Name: Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj model ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt do badania wzrostu guza, inwazji i angiogenezy. Ta metoda umożliwia szybki przesiew leków przeciwnowotworowych w żywym układzie 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Pani Cornelii Heis za doskonałą pomoc techniczną w zakresie immunohistochemii i przygotowania zarodków kurzych. Prace te były wspierane przez Austriacki Fundusz Naukowy (grant FWF nr P19552) oraz Unię Europejską (projekt UE 7PR Optatio No: 278570).

Zgodnie z prawem austriackim oraz Urzędem ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych amerykańskiej publicznej służby zdrowia zarodki ptaków nie są uważane za żywe kręgowce do momentu wyklucia. Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych NIH wydało pisemne wytyczne w tej dziedzinie (http://www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm i publikacja NIH nr: 06-4515).
1. Hodowla komórkowa i transfekcja lentiwirusowa
<ol>
	<li>Hodowla linii komórkowych MM OPM-2, RPMI-8226 i ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego w RPMI1640 pożywce, uzupełniona 10% bydlęcą płodową surowicą cielęcą i 100 IU/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM glutaminy w obecności 5% CO2 w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Transfekcja 5 x 106 komórek HEK 293FT z mieszanką opakowań wirusowych (9 μg) DNA i 3 μg pLenti6/V5 dest wektorem eGFP przy użyciu 30 μl liposomalnego odczynnika do transfekcji i pożywki do transfekcji (10 ml). Po 12 godzinach usunąć pożywkę do transfekcji i dodać 10 ml pożywki DMEM z 10% surowicą cielęcą bydlęcą i 1% aminokwasami endogennymi (NEAA).</li>
	<li>Po 5 dniach zebrać supernatanty z HEK293FT komórek po odwirowaniu pływających komórek (1 000 x g, 5 min). Określ miano wirusa za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano w innym miejscu 28.</li>
	<li>Transfekcja 1 x 106 MM komórek z cząstkami lentiwirusa eGFP (1 x 105 cząstek) na 24-dołkowej płytce w kompletnym pożywce wzrostowej. Po 3 dniach rozpocznij proces selekcji od dodania 2 μg/ml blasticydyny do pożywki hodowlanej. W przypadku dostępnego na rynku lentiwirusa eGFP należy użyć 500 μg/ml neomycyny.</li>
	<li>Po 2 tygodniach selekcji pojawią się skupiska komórek MM wykazujących ekspresję eGFP; zebrać komórki przez wirowanie (1000 x g, 5 min) i rozwinąć je jako podlinie OPM-2eGFP i RPMI-8226eGFP do eksperymentów (sekcja 2 i 3).</li>
</ol>
2. 3D-Model sferoidalny szpiczaka mnogiego
<ol>
	<li>Schłodź roztwór kolagenu typu I i 10 x DMEM na lodzie.</li>
	<li>Wymieszać 1/10 objętości 10 x pożywki DMEM z matrycą kolagenową; dodać NaOH (0,2 N), aby zneutralizować kwaśny roztwór kolagenu do wartości pH 7,4; przechowywać kolagen/roztwór pożywki na lodzie.</li>
	<li>Wymieszaj transgeniczne linie komórek MM (OPM-2eGFP lub RPMI-8226 eGFP; 250 000 na sferoidę) z ludzkimi komórkami mezenchymalnymi (50 000 komórek / sferoidę, tj. kropla 30 μl).</li>
	<li>Odwirować mieszaninę komórek w probówkach o pojemności 15 ml (1000 x g, 5 min), dodać przygotowaną na zimno mieszaninę kolagenu (1 ml) do osadu komórkowego i dobrze wymieszać (końcówką 1 000 μl).</li>
	<li>Natychmiast odpipetować 30 μl mieszaniny kolagen/komórka (końcówką 100 μl) na 24-dołkowej płytce na sterylnej folii parafinowej i pozostawić mieszaninę komórek/kolagenów do polimeryzacji przez 30 minut w temperaturze 37°C (patrz rysunek 1A).</li>
	<li>Nałożyć sferoidy MM na 1 ml pożywki hodowlanej zawierającej bortezomib o stężeniu 1, 10 i 100 nM (patrz rysunek 1B).</li>
	<li>Po 72 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C należy udokumentować sferoidy za pomocą stereomikroskopii fluorescencyjnej (patrz rysunek 1C).</li>
	<li>Przenieść każdą sferoidę za pomocą kleszczy z szerokimi płaskimi szczękami w probówce reakcyjnej w celu pomiaru GFP (patrz rysunek 1D).</li>
</ol>
3. 3D Model ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego w CAM
<ol>
	<li>Jaja kurze inkubować w specjalnym inkubatorze dla jaj ptasich w temperaturze 37°C i wilgotności 70% przez trzy dni.</li>
	<li>Następnie należy otworzyć jaja i przenieść zarodki do wysterylizowanych etanolem, kwadratowych, 10-centymetrowych plastikowych łódek wagowych z pokrywką z płytki do hodowli komórkowych i inkubować "ex ovo" przez kolejne sześć dni, aby CAM mógł się rozwinąć (patrz ryc. 2A).</li>
	<li>Schłodzić roztwór kolagenu typu I i 10 x DMEM na lodzie, wymieszać 1/10 objętości 10 x pożywki DMEM z matrycą kolagenową, dodać NaOH (0,2 N), aby zneutralizować kwaśny roztwór kolagenu do wartości pH 7,4; przechowywać kolagen/roztwór podłoża na lodzie.</li>
