badanej wodzie.
Trzecim ograniczeniem jest obecność inhibitorów procedur molekularnych w próbkach środowiskowych. Chociaż opracowano wiele metod usuwania inhibitorów, żadne z nich nie jest skuteczne dla wszystkich matryc wodnych i typów wirusów6,34,35, co sprawia, że niezbędne jest stosowanie wewnętrznych kontroli mających na celu oszacowanie poziomu hamowania. Odczynnik przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu G stosowany w tej metodzie spełnia ten wymóg, zapewniając stały poziom wirusowego RNA we wszystkich reakcjach oraz test RT-qPCR do oceny zahamowania. W przypadku gdy najlepsze metody usuwania inhibitorów nie są w stanie usunąć inhibicji, koncentraty próbek można rozcieńczać, o ile stężenia wirusa są wyższe niż stężenia inhibitorów14,15.
Opisana w niniejszym dokumencie procedura krzywej standardowej ma zarówno zalety, jak i poważne ograniczenia. Zaletą jest to, że zastosowany odczynnik dostarcza wszystkie niezbędne składniki w jednym odczynniku, co pozwala na użycie jednej kontroli do wszystkich testów. Ten odczynnik jest szczególnie korzystny w testach norowirusowych. Cząsteczki norowirusa można uzyskać tylko od zakażonych osób, co bardzo utrudnia uzyskanie cząstek wirusa do stosowania jako standardy. Ważniejszą zaletą jest to, że zapewnia standard RNA dla wszystkich docelowych wirusów RNA w jednym odczynniku, ponieważ posiadanie wzorca RNA jest niezbędne do dokładnej kwantyfikacji RNA36. Jednak jego zdolność do dokładnego ilościowego określenia wirusa jest ograniczona przez fakt, że efekty matrycy nie są brane pod uwagę. Oznacza to, że wartości liczby kopii genomu nie mogą być uważane za bezwzględne i powinny być rozpatrywane jedynie w kategoriach względnych. Zaleca się przygotowanie wystarczającej liczby podwielokrotności zapasu roboczego krzywej standardowej (krok 1.2) w celu pokrycia pełnych badań. Na przykład każda podwielokrotność o pojemności 250 μl dostarcza odczynnika wystarczającego na 6 płytek RT. Jeżeli wiadomo, że badanie będzie wymagało analizy 500 próbek, potrzebnych jest co najmniej 12 podwielokrotności (500 próbek/7 próbek na płytkę RT/6 płytek RT na podwielokrotność).
Metoda EPA 1615 to metoda oparta na wydajności. Wielu producentów produkuje odczynniki równoważne z tymi określonymi w niniejszym dokumencie i odczynniki te mogą być zastępowane, o ile spełnione są kryteria wydajności. Krzywa standardowa, która służy również jako dodatnia kontrola RT-qPCR, jest przydatna w rozwiązywaniu problemów z wydajnością. Wydajność może ulec pogorszeniu z powodu degradacji RNA, okresu trwałości odczynników, awarii zamrażarek, kalibracji przyrządu i błędu technicznego. Problemy z wydajnością należy podejrzewać, jeśli krzywe standardowe różnią się od krzywych pokazanych na rysunku 4 lub jeśli nie spełniają specyfikacji wydajności dla krzywych standardowych. Test RT-qPCR jest dość solidny; całkowita awaria jest prawdopodobnie spowodowana niewłaściwym obchodzeniem się z RNA lub błędem technicznym (np. brakującym odczynnikiem). Należy zachować szczególną ostrożność przy obchodzeniu się z próbkami RNA między ekstrakcją a etapem RT, aby ograniczyć degradację RNA przez rybonukleazy.
Odzysk wirusa polio z wód gruntowych i odczynników oraz odzysk mysiego norowirusa z wód gruntowych spełniły kryteria akceptacji wydajności metody EPA 1615 (Tabela 11) i są podobne do tych zgłoszonych przez innych33,37,38. Wyzdrowienia mysiego norowirusa z próbek LFB były znacznie niższe niż w przypadku wirusa polio i nie spełniałyby kryteriów akceptacji specyficznych dla wirusa polio. Przyczyny odzysku dolnego mysiego norowirusa z wody klasy odczynnikowej są nieznane. Podobnie jak w przypadku tych wyników, Karim i współpracownicy poinformowali o wyzdrowieniu z norowirusa GI.1 na poziomie 4% z wody z kranu39. Lee i wsp.37 zgłosiło średnie wyzdrowienia dla mysiego norowirusa i ludzkiego norowirusa GII.4 wynoszące odpowiednio 18% i 26% z wody destylowanej przy użyciu filtrów dyskowych. Stosując podobne warunki do Lee i współpracowników, Kim i Ko zaobserwowali wyzdrowienia na poziomie 46% i 43% odpowiednio dla tych wirusów,38. Gibbons i wsp.40 uzyskało około 100% odzysku ludzkiego norowirusa GII.4 z wody morskiej, ale Kim i Ko38 odkryli, że dodanie soli do wody destylowanej w stężeniach podobnych lub wyższych niż woda morska znacznie zmniejszyło odzysk mysiego wirusa i spowodowało około dwukrotne zmniejszenie odzysku GII.4.

