Name: Wykrywanie celów miRNA w trybie wysokoprzepustowym za pomocą testu 3LIFE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Poznaj metodę 3'LIFE do wykrywania celów miRNA w regionach 3'UTR przy użyciu testu lucyferazowego w komórkach HEK293. Ta technika umożliwia badaczom efektywną analizę setek interakcji regulacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Stephenowi Blazie, Karen Anderson, Joshowi LaBaerowi za rady i dyskusję. Karen Anderson, Johnowi Chaputowi i Joshowi LaBaerowi za udostępnienie odczynników i oprzyrządowania, Michaelowi Gaskinowi i Andrei Throop za porady techniczne i protokoły. Justin Wolter jest stypendystą Mahera i dziękuje rodzinie Maher za hojne wsparcie.

1. Hodowla komórkowa (24-48 godzin przed transfekcją)
<ol>
	<li>24-48 godzin przed transfekcją wysiewać wystarczającą ilość komórek HEK293T w oparciu o liczbę transfekowanych płytek 96-dołkowych. 
	UWAGA: Aby zapewnić spójne transfekcje, płytki komórkowe o wystarczającej gęstości, aby sprzyjać szybkiemu podziałowi, ale nie powinny być przy zbiegu większym niż 70-90% w momencie transfekcji.</li>
	<li>Każda 96-dołkowa płytka wymaga 9 x 106 komórek (75 000 komórek na dołek i 120 dołków na płytkę, aby uwzględnić użycie pipety zbiornikowej i wielokanałowej). Oblicz czas podwojenia komórek HEK293 (zwykle ~ 20 godzin) i zasiej odpowiednią liczbę komórek, aby uzyskać co najmniej 9 x 106 komórek w momencie transfekcji. Okrągła płytka hodowlana o średnicy 145 mm jest zwykle wystarczająca do 3 96-dołkowych transfekcji, gdy rośnie do ~90% zbieżności, z ~10% komórek pozostałych do ponownego zasiewu nowej płytki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie przed transfekcją
UWAGA: Przygotowanie i plazmidowego DNA w kroku 2.0-2.2 powinno być wykonane w dniach poprzedzających transfekcję, ponieważ przygotowanie tych odczynników może być czasochłonne.
<ol>
	<li>Ludzkie klony 3'UTR, które są kompatybilne z testem 3'LIFE, są dostępne w publicznym repozytorium plazmidów 30. Oczyszczanie plazmidu DNA ręcznie lub za pomocą robotów do obsługi cieczy. Użyj 96-dołkowego zestawu do mini-przygotowania do lizy alkalicznej klasy transfekcyjnej i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesić oczyszczone wektory do ~100 ng/μl na studzienkę. 
	UWAGA: Niewystarczający sygnał lucyferazy nastąpi, jeśli stężenie plazmidu spadnie poniżej 40 ng / μl.</li>
	<li>Uzyskaj wektory pLIFE-miRNA 30 lub sklonuj je za pomocą potoku na rysunku 1B 24. Zawiesić wektory w stężeniu 500 ng / μl dla każdego miRNA i ślepych plazmidów kontrolnych.</li>
	<li>Ze względu na czułość warunków bufora nukleofekcji należy zapewnić, aby całkowita objętość transfekowanych materiałów (w tym komórek i plazmidów) nie przekraczała 10% całkowitej cieczy w każdym dołku 96-dołkowej płytki transfekcyjnej. Aby to osiągnąć, należy skoncentrować zapas plazmidu pLIFE-miRNA w stężeniu co najmniej 500 ng/μl.</li>
	<li>Przygotuj 10 odczynników buforowych lucyferazy świetlika (Tabela 1) i 1 odczynniki buforowe lucyferazy Renilla (Tabela 2), które można przechowywać do 6 miesięcy. 
	UWAGA: Naziemna terapia o unikaniu podwójnego użytku w buforze lucyferazy świetlików musi być przechowywana w roztworze w temperaturze -20 oC w jednorazowych podwielokrotnościach.</li>
</ol>
3. Przygotuj następujące elementy bezpośrednio przed transfekcją
<ol>
	<li>Przygotować bufor do transfekcji zawierający PBS, 1,5% HEPES, pH 7,0. Przygotuj to świeże, chociaż może być przechowywane do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C bez zauważalnego spadku wydajności transfekcji. Formułując objętości DNA buforu i plazmidu, należy założyć 120 reakcji na każdą 96-dołkową płytkę, aby w wystarczającym stopniu uwzględnić błędy w pipetowaniu i utracone objętości przy użyciu zbiorników cieczy i pipet wielokanałowych. Podwielokrotność 18 μl na bufor transfekcyjny dołka (120 dołków/płytka 96-dołkowa = 2,16 ml na płytkę) i odstawić. 
	UWAGA: Urządzenie do elektroporacji ogniw jest niezwykle wrażliwe na warunki buforowe używane do transfekcji komórek. Precyzja podczas przygotowywania zapewni stałą wydajność sprzętu. Podczas wykonywania testu należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec parowaniu, w szczególności poprzez zminimalizowanie czasu, w którym bufor pozostaje odkryty w probówkach do mikrowirówek, płytkach 96-dołkowych, zbiornikach i płytkach elektrodowych.</li>
	<li>Zarezerwuj cztery studzienki dla następujących kontroli, bez pLIFE-3'UTR (do pomiaru tła testu lucyferazy), pLIFE-SV40 3'UTR (kontrola celu ujemnego), kontrola pozytywna dla miRNA #1, kontrola pozytywna dla miRNA #2, 
	UWAGA: Te wektory są publicznie dostępne 30. Alternatywnie, każdy wcześniej zwalidowany cel może być wykorzystany jako kontrola pozytywna.</li>
	<li>Ciepłe podłoże, trypsyna (0,25%) do 37 °C.</li>
	<li>Do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej dodać 200 μl DMEM uzupełnionego 10% FBS, 1% Pen/Strep i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C do użycia po transfekcji.</li>
	<li>Włącz wszystkie urządzenia do elektroporacji ogniw, a następnie oprogramowanie pomocnicze. Użyj kodu impulsu FF120 dla komórek HEK293T i bufora PBS/HEPES.</li>
</ol>
4. Przygotowanie plazmidowego DNA i mieszaniny komórek
UWAGA: Poniższy protokół zakłada transfekcję trzech 96-dołkowych płytek w jednym eksperymencie dla ekranu z dwoma miRNA (miRNA-#1 i miRNA-#2). Każda płytka będzie odpowiadać tej samej 96-dołkowej płytce plazmidów pLIFE-3'UTR i będzie trzykrotnie traktowana pLIFE-miRNA-ślepą próbą, pLIFE-miRNA-#1 lub pLIFE-miRNA-#2.
<ol>