	<li>Wymieszaj transgeniczne linie komórek MM (OPM-2eGFP lub RPMI-8226eGFP; 250 000 na sferoidę) z ludzkimi komórkami mezenchymalnymi (50 000 komórek / sferoidę).</li>
	<li>Odwirować komórki w probówkach o pojemności 15 ml (1 000 x g, 5 min; na każdy badany związek 1 fiolka), dodać 1 ml przygotowanej na zimno mieszaniny kolagenu z lekiem (o pożądanym stężeniu roboczym) do osadu komórkowego i dobrze wymieszać (końcówką 1 000 μl).</li>
	<li>Umieść krople kolagenu (po 30 μl każda) na parafilmie w pasztecie 6-dołkowym na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzy zewnątrzkomórkowej w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Przenieść "na rośliny" z kroku 3.6 za pomocą kleszczy na niepoddaną działaniu środka powierzchnię CAM (2 cm od zarodka) 9-dniowych zarodków kurcząt (4 na każdy zarodek kurczaka, patrz rysunek 2B)</li>
	<li>Po 5 dniach wzrostu in vivo w inkubatorze jaj w temperaturze 37°C i wilgotności 70% należy udokumentować ksenoprzeszczepy za pomocą stereomikroskopii fluorescencyjnej (patrz ryc. 2C). Eutanazję zarodków kurczaka przez hipotermię w temperaturze 4°C w lodówce przez 5 godzin.</li>
	<li>Usunąć ksenoprzeszczepy z subjadacyjną tkanką CAM za pomocą nożyczek okulistycznych i kleszczy z szerokimi płaskimi szczękami. Używaj ich do pomiaru GFP (sekcja 4, patrz rysunek 2D) lub do analizy immunohistochemicznej naczyń krwionośnych i/lub atakujących komórek nowotworowych (sekcja 5).</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja białka eGFP za pomocą testu ELISA
<ol>
	<li>Przenieść każdy sferoid MM lub wycięty ksenoprzeszczep do 0,5 ml buforu RIPA zawierającego 200 μg/ml inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Homogenizować sferoidę/ksenoprzeszczep za pomocą homogenizatora tkankowego na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj trzy cykle zamrażania/rozmrażania w ciekłym azocie i łaźni wodnej o temperaturze 37°C.</li>
	<li>Odwirować homogenat w temperaturze 4°C przez 20 minut (12 000 g) i przechowywać supernatanty.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:20 w buforze do oznaczania (200 μl) zestawu ELISA. Zmierz poziom GFP za pomocą komercyjnego zestawu ELISA GFP przy użyciu biotynylowanych przeciwciał anty-GFP, zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
5. Analiza immunohistochemiczna naczyń krwionośnych i atakujących komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Utrwalić wycięte ksenoprzeszczepy z obszarem CAM w 4% paraformaldehydzie O/N w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Utrwalone ksenoprzeszczepy umieścić w kasetach do zatapiania i przenieść do stacji do zatapiania tkanek z coraz większą serią alkoholi (50%, 70%, 80%, 95% etanolu, ksylolu i parafiny; każdy etap 60 minut).</li>
	<li>Sekcja ksenoprzeszczepów (5 μm) przy użyciu laboratoryjnego mikrotomu obrotowego. Upiec sekcje parafinowe na szkiełkach typu O/N w temperaturze 56°C.</li>
	<li>Odparafinować skrawki za pomocą zmniejszającej się serii alkoholi do wody podwójnie destylowanej (ksylol, 95%, 80%, 70%, 50% etanol, woda podwójnie destylowana; każdy etap 10 min).</li>
	<li>Pobrać antygen w łaźni wodnej (95°C, 20 min) z roztworem do pobierania antygenu (bufor cytrynianowy; pH 7,0; objętość 100 μl).</li>
	<li>Blokować aktywność endogennej peroksydazy za pomocą 100 μl 3%H2O2/metanolu przez 30 min.</li>
	<li>Blokuj skrawki w PBS zawierające 10% płodowej surowicy cielęcej przez 45 min (objętość 100 μl).</li>
	<li>Barwić przez 1 godzinę 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała (1 μg/ml) rozcieńczonego w PBS zawierającym 1% płodową surowicę cielęcą w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 3-krotnym przemyciu w PBS inkubować przez 1 godzinę z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (0,1 μg/ml) w PBS zawierającym 1% płodową surowicę cielęcą w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 3-krotnym umyciu w PBS przeprowadzić reakcję barwną za pomocą roztworu substratu awidyna/biotyna (ABC) i diaminobenzydyny (DAB) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>5.11. Zatrzymać reakcję, przenosząc sekcje do podwójnie destylowanej wody, przeciwbarwić hematoksyliną i zamontować sekcje syntetycznym medium montażowym.</li>
</ol>

<ol><li>Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+evolving+genetic+events+and+host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions.</a> Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).</li>
<li>Kumar, S. K., Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+adapted+therapy+for+multiple+myeloma%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics.</a> Leuk.Lymphoma. , (2014).</li>