Ilościowy PCR (qPCR; zobacz dodatkowe materiały dla definicji terminów użytych w tym manuskrypcie) i odwrotna transkrypcja-qPCR (RT-qPCR) są cennymi narzędziami do wykrywania i ilościowego oznaczania ludzkich wirusów jelitowych w środowisku i wodach pitnych, a zwłaszcza dla wielu wirusów, które nie replikują się lub replikują się słabo w systemach hodowli komórkowych. Oba narzędzia wykazały, że wiele typów wirusów jest obecnych w wodach środowiskowych i pitnych na całym świecie1-6. Ich zastosowanie w połączeniu z sekwencjonowaniem amplifikowanych fragmentów genomu podczas badań nad wybuchem choroby dostarczyło dowodów na przenoszenie wirusa przez wodę, ponieważ wykazały, że wirus znaleziony w wodzie pitnej jest identyczny z wirusem wydalanym przez pacjentów z epidemią7-10.
Zarówno qPCR, jak i RT-qPCR są użytecznymi narzędziami zdrowia publicznego. Na przykład dane z badań przeprowadzonych przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (EPA) wykazały silny związek między pomiarami wskaźnikowymi za pomocą qPCR a skutkami zdrowotnymi w wodach rekreacyjnych. W rezultacie, ostateczne kryteria jakości wody rekreacyjnej EPA z 2012 r. obejmują metodę qPCR do monitorowania plaż rekreacyjnych11,12. Borchardt i współpracownicy odkryli również silny związek między ostrym zapaleniem żołądka i jelit w społecznościach korzystających z nieoczyszczonych wód gruntowych a wirusem w wodach gruntowych, mierzonym za pomocą RT-qPCR1.
Celem tego artykułu jest opisanie składnika testu molekularnego metody EPA 161513,14. W teście tym wykorzystuje się RT-qPCR w celu ilościowego oszacowania kopii genomowych enterowirusa i norowirusa (GC) na litr w oparciu o pierwotną objętość wody środowiskowej lub pitnej przepuszczonej przez filtr elektrododatni. Przegląd procedury molekularnej przedstawiono na rysunku 1. Sekcja 1 protokołu szczegółowo opisuje procedury przygotowania krzywej standardowej. Wzorce te przygotowuje się z odczynnika, który zawiera kopię RNA sekwencji docelowej dla wszystkich zestawów starter/sonda. W sekcji 2 opisano procedurę koncentracji trzeciorzędowej. Sekcja 3 przedstawia procedurę ekstrakcji RNA ze stężonej wody i próbek kontrolnych. RNA z każdej badanej próbki jest transkrybowane wstecznie przy użyciu potrójnych testów i losowych starterów w celu zapoczątkowania transkrypcji (sekcja 4). CDNA z każdej reakcji odwrotnej transkrypcji jest dzielone na pięć oddzielnych testów specyficznych dla wirusa, które są analizowane w trzech egzemplarzach za pomocą qPCR (sekcja 5; Rysunek 2). W teście wykorzystuje się startery i sondy z literatury naukowej (Tabela 1), które są przeznaczone do wykrywania wielu enterowirusów i norowirusów oraz odczynnika zawierającego RNA wirusa zapalenia wątroby typu G w celu identyfikacji próbek testowych, które hamują RT-qPCR15.