	<li>Przygotuj 3 zapasy buforu pLIFE-miRNA + transfekcji dla każdego miRNA. Stado to powinno stanowić 50% (10 μl) całkowitej objętości każdego dołka, pomnożone przez 120 dołków. Tak więc każdy zapas powinien zawierać 1,08 ml buforu + 120 μl plazmidowego DNA (pLIFE-miRNA).</li>
	<li>Usunąć komórki z płytki hodowlanej o średnicy 145 mm poprzez elucję pożywki, delikatne przemycie PBS i potraktowanie ~5 ml 0,25% trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zneutralizować trypsynę równą objętością pożywki i komórki osadu przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usuń trypsynę/pożywkę i ponownie zawieś osad w pożywce ~ 5-10 ml (w zależności od gęstości komórek i dokładnego zakresu licznika komórek).</li>
	<li>Zliczanie komórek za pomocą licznika komórek. Upewnij się, że ogniwa są >95% żywotne i znajdują się w dokładnym zasięgu maszyny. 
	UWAGA: Niedokładna liczba komórek może wynikać z bardzo wysokich stężeń komórek (>6,0x 10>6/ml). Transfekcja zbyt wielu komórek może drastycznie zmniejszyć skuteczność celowania w miRNA poprzez zmniejszenie stosunku plazmidu do komórki i/lub zmniejszenie wydajności transfekcji.</li>
	<li>Podwielokrotność trzech probówek, z których każda zawiera 9 x 106 komórek, odpowiadających komórkom wymaganym do transfekcji jednej płytki 96-dołkowej. Wiruj komórki przy 300 x g przez 3 min.</li>
	<li>Usuń nośnik. Pamiętaj, aby usunąć jak najwięcej mediów przy minimalnym zakłóceniu granulki, ponieważ nadmiar nośnika może wpłynąć na wydajność transfekcji.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1,2 ml mieszaniny buforu do transfekcji/plazmidu miRNA i odstawić na bok.</li>
	<li>Poniższe kroki szczegółowo opisują ponowne zawieszenie plazmidu pLIFE-3'UTR w buforze transfekcyjnym. Ponieważ dzieje się to w płytkach 96-dołkowych, należy uważać, aby uniknąć parowania buforu, zakrywając płytki przez cały czas.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 32,4 μl buforu transfekcyjnego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR (9 μl [na transfekcję] * 3 [płytki] * 1,2 [w celu uwzględnienia błędu pipety]).</li>
		<li>Dodaj 3,6 μl (~100 ng/μl) mini-przygotowanego plazmidu pLIFE-3'UTR do każdej studzienki i dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Odpipetować 10 μl tej mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki transfekcyjnej i pokrywy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Transfekcja
<ol>
	<li>Przenieść 1,2 ml pierwszej mieszaniny plazmidu komórka/bufor/plazmid pLIFE-miRNA do zbiornika. Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Dodać 10 μl tej mieszaniny do pierwszej 96-dołkowej płytki transfekcyjnej, która zawiera już 10 μl buforu transfekcyjnego/pLIFE-3'UTR. Dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. 
	UWAGA: Równe zawieszenie ogniw w buforze zapewni równomierne i dokładne przejście prądu elektrycznego przez kuwetę i zmaksymalizuje wydajność transfekcji.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę transfekcyjną na urządzeniu do elektroporacji ogniw i rozpocznij transfekcję.</li>
	<li>Po zakończeniu transfekcji dodać 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki z 96-dołkowej płytki hodowlanej do każdego dołka 96-dołkowej płytki transfekcyjnej i dobrze wymieszać. Przenieść 100 μl z każdej studzienki do 96-dołkowej płytki hodowlanej.</li>
	<li>Wymieszaj komórki na płytce hodowlanej z pipetą umieszczoną pionowo na środku dołka, ponieważ komórki będą miały tendencję do agregacji po bokach dołka, chyba że zostaną odpowiednio wymieszane.</li>
	<li>Powtórzyć czynności 5,1-5,5 dla pozostałych dwóch płytek.</li>
	<li>Czyszczenie 96-dołkowej płytki transfekcyjnej
	<ol>
		<li>96-dołkowe płytki transfekcyjne można poddać recyklingowi poprzez mycie 70% EtOH, aby zapewnić brak przenoszenia kwasów nukleinowych między eksperymentami. Wykonaj dwa płukania 70% EtOH za pomocą butelki z rozpylaczem, aby całkowicie napełnić każdą studzienkę, a następnie wycieraj nadmiar EtOH na paskach elektrod (dolna strona) i pozwól płytkom transfekcyjnym całkowicie wyschnąć w kapturze hodowlanym. 
		UWAGA: Przetestowaliśmy zanieczyszczenie przenoszonym DNA poprzez transfekcję 12 dołków z 2 μg plazmidu pmaxGFP każdy do HEK293T komórek, a następnie pojedyncze płukanie 70% EtOH i drugą transfekcję bez plazmidowego DNA. Przy tym ekstremalnie wysokim stężeniu plazmidu, niezwykle jasnym reporterze i pojedynczym płukaniu, nie było obserwowalnej fluorescencji w żadnej z 12 powtórzonych transfekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórek przez 48-72 godzin w temperaturze 37 °C, a następnie podwójny test lucyferazy.</li>
</ol>
6. Przygotowanie lizatu komórkowego do testu lucyferazy
<ol>
	<li>Rozcieńczony bufor do lizy z 4 częściami wody, 1 częścią 5x pasywny bufor do lizy w zbiorniku. Oblicz 26 μl/studzienkę, dodając ~20 dodatkowych objętości, aby uwzględnić straty w zbiorniku. 
	UWAGA: Bufor jest przechowywany w temperaturze -20 ºC i może być bardzo lepki, dlatego przed dopuszczeniem buforu 5x do temperatury pokojowej poprawi się dokładność pipetowania.</li>
	<li>Przeanalizuj każdy studzienek pod kątem wydajności transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Zwróć uwagę na wszelkie niespójności w studniach, które nie transfekowały skutecznie (>90% wydajności transfekcji) lub wyrażają niskie poziomy zapytania ofertowego wskazujące na przepełnienie lub wyczerpanie mediów. Usuń te studzienki z analizy.</li>
	<li>Całkowicie usuń pożywkę z komórek, uważając, aby nie wymyć zbyt szybko, co spowoduje oderwanie się komórek. 
	UWAGA: Pozostałe pożywki rozcieńczą lizat i spowodują wahania wartości w różnych eksperymentach.</li>