<li>Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Hematol%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of multiple myeloma.</a> Adv.Hematol. 2014, 864058(2014).</li>
<li>Chauhan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+orally+active+proteasome+inhibitor+ONX+0912+triggers+in+vitro+and+in+vivo+cytotoxicity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma.</a> Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).</li>
<li>Kuehl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+can+predict+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models can predict cancer therapy.</a> Blood. 120 (2), 238-240 (2012).</li>
<li>Nefedova, Y., Gabrilovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+clinical+prospects+of+Notch+inhibitors+in+the+therapy+of+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.Updat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies.</a> Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).</li>
<li>Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+myeloma+cells+growing+in+SCID-hu+mice%3A+a+model+for+studying+the+biology+and+treatment+of+myeloma+and+its+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations.</a> Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).</li>
<li>Dazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+chronic+phase+CML+hematopoietic+cells+repopulate+NOD%2FSCID+bone+marrow+with+different+kinetics+and+cell+lineage+representation%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.J%22%5BJournal%5D)">Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation.</a> Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).</li>
<li>Lock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+%28NOD%2FSCID%29+mouse+model+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+reveals+intrinsic+differences+in+biologic+characteristics+at+diagnosis+and+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse.</a> Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).</li>
<li>Feuring-Buske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+progenitor+cells+in+beta+2-microglobulin-deficient+NOD%2FSCID+mice+and+in+NOD%2FSCID+mice+transgenic+for+human+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors.</a> Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).</li>
<li>Pearce, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+engraftment+in+the+NOD%2FSCID+assay+reflects+the+outcome+of+AML%3A+implications+for+our+understanding+of+the+heterogeneity+of+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML.</a> Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+inhibition+of+Notch+signaling+and+Bcl-2%2FBcl-xL+results+in+synergistic+antimyeloma+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect.</a> Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).</li>
<li>Tassone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+SCID-hu+in+vivo+model+of+human+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma.</a> Blood. 106 (2), 713-716 (2005).</li>
<li>Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+through+stem+cell-based+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Drug+Deliv.Rev%22%5BJournal%5D)">Drug discovery through stem cell-based organoid models.</a> Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).</li>
<li>Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+biofabrication+strategies+for+skin+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine.%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair.</a> Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).</li>
<li>Fischbach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tumors+with+3D+scaffolds%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering tumors with 3D scaffolds).</a> Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo.</a> J.Vis.Exp. (41), (2010).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2.+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+models+to+quantify+angiogenesis+induced+by+inflammatory+and+tumor+cells+or+purified+effector+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules.</a> Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).</li>
<li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRP-78+secreted+by+tumor+cells+blocks+the+antiangiogenic+activity+of+bortezomib%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib.</a> Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gelatin+sponge-chorioallantoic+membrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology.</a> Exp.Cell Res. , (2014).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J.Vis.Exp. (33), (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chick+embryo+model+for+metastatic+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Urol%22%5BJournal%5D)">A chick embryo model for metastatic human prostate cancer.</a> Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).</li>