<table><tbody><tr><td>Komora na probówkę 1,5 ml</td><td>Diversified Biotech</td><td>-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg; C chłodna cegła</td><td>Zróżnicowana biotechnologia</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor PCR II i 25-mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Musi to być ręczna zamrażarka do rozmrażania-70</td></tr> <tr><td>& deg; C lub chłodniejsza zamrażarka</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td> 96-dołkowa <td></td></tr><tr><td>komora</td><td>Zróżnicowana Biotechnologia</td><td>-1000</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Opancerzone RNA EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td>Służy do ilościowego oznaczania testu RT-qPCR</td></tr><tr><td>Opancerzony wirus zapalenia wątroby typu G RNA</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Steris</td> Seria <td></td><td>Amsco Lab</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Zaopatrzenie w sprzęt laboratoryjny NuAir</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Bufor krystaliczny lub lepszy</td></tr><tr><td>AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>Bufor do rozcieńczania nośnego RNA</td></tr><tr><td>Bufor AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Ekstrakcja bufor</td></tr><tr><td>Nośnik RNA</td><td>Qiagen</td><td>Nie dotyczy</td><td>Użyj nośnika RNA dostarczany z buforem AVL</td></tr><tr><td>Butelki wirówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 lub 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Wirniki wirówek</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Fajny sejf</td><td>Zróżnicowana biotechnologia</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>Sondy LightCycler&reg; 480 Zestaw Master</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Używaj probówek bez rybonukleazy i dezoksyrybonukleazy z zatrzaskami</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Folia Microseal "A"</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSA5001</td><td>Heat odporna</td></tr><tr><td>folia "F"</td><td>Microseal Bio-Rad</td><td>Laboratories MSA1001</td><td>Odporny na zamrażanie</td></tr><tr><td>Mini talerzyk</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Komora wielorurkowa</td><td>Zróżnicowana biotechnologia</td><td>-5000</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna płytka reakcyjna</td><td>Technologie życia</td><td></td><td></td>4314320</tr><tr><td>Mieszanka nukleotydów PCR</td><td>Płytka PCR Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy PCR</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik płytkowy</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex żelatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Zawiera AW1 (bufor do pierwszego płukania), AW2 (bufor do drugiego płukania), AE (bufor elucyjny); przed użyciem do AW1 i AW2 należy dodać etanol; Nie używać buforu AL dostarczonego z zestawem</td></tr><tr><td>Ilościowy termocykler PCR</td><td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Losowy starter</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Reservoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Promega</td><td>N2515 lub N2615</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik referencyjny ROX</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II lub III Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 lub 18080044</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trisma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Koncentratory odśrodkowe Vivaspin 20</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda epa 1615. pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i rt-qpcr. część iii. wykrywanie wirusów za pomocą rt-qpcr