	<li>Dodaj 26 μl buforu do lizy do każdej studzienki i umieść na wytrząsarce płytkowej/kołysce z niską/umiarkowaną prędkością na ~20-30 min. Wykorzystaj ten czas na przygotowanie lucyferazy, umycie i zalanie luminometru (luminometrów) i przeniesienie lizatu na nieprzezroczyste płytki pomiarowe.</li>
</ol>
7. Test podwójnej lucyferazy
UWAGA: Jeśli wiele płytek jest mierzonych sekwencyjnie na jednym luminometrze, utwórz główne mieszanki buforowe ze wszystkim oprócz ATP i substratów, dodając te odczynniki, a następnie dostosowując pH bezpośrednio przed użyciem z każdą płytką. ATP i podłoża mogą z czasem ulec degradacji; Spójność czasu, przez jaki te odczynniki znajdują się w buforze, poprawi spójność na wielu płytkach.
<ol>
	<li>Przygotuj 1x lucyferazy (Tabela 1):
	<ol>
		<li>Owinąć dwie probówki (zwykle probówki wirówkowe o pojemności 15/50 ml) zawierające świetlika i Renilla folią aluminiową, ponieważ podłoża mogą być wrażliwe na światło.</li>
		<li>Przygotuj 1x bufor lucyferazy świetlika. Dodać 1 ml każdego z pięciu 10x odczynników lucyferazy świetlika, dodając EGTA na końcu, do 5 ml H20 do końcowego stężenia 1x.
		<ol>
			<li>Dodaj 0,025 g ATP do 10 ml 1x bufor świetlika. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając. Utrzymuj ATP na lodzie przez cały czas. ATP ulegnie degradacji, więc jeśli sekwencyjnie mierzy się więcej niż jedną płytkę, bufor musi być tworzony od nowa, zaczynając od tego kroku dla każdej dodatkowej płytki.</li>
			<li>Dodać 100 μl lucyferyny 100 chrząszczy (substrat) (Tabela 1) Bufor powinien zmienić kolor na żółtawy w zależności od pH.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>1x Rekonstytucja buforu lucyferazy Renilla: Na płytkę 96-dołkową, podwielokrotność 10 ml 1 "Bufor Renilla".
		<ol>
			<li>Dodać 100 μl BSA (44 mg/ml bulionu).</li>
			<li>W przypadku przesiewania więcej niż jednej płytki, rozdzielić mieszankę wzorcową na 10 ml podwielokrotności.</li>
			<li>Dodać 100 μl celelenterazyny do buforu (uprzednio porcjowanego i przechowywanego przy 100-krotnym stężeniu)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dostosuj pH 1x buforu świetlika do 8,0, a następnie 1x buforu Renilla do 5,0 za pomocą NaOH i HCl. 
		UWAGA: Aktywność każdego buforu i zdolność buforu Renilla do wygaszania aktywności lucyferazy świetlików jest w dużym stopniu zależna od pH. Aby uzyskać spójne wyniki, bądź niezwykle dokładny na tym etapie.</li>
		<li>Doprowadzić objętość każdego buforu (odpowiadającą 1 płytce 96-dołkowej) do 10,5 ml w celu uwzględnienia gruntowania luminometrem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś lizat na nieprzezroczyste białe płytki: W tym momencie komórki powinny znajdować się w buforze do lizy przez ~ 20 minut. Pobrać 25 μl z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej, należy dokładnie pipetować w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek i homogenizować lizat.</li>
	<li>Przygotuj luminometr. Włącz luminometr i wybierz protokół w folderze DLR o nazwie "DLR z dwoma wstrzyknięciami". Inne formaty nie są zgodne z potokiem analizy danych (poniżej).
	<ol>
		<li>Wybierz studnie, które mają być testowane (wszystkie studzienki to wartość domyślna).</li>
		<li>Rozszerz ustawienie "Opóźnienie przed pomiarem" do 5 sekund, z czasem pomiaru 10 sekund (wyjaśnienie znajduje się w 29).</li>
		<li>Etapy mycia kapilary: woda 3x, EtOH 3x, woda 3x, suszenie 3x. Zalać raz do odpadów, a następnie zalać po raz drugi z powrotem do probówek buforowych, aby zapewnić mieszanie. Najpierw wstrzyknij bufor świetlika i zalej go w lewej kapilarze, a następnie Renilla w prawej kapilarze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainicjuj test lucyferazy. Przeczytanie każdej płyty powinno zająć ~48 minut. Po zakończeniu najpierw zapisz plik, a następnie powtórz kroki mycia i wyłącz luminometr. 
	UWAGA: Można odczytać wiele płyt, a dane przechowywać w tym samym pliku Excel, jednak mogą wystąpić problemy z wieloma odczytami płyt, w których program luminometru ulegnie awarii. Pamiętaj, aby zapisać wszystkie dane między pomiarami i zrobić zrzuty ekranu, jeśli program ulegnie awarii, zanim możliwe będzie zapisanie.
	<ol>
		<li>Wymień stare na nowe, pamiętając, aby zalać co najmniej dwa razy nowymi przed uruchomieniem nowej płytki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Skorzystaj z tabel Excela "3'LIFE - analiza pojedynczej płytki" i "3'LIFE - analiza wielopłytkowa" dostępnych pod adresem <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a>. Skopiuj surowe dane do pomiarów lucyferazy świetlika i Renilla z pliku wyjściowego luminometru do lokalizacji odpowiadających warunkom ujemnym, miRNA #1 i miRNA #2 do arkusza kalkulacyjnego "3'LIFE – analiza pojedynczej płytki".</li>
	<li>Arkusz kalkulacyjny automatycznie obliczy stosunek świetlika do Renilli i znormalizuje każde miRNA do odpowiedniej kontroli negatywnej oraz znormalizuje wartości represji na każdej płytce. 
	UWAGA: Ten arkusz kalkulacyjny automatycznie zidentyfikuje studnie o niskim sygnale lucyferazy, podświetli znacznie stłumione studnie i zapewni miary represji na całej płycie. Szczegółowe wyjaśnienie analizy statystycznej znajduje się w punkcie 24.
	<ol>
		<li>Skopiuj wartości z pola "Znormalizowany indeks RI" do odpowiednich komórek w arkuszu kalkulacyjnym "3'LIFE – analiza wielopłytkowa" w pozycji odpowiadającej replikacji #1 dla każdego testowanego miRNA. Powtórzenia należy powtórzyć dla wszystkich kontrprób biologicznych wykonanych w różnych dniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby należy wstawić nazwy genów i status przewidywania celu odpowiednio w kolumnach B i D.
	<ol>
		<li>Zezwól arkuszowi kalkulacyjnemu na automatyczne obliczenie średniej ze wszystkich płyt. Obserwuj dane w formacie 96 dołków jako mapę cieplną (rysunek 2). Plik porządkuje również dane w formacie listy (Rysunek 2). 
		UWAGA: Wskaźnik represji jest miarą używaną do identyfikacji przypuszczalnych celów miRNA. Można stosować różne parametry rygorystyczności, w zależności od indywidualnych preferencji. Średnio bierzemy pod uwagę prawdopodobne trafienia poniżej wskaźnika tłumienia wynoszącego 0,8 i statystycznie istotne za pomocą testu t (wartość p <0,05). Jak pokazano na rys. 3, potencjalne cele oparte na tych kryteriach zostaną wyróżnione kolorem czerwonym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Pasquinelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+the+sequence+and+temporal+expression+of+let-7+heterochronic+regulatory+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA.</a> Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).</li>
<li>Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).</li>
<li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).</li>
<li>Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+heterochronic+gene+lin-4+encodes+small+RNAs+with+antisense+complementarity+to+lin-14%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.</a> Cell. 75 (5), 843-854 (1993).</li>
<li>Wienholds, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in zebrafish embryonic development.</a> Science. 309 (5732), 310-311 (2005).</li>
<li>Darnell, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+during+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression during chick embryo development.</a> Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).</li>
<li>Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+and+microRNAs+in+fragile+X+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA and microRNAs in fragile X mental retardation.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MicroRNA+feedback+circuit+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons.</a> Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).</li>
<li>Poy, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pancreatic+islet-specific+microRNA+regulates+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion.</a> Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li>
<li>Paraskevopoulou, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-microT+web+server+v5.0%3A+service+integration+into+miRNA+functional+analysis+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).</li>
<li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microRNA+target+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li>
<li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3%27UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).</li>
<li>Lal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-24+Inhibits+cell+proliferation+by+targeting+E2F2%2C+MYC%2C+and+other+cell-cycle+genes+via+binding+to+%27seedless%27+3%27UTR+microRNA+recognition+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to 'seedless' 3'UTR microRNA recognition elements.</a> Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).</li>
<li>Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+structure+of+the+let-7+miRNA+interacting+with+the+site+LCS1+of+lin-41+mRNA+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).</li>
<li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+microRNA+targeting+code%3A+functional+sites+with+centered+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing.</a> Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).</li>
<li>Azzouzi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-96+directly+inhibits+gamma-globin+expression+in+human+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis.</a> PLoS One. 6 (7), e22838(2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-193b+Regulates+Mcl-1+in+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).</li>
<li>Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+mode+of+microRNA+target+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative mode of microRNA target recognition.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).</li>
<li>Jiao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+targeting+oncogenes+are+down-regulated+in+pancreatic+malignant+transformation+from+benign+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors.</a> PLoS One. 7 (2), e32068(2012).</li>
<li>Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27LIFE%3A+a+functional+assay+to+detect+miRNA+targets+in+high-throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput.</a> Nucleic Acids Res. , (2014).</li>
<li>Mangone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+C.+elegans+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The landscape of C. elegans 3'UTRs.</a> Science. 329 (5990), 432-435 (2010).</li>
<li>Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m%286%29A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3%27UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204(2013).</li>
<li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li>
<li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNASU+plasmid+and+PSI%3ABiology-Materials+repositories%3A+resources+to+accelerate+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li>
<li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li>
<li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li>
<li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs%3A+a+network+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li>
</ol>