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Metoda EPA 1615 mierzy enterowirusy i norowirusy obecne w środowisku i wodach pitnych. Metoda ta została opracowana w celu uzyskania znormalizowanej metody do stosowania w wielu laboratoriach analitycznych podczas okresu monitorowania 3 Reguły Monitorowania Zanieczyszczeń Nieregulowanych. W niniejszym artykule przedstawiono protokół ekstrakcji wirusowego kwasu rybonukleinowego (RNA) z koncentratów próbek wody oraz ilościowego pomiaru stężeń enterowirusów i norowirusów metodą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR (RT-qPCR). Stężenia wirusa w teście molekularnym są obliczane w postaci kopii genomowych wirusowego RNA na litr w oparciu o krzywą standardową. Metoda wykorzystuje szereg kontroli jakości w celu poprawy jakości danych oraz zmniejszenia zmienności międzylaboratoryjnej i wewnątrzlaboratoryjnej. Metoda została oceniona poprzez zbadanie odzyskiwania wirusa z wód gruntowych i odczynników obsianych wirusem polio typu 3 i mysim norowirusem jako substytutem ludzkich norowirusów. Średnia liczba wyzdrowień po zakażeniu wirusem polio wyniosła 20% w wodach gruntowych i 44% w wodzie z odczynnikami. Średni odzysk mysiego norowirusa za pomocą testu RT-qPCR wynosił 30% w wodach gruntowych i 4% w wodzie klasy odczynnikowej.