Prace te są wspierane przez fundusze z College of Liberal Arts and Science oraz Biodesign Institute na Uniwersytecie Stanowym Arizony oraz NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

Test 3'LIFE identyfikuje funkcjonalne cele miRNA w 3'UTR w trybie wysokoprzepustowym. Ten test jest przydatny dla badaczy, którzy chcą eksperymentalnie zidentyfikować dużą liczbę przypuszczalnych celów dla swoich interesujących ich miRNA. Test 3'LIFE jest potężnym podejściem do zapytania o regulację sterowaną przez 3'UTR, ponieważ test zapewnia funkcjonalną miarę celowania w miRNA, a binarne testowanie pojedynczego reportera::3'UTR na pojedynczym miRNA może z pewnością zająć się statusem celowania poszczególnych genów. A...

Ogólnym celem tej metody jest wykrywanie i precyzyjne mapowanie celów mikroRNA (miRNA) w wysokiej przepustowości. MiRNA to endogenne niekodujące RNA o długości ~22 nukleotydów. Po transkrypcji i przetwarzaniu dojrzałe miRNA są włączane do kompleksu białkowego zwanego kompleksem wyciszającym indukowanym RNA (RISC). Każdy miRNA kieruje RISC do docelowych elementów zlokalizowanych głównie w regionach 3'nieulegających translacji (3'UTR) informacyjnych RNA (mRNA), co skutkuje albo represją translacji, albo rozszczepieniem mRNA 1. MiRNA rozpoznaje miejsca docelowe na podstawie standardowego parowania zasad chwiejnych Watsona-Cricka i G:U i mają charakter zdegenerowany, zawierają wiele niedopasowanych par zasad i wybrzuszonych regionów. Wiele miRNA jest szeroko konserwowanych, od roślin po ludzi 2,3, gdzie odgrywają różnorodny zakres ról biologicznych. W metazoanach miRNA może wpływać na wiele procesów biologicznych, w tym decyzje dotyczące losu komórki 4, czas rozwoju 5 i często wykazywać specyficzne dla tkanek wzorce ekspresji 6,7. Nieprawidłowa ekspresja MiRNA może również powodować nieprawidłową regulację genów, która może mieć znaczący wpływ na zachowanie komórek w oparciu wyłącznie o funkcję genów docelowych. W związku z tym miRNA są powiązane z wieloma chorobami, w tym neurodegeneracją 8,9, cukrzycą 10 i rakiem 11. Podejścia bioinformatyczne i mokre sugerują, że każde miRNA może być zdolne do celowania w setki do tysięcy różnych mRNA 12-14, co wskazuje, że do zbadania tej dużej puli potencjalnych interakcji potrzebne są podejścia o wysokiej przepustowości lub obejmujące cały genom.
Identyfikacja docelowych genów jest kluczowym elementem mechanistycznego definiowania funkcji miRNA, a aby to zrobić, badacze muszą być w stanie ujawnić cele na dużą skalę. Opracowano kilka podejść do identyfikacji celów miRNA, w tym bioinformatyczne algorytmy predykcyjne, wysokoprzepustowe sekwencjonowanie docelowych mRNA oraz testy reporterowe. Każde z tych podejść ma swoje mocne i słabe strony. Biorąc pod uwagę, że celowanie w miRNA jest kierowane przez specyficzność sekwencji, w szczególności nukleotydów 2-6 miRNA (zwanych regionem nasiennym), opracowano kilka algorytmów do przewidywania celów miRNA w całym genomie wielu organizmów. Algorytmy te są trenowane przy użyciu obserwowanych motywów parowania zasad zwalidowanych celów miRNA i często wykorzystują takie parametry, jak rygorystyczne parowanie nasion, ochrona miejsca i / lub stabilność termodynamiczna 15. Podczas gdy filtry te doprecyzowują dużą liczbę przypuszczalnych celów z wystarczającą komplementarnością tylko do celów o wysokim poziomie ufności, mogą wykluczać specyficzne dla gatunku i niekanoniczne miejsca docelowe miRNA, które według najnowszych dowodów są szeroko rozpowszechnione 16-24. Co więcej, przewidywania te nie uwzględniają mechanizmów przetwarzania mRNA, które wykluczają miejsca docelowe miRNA, takich jak alternatywna poliadenylacja 25, edycja RNA 26, metylacja RNA 27 i wiązanie kooperacyjne. W związku z tym dla wielu algorytmów odnotowano wysokie wskaźniki wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych 22,24,28. Chociaż algorytmy te są przydatne do identyfikacji potencjalnych celów miRNA do późniejszej walidacji eksperymentalnej, te wysokie poziomy błędów ograniczają skuteczność podejść bioinformatycznych do systematycznego wykrywania celów miRNA.