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar stężenia enterowirusów i norowirusów w wodzie z wykorzystaniem ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją. Jest to realizowane poprzez trójetapowe zagęszczanie cząstek wirusów z próbek wody przy użyciu ultrafiltracji odśrodkowej. Następnie, zgodnie z opisem w protokole, przygotowywane są odczynniki do krzywej standardowej. Kolejnym krokiem jest ekstrakcja kwasów nukleinowych z koncentratów wirusowych oraz z krzywej standardowej. Następnie viralne RNA w rozcieńczeniach od 1:5 do 1:25 poddawane jest odwrotnej transkrypcji z użyciem randomowych starterów oraz odwrotnej transkryptazy. Na koniec przeprowadzana jest amplifikacja wirusowego cDNA z wykorzystaniem specyficznych dla wirusów starterów i sond w termocyklerze do PCR w czasie rzeczywistym, a następnie obliczane są liczby kopii genomowych w próbkach na podstawie krzywej standardowej.Główną zaletą metody EPA 1615 w porównaniu do innych ustandaryzowanych metod, takich jak ISO 15216, jest fakt, że została ona opracowana specjalnie dla próbek wody i obejmuje analizę enterowirusów. Metoda ta dostarcza osobom oceniającym ryzyko w dziedzinie mikrobiologii środowiskowej aktualnych możliwości określania ryzyka związanego z obecnością wirusów w wodzie pitnej i wodach rekreacyjnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z wbudowaną w nią standaryzacją. Procedura jest bardzo szczegółowa i musi być ściśle przestrzegana. Wizualna demonstracja metody jest kluczowa, ponieważ nawet niewielkie odstępstwa od niej mogą prowadzić do negatywnych skutków. Procedurę prezentują dziś Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin oraz ja, Shay Fout. Wszyscy jesteśmy członkami personelu zawodowego krajowego laboratorium badań narażenia EPA w Cincinnati w Ohio.Po przygotowaniu krzywej wzorcowej zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj koncentrator odśrodkowy dla każdej pobranej próbki, dodając co najmniej 10 milliliters 1X PBS oraz 2% BSA do górnej komory na próbkę. Po inkubacji przez noc, przemyciu, a następnie dodaniu próbek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, odwiruj każdą próbkę testową w rotorze z koszyczkami wahadłowymi przy 3000 do 6000 ×g i czterech stopniach Celsius za dwadzieścia do trzydzieści minut.Po odpowiednim zagęszczeniu próbki i przeniesieniu jej do nowej probówki do mikrocentryfugi, należy dodać bufor fosforanowy sodu o stężeniu 0,15 M, aby dostosować objętość końcową do 400 µL ± 2 µL. W celu ekstrakcji kwasów nukleinowych, do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi należy dodać 200 µL buforu do ekstrakcji dla ujemnej kontroli ekstrakcji oraz 200 µL koncentratu trzeciorzędowego dla każdej próbki testowej lub rozcieńczenia krzywej wzorcowej, a następnie przeprowadzić ekstrakcję RNA zgodnie z modyfikacjami opisanymi w protokole tekstowym w instrukcji producenta zestawu do ekstrakcji. Po przygotowaniu starterów i sond zgodnie z protokołem, należy przygotować mieszaniny master-mix do odwrotnej transkrypcji numer jeden i dwa w pomieszczeniu czystym, jak pokazano tutaj.Używając pipety wielokanałowej, przenieś 16,5 µL RT master mix one do dołków każdej płytki PCR. Następnie, za pomocą buforu elucyjnego z zestawu do ekstrakcji kwasów nukleinowych zawierającego 400 units/mL inhibitora RNazy, rozcieńcz rozmrożoną macierz próbek wzbogaconych terenowo i laboratoryjnie lub próbki LSFM w stosunku 1:5 oraz 1:25. Przenieś 6,7 µL kwasów nukleinowych z każdej próbki testowej, kontroli i krzywej wzorcowej do oddzielnych dołków płytki PCR, stosując trzy powtórzenia dla próbek testowych i kontroli oraz dwa powtórzenia dla krzywych wzorcowych.Do studzienek kontroli bez matrycy (NTC) należy dodać 6,7 µL buforu elucyjnego. Na każdą płytkę RT należy zaplanować od dwóch do ośmiu NTC, stosując dwie dla pierwszej próbki, a następnie dwie lub więcej dla każdej kolejnej czwartej próbki, rozmieszczając kontrole negatywne w całej płytce. Płytkę PCR należy zamknąć za pomocą odpornej na temperaturę folii uszczelniającej, upewniając się, że każda studzienka jest szczelnie zamknięta. Następnie próbki należy mieszać przez pięć do dziesięciu sekund, a potem krótko odwirować przy przyspieszeniu większym lub równym 500 ×g. W termocyklerze inkubuj płytkę w temperaturze 99°C przez cztery minuty. Schłodź płytkę do 4°C, a następnie krótko odwiruj ją po raz drugi. Następnie ostrożnie usuń folię uszczelniającą płytkę i dodaj 16,8 µL mieszaniny RT master mix two do każdego dołka. Po uszczelnieniu płytki, krótkim wymieszaniu i odwirowaniu, umieść ją w termocyklerze i przeprowadź program: 25°C przez 15 minut, następnie 42°C przez 60 minut, 99°C przez pięć minut, a na koniec utrzymuj w temperaturze 4°C do ośmiu godzin lub przechowuj próbki w temperaturze -70°C przez dłuższy czas.W pomieszczeniu czystym przygotować mieszaniny master mix do ilościowej PCR, korzystając z instrukcji dla enterowirusa, norowirusa genogrupy pierwszej, norowirusa genogrupy drugiej oraz wirusa zapalenia wątroby G. Każdy master mix wymieszać i krótko odwirować. Następnie, zgodnie z przedstawionym przykładem, nanieść 14 µL mieszanin master mix do odpowiednich dołków opisanej optycznej płytki reakcyjnej, używając osobnych płytek dla każdego testu qPCR. Do odpowiednich dołków nanieść po 6 µL właściwego cDNA. Następnie próbki wymieszać i krótko odwirować.Skonfiguruj oprogramowanie termocyklera zgodnie z opisem w protokole i przeprowadź test qPCR dla wirusa zapalenia wątroby G na nieusuwanych i rozcieńczonych próbkach matrycy wzbogaconej w terenie i w laboratorium (LFSM) przed wykonaniem wszystkich pozostałych testów qPCR. Porównaj średnią wartość Cq każdej próbki ze średnią wartością Cq dla wirusa zapalenia wątroby G, określoną wcześniej dla każdej nowej partii odczynników do wykrywania wirusa zapalenia wątroby G. W przypadku testów qPCR dla enterowirusów i norowirusów zastosuj najniższe rozcieńczenie próbki terenowej lub LDF, dla którego wartość Cq jest mniejsza niż o jedną jednostkę Cq większa od średniej wartości Cq dla wirusa zapalenia wątroby G.Skonfiguruj oprogramowanie termocyklera do ilościowej PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Oznacz próbki do krzywej wzorcowej jako standardy, a dla każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej wprowadź wyświetlone tutaj wartości kopii genomowych. Inkubuj płytkę w temperaturze 95°C przez dziesięć minut, a następnie przeprowadź 45 cykli obejmujących 90°C przez 15 sekund i 60°C przez jedną minutę.Należy określić, czy każda krzywa wzorcowa spełnia dopuszczalne wartości podane w tej tabeli. Po obliczeniu odchylenia standardowego, nachylenia, współczynnika R kwadrat oraz procentowej wydajności zgodnie z równaniami w protokole tekstowym, należy zapisać wartości liczby kopii genomowych lub GC obliczone przez oprogramowanie termocyklera dla wszystkich próbek badanych na podstawie krzywych wzorcowych spełniających kryteria określone w tej tabeli oraz średnie wartości GC dla każdej próbki. Należy wyznaczyć liczbę GC na litr dla każdej próbki badanej, korzystając z następującego równania, w którym GC oznacza właśnie obliczoną średnią liczbę kopii genomowych.Współczynnik 199 stanowi całkowity czynnik rozcieńczenia dla reakcji objętościowych, które miały miejsce podczas trzecich etapów koncentracji, ekstrakcji RNA oraz RT-qPCR. DF to czynnik rozcieńczenia kompensujący inhibicję, a D to objętość analizowanej pierwotnej próbki wody wyrażona w litrach.Na koniec oblicz całkowitą wartość GC dla próbek ślepych wzbogaconych w laboratorium (LFB) oraz próbek ślepych odczynników laboratoryjnych (LRB), mnożąc wcześniej wyznaczoną średnią wartość GC przez 199 i dzieląc przez 0,3. Ogólny odzysk wirusa określono przy użyciu sparowanych próbek wód gruntowych LFSM z łącznie siedmiu zestawów próbek pobranych z trzech publicznych oczyszczalni ścieków oraz z jednej prywatnej studni. Poziomy inokulum dla próbek LSFM wynosiły trzy miliony MPN poliwirusa typu 3 oraz pięć milionów PFU mysiego norowirusa.Norowirus mysi został wykorzystany do wstępnej oceny w jednym laboratorium metody EPA 1615, ponieważ w tym czasie odczynnik do krzywej wzorcowej nie był dostępny. W przypadku próbek wód gruntowych średni odzysk poliovirusa wyniósł 20% przy błędzie standardowym 2%, natomiast średni odzysk norowirusa mysiego wyniósł 30% przy błędzie standardowym 3%. W regularnych próbkach wód gruntowych pobranych z terenu dla każdego LFSM nie wykryto enterowirusów ani norowirusów. Próbki wzbogaconej próbki ślepej laboratoryjnej (LFB) oraz ślepej próbki odczynnika laboratoryjnego (LRB) mierzono przy użyciu wody klasy odczynnikowej z dodatkiem wirusa oraz bez niego.Odzysk polowirusa wyniósł średnio 44% przy błędzie standardowym 1%, natomiast odzysk mysiego norowirusa wyniósł średnio 4% przy błędzie standardowym 0,5%. Ten rysunek przedstawia typowe krzywe wzorcowe dla enterowirusa oraz norowirusa z genogrupy dwa. Krzywa norowirusa z genogrupy dwa spełnia kryteria krzywej wzorcowej z wartością R kwadrat wynoszącą 0,9987, całkowitym odchyleniem standardowym 0,14 i wydajnością 101%. Krzywa enterowirusa spełnia kryteria wydajności krzywej wzorcowej z wartością R kwadrat 0,9874, całkowitym odchyleniem standardowym 0,58 i wydajnością 103%, jednak charakteryzuje się około 100-krotnie mniejszą czułością, a tym samym wyższym limitem detekcji niż krzywe norowirusa.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zagęszczać i wykrywać enterowirusy oraz norowirusy obecne w wodzie przy użyciu techniki RT-qPCR. Po opanowaniu tej metody, proces ten można przeprowadzić w około osiem godzin w przypadku próbek o niskiej mętności. Próbki o wyższej mętności mogą wymagać dodatkowego czasu, szczególnie na etapie trzeciego zagęszczania.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zabezpieczenie próbek przed kontaminacją RNazami przed odwrotną transkrypcją. Należy pamiętać, że PCR jest techniką bardzo potężną i użyteczną. W celu zminimalizowania wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych konieczne jest zastosowanie środków ostrożności, takich jak rozdzielenie stanowisk pracy oraz użycie odpowiednich kontroli.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Metoda EPA 1615. Ocena występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie metodą hodowlania i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów metodą RT-qPCR