Aby systematycznie badać interakcje między danym miRNA a potencjalnie docelowymi 3'UTR, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test o nazwie Luminescencyjna Identyfikacja Elementów Funkcjonalnych w 3'UTRs (3'LIFE) 24. Ten test mierzy bezpośrednie interakcje i translacyjną represję testowego 3'UTR przez zapytanie miRNA przy użyciu systemu reporterowego podwójnej lucyferazy. W tym systemie 3'UTR interesującego genu jest klonowany za ramką odczytu reportera lucyferazy świetlika (fluc). Konstrukt reporterowy jest kotransfekowany z miRNA zapytania w HEK293T komórkach. Celowanie w MiRNA określa się poprzez pomiar względnej zmiany między reporterem fluc::3'UTR a drugim niespecyficznym reporterem lucyferazy Renilla. Co ważne, testy lucyferazy wykrywają funkcjonalne interakcje miRNA/mRNA, które wpływają na wynik translacyjny reportera. Jest to kluczowa zaleta w porównaniu z tradycyjnymi metodami wykrywania regulacji miRNA, takimi jak RT-qPCR i Western Bloc, ponieważ omija różnice w degradacji mRNA i represji translacyjnej, a także zmiany w obfitości białek niezależne od regulacji opartej na 3'UTR.
Testy lucyferazy są powszechnie wykorzystywane do walidacji bezpośrednich celów miRNA ze względu na ich względną prostotę i czułość, jednak ich użycie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych jest ograniczone przez wysokie koszty związane z odczynnikami eksploatacyjnymi, brak bibliotek 3'UTR ze źródeł publicznych oraz brak standardowych protokołów lucyferazy, co prowadzi do trudności w porównywaniu represji funkcjonalnej w wielu zestawach danych. Aby ułatwić korzystanie z testu 3'LIFE, położyliśmy nacisk na uproszczenie projektu eksperymentalnego, wykorzystanie niekomercyjnej transfekcji 24 i odczynników lucyferazy 29, tworząc bibliotekę 3'UTR, która jest regularnie aktualizowana i rozbudowywana, a także jest dostępna za pośrednictwem publicznego repozytorium plazmidów 30.
Skalowalność testu 3'LIFE pozwala na badanie przesiewowe dużej biblioteki 3'UTR w celu celowania przez dane miRNA bez przekierowywania ekranu w stronę bioinformatycznych zidentyfikowanych genów. Oprócz testowania interakcji kanonicznych i przewidywanych, to systematyczne podejście pozwala na identyfikację nowych celów napędzanych przez interakcje niekanoniczne i/lub specyficzne dla gatunku. Co ważne, wpływ celowania w miRNA na produkcję białek jest ogólnie rozumiany jako powodujący umiarkowaną represję translacyjną 15,31, co sugeruje, że podstawową rolą regulacji miRNA jest precyzyjne dostrojenie produkcji białka, ochrona przed nieprawidłowymi poziomami ekspresji genów i zapewnienie odporności programów specyficznych dla komórki 32,33. Czułość testu lucyferazy w połączeniu z z natury dużą liczbą ujemnych interakcji miRNA/mRNA w badaniu przesiewowym 3'LIFE pozwala na wykrycie subtelnych efektów celowania w miRNA na dużą liczbę genów oraz identyfikację wielu składników sieci genów, które są regulowane przez dane miRNA 24.
Tutaj opisujemy protokół 3'LIFE i demonstrujemy jego wykonalność, przeprowadzając badania przesiewowe dwóch dobrze scharakteryzowanych miRNA, miR-10b i let-7c, na panelu 275 ludzkich 3'UTR (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicyloglicyna</td><td>Sigma</td><td>G1127-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kx PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>FLAAS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>lucyferyna</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma</td><td>E0399</td><td></td></tr><tr><td>K H2 P O4</td><td>Sigma</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Sigma</td><td>C3230</td><td></td></tr><tr><td>PBS/HEPES</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Pennicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td></td><td>T2600000</td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MaxiPrep Promega</td><td></td><td>A2392</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa minipłytka przygotowawcza</td><td>Pall</td><td>8032</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka wahadłowa</td><td>Lonza</td><td>V4SP-2096</td><td></td></tr><tr><td>5x Bufor do lizy</td><td>Promega</td><td>E1941&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy czytnik płytek GloMax Promega</td><td></td><td>E9032</td><td></td></tr><tr><td>Biomech FX Robot do obsługi cieczy</td><td>Beckmann</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy system wahadłowy</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek Hrabina</td><td>Invitrogen</td><td>Zobacz materiał C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie celów mirna w trybie wysokoprzepustowym za pomocą testu 3'life