Opisano jednokrokowy test RT-PCR do detekcji i identyfikacji genogrup izolatów norowirusa z kałków dziecięcych, wykorzystujący primery i sondy TaqMan specyficzne dla regionu złącza otwartej ramki odczytu 1 (ORF1)-ORF2, który jest najbardziej konserwatywnym regionem genomu norowirusa. Szczegółowo przedstawiono niekomercyjną, kosztowo efektywną metodę ekstrakcji RNA.

Wykrywanie i genogrupowanie norowirusów z kału dzieci za pomocą jednoetapowej reakcji RT-PCR TaqMan

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Metodologia pobierania próbek oparta na makropianie została opracowana i oceniona pod kątem wykrywania i kwantyfikacji norowirusa na twardych powierzchniach środowiskowych.

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Produkcja wody odpływowej (PBW) została potraktowana nanocząstkami tlenku miedzi (CuO-NPs) i oceniono toksyczność komórkową w hodowanych komórkach ludzkich. Celem tego protokołu było zintegrowanie rodzimej próbki środowiskowej z formatem hodowli komórkowej oceniającym zmiany toksyczności spowodowane traktowaniem CuO-NP.

Usuwanie pierwiastków śladowych przez nanocząstki tlenku miedzi z wody upustowej z odzysku uranu in situ i jej wpływ na żywotność komórek

Wprowadzamy VacuSIP, prostą, nieinwazyjną i niezawodną metodę czystego i dokładnego punktowego pobierania próbek wody. System został opracowany i oceniony pod kątem jednoczesnego zbierania wody wdychanej i wydychanej przez dozowniki zawiesiny bentosowej in situ, w celu czystego pomiaru usuwania i wydalania cząstek stałych i rozpuszczonych związków.

VacuSIP, ulepszona metoda InEx do pomiaru in situ cząstek stałych i rozpuszczonych związków przetwarzanych przez aktywne podajniki zawiesiny

Ten protokół diagnozuje wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii za pomocą metodologii RT-PCR. Cała metoda jest opisana od rozwarstwienia tkanek do całkowitej ekstrakcji RNA, a następnie syntezy cDNA i wykrywania TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR przy użyciu dsDNA wiążącego fluorescencyjny barwnik wiążący.

Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

Projekt mikrodziałki do badań nad znacznikiem 15N jest opisany tak, aby pomieścić wiele wydarzeń związanych z pobieraniem próbek roślin i gleby w sezonie. Przedstawiono procedury pobierania i przetwarzania próbek gleby i roślin, w tym protokoły mielenia i ważenia, dla analizy 15N.

Projektowanie mikrowykresów oraz przygotowanie próbek roślin i gleby do analizy 15azotu

Poznaj metodę EPA 1615 do wykrywania enterowirusów i norowirusów w wodzie pitnej i środowiskowej za pomocą RT-qPCR. Technika ta zapewnia niezawodną ilościową ocenę wirusów dla celów ochrony zdrowia publicznego.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR (Wideo) | JoVE Journal

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Przeglądaj więcej filmów