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescencyjna identyfikacja elementów funkcjonalnych w 3'UTR (3'LIFE) pozwala na szybką identyfikację celów określonych miRNA w tablicy setek odpytywanych 3'UTR. Identyfikacja celu opiera się na teście podwójnej lucyferazy, który wykrywa wiązanie na poziomie mRNA poprzez pomiar wyjścia translacyjnego, dając funkcjonalny odczyt celowania w miRNA. W ramach projektu 3'LIFE wykorzystywane są niezastrzeżone i odczynniki oraz publicznie dostępne biblioteki reporterów, dzięki czemu badania przesiewowe całego genomu są wykonalne i opłacalne. Badanie 3'LIFE można przeprowadzić zarówno w standardowym laboratorium, jak i zwiększyć przy użyciu robotów do obsługi cieczy i innych urządzeń o wysokiej przepustowości. Ilustrujemy to podejście, używając zestawu danych ludzkich 3'UTR sklonowanych na 96-dołkowych płytkach oraz dwóch testowych miRNA, let-7c i miR-10b. Pokazujemy, jak przeprowadzać przygotowanie DNA, transfekcję, hodowlę komórkową i testy lucyferazy w formacie 96-dołkowym oraz udostępniamy narzędzia do analizy danych. Podsumowując, projekt 3'LIFE jest wysoce powtarzalny, szybki, systematyczny i identyfikuje cele o wysokim poziomie ufności.

Plik wyjściowy z luminometru zawiera surowe pomiary dla białek lucyferazy świetlika oraz Renilla. Ten surowy format jest kompatybilny z arkuszami kalkulacyjnymi „3’LIFE – single plate analysis” oraz „3’LIFE – multiplate analysis” dostępnymi na stronie internetowej laboratorium Mangone (<a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a>). Arkusz do analizy pojedynczej płytki automatycznie oblicza stosunek lucyferazy świetlika/Renilla, normalizuje każde miRNA względem odpowiedniej kontroli negatyw...

Luminescencyjna identyfikacja elementów funkcjonalnych w nieulegających translacji regionach 3' (3'UTR) (3'LIFE) to technika identyfikacji funkcjonalnej regulacji w 3'UTR przez miRNA lub inne czynniki regulacyjne. Protokół ten wykorzystuje metodologię o wysokiej przepustowości, taką jak transfekcja 96-dołkowa i testy lucyferazy, do badania przesiewowego setek domniemanych interakcji pod kątem represji funkcjonalnej.

Wykrywanie celów miRNA w trybie wysokoprzepustowym za pomocą testu 3'LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest identyfikacja celów mikroRNA w bibliotece 3' niekodujących regionów nietranslacyjnych (UTR). Jest to realizowane poprzez kotransfekcję komórek HEK 293 plazmidem ekspresyjnym mikroRNA oraz plazmidem zawierającym reporter lukcyferazy połączony z 3' UTR, co umożliwia przeprowadzanie obszernych, bezstronnych przesiewów. Transfekcje są wykonywane w drugim etapie na płytkach 96-dołkowych. Komórki poddawane są podwójnemu testowi lukcyferazy, który mierzy potranskrypcyjną regulację 3' UTR przez mikroRNA.Następnie dane z wielu powtórzeń i wielu płytek są analizowane w celu zidentyfikowania wiarygodnych celów mikroRNA spośród puli setek wyników 3' UTR. Otrzymane wyniki wykazują, że każde mikroRNA celuje w unikalny zestaw 3' UTR na podstawie represji translacyjnej mierzonej za pomocą testu dual-luciferase. Test 3' UTR pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii mikroRNA poprzez identyfikację licznych genów docelowych dla interesującego nas mikroRNA, dostarczając danych niezbędnych do przeprowadzenia dalszych eksperymentów walidacyjnych. Na 24 do 48 godzin przed transfekcją należy przygotować wystarczającą liczbę komórek HEK 293 T, zależnie

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie celów miRNA w wysokiej przepustowości przy użyciu testu 3'LIFE

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i wykazano, że odgrywają one rolę w licznych procesach biologicznych. Aby lepiej zrozumieć interakcje miRNA-UTR, stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję reporterów lucyferazy 3' UTR, połączonych z nowym genem lucyferazy i odczynnikiem analitycznym, systemem LightSwitch.

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Prezentujemy nowy i w pełni zautomatyzowany potok miRNA, mirMachine, który 1) może dokładniej identyfikować znane i nowe miRNA oraz 2) jest w pełni zautomatyzowany i swobodnie dostępny. Użytkownicy mogą teraz wykonać krótki skrypt przesyłania, aby uruchomić w pełni zautomatyzowany potok mirMachine.

mirMachine: punkt kompleksowej obsługi adnotacji miRNA roślin

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę 3'LIFE do wykrywania celów miRNA w regionach 3'UTR przy użyciu testu lucyferazowego w komórkach HEK293. Ta technika umożliwia badaczom efektywną analizę setek interakcji regulacyjnych.

Wykrywanie celów miRNA w trybie wysokoprzepustowym za pomocą testu 3'LIFE

Przeglądaj więcej filmów