<li>Koop, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+melanoma+cells+entering+the+microcirculation%3A+over+80%25+survive+and+extravasate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate.</a> Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).</li>
<li>Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype-dependent+effects+of+EpCAM+expression+on+growth+and+invasion+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Cancer%22%5BJournal%5D)">Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines.</a> BMC.Cancer. 12, 501(2012).</li>
<li>Martowicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+overexpression+prolongs+proliferative+capacity+of+primary+human+breast+epithelial+cells+and+supports+hyperplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth.</a> Mol.Cancer. 12, 56(2013).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> 6, 34(2006).</li>
<li>Farnoushi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+testing+of+drug+response+in+multiple+myeloma+made+possible+by+xenograft+to+turkey+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos.</a> Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).</li>
<li>Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD34%2B+cells+expressing+the+inv%2816%29+fusion+protein+exhibit+a+myelomonocytic+phenotype+with+greatly+enhanced+proliferative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability.</a> Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).</li>
<li>Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+multiple+myeloma+pathogenesis+in+the+bone+marrow+to+identify+new+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets.</a> Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).</li>
<li>Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+to+study+primary+human+bone+marrow+and+its+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies.</a> J.Vis.Exp. (85), (2014).</li>
<li>Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+myeloma%3A+a+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Opin.Biol.Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal.</a> Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).</li>
<li>Jilani, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+binding+of+lectins+to+embryonic+chicken+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature.</a> J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

Opracowanie nowych środków terapeutycznych do opornej na leczenie szpiku szpikowego wymaga mniej czasochłonnych i kosztownych systemów in vivo do oceny wrażliwości ludzkich komórek szpiczaka szpiczaka szpiczanego na leki. Do tej pory dostępnych jest tylko kilka systemów in vivo do przedklinicznej oceny nowych terapii przeciwszpiczakowych. Wszystkie z nich mają swoje ograniczenia w zakresie badań przesiewowych bibliotek złożonych na dużą skalę 29.  
 Najlepszymi obecnie modelami ludzkich komórek szpic...

Szpiczak mnogi (MM) charakteryzuje się proliferacją złośliwych komórek plazmatycznych w szpiku kostnym, zmianami kostnymi i niedoborem odporności 1. Chociaż dostępne są nowe opcje leczenia, takie jak inhibitory proteasomów (bortezomib) i leki immunomodulujące (pomalidomid i lenalidomid), szpik szpikowy nadal pozostaje nieuleczalnym nowotworem złośliwym o ponurym rokowaniu 2. Złe rokowanie można wytłumaczyć niezwykłą niejednorodnością klonów komórek MM, która przyczynia się do zmiennych odpowiedzi na leczenie, w szczególności w przypadku długotrwałego leczenia i presji selekcyjnej klonów MM 3.
Przedkliniczne testy nowych leków i ich kombinacji in vitro i in vivo to krytyczny i czasochłonny krok dla przyszłego rozwoju leków. W związku z tym potrzebne są użyteczne modele szpiku mnogiego in vivo, aby lepiej zrozumieć biologię choroby i umożliwić odkrycie nowych leków. W rzeczywistości najlepszymi modelami ksenotransplantacji nowotworów hematologicznych i terapii są myszy z niedoborem odporności, takie jak myszy z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) 4-7, myszy bez otyłości z cukrzycą / SCID (NOD / SCID) 8,9 lub myszy NOD / SCID z β-mikroglobuliną z nokautem 10,11.
Chociaż mysie modele ludzkiego MM pod pewnymi względami mogą przypominać fenotyp ludzkiej choroby, myszy z niedoborem odporności są inbredowane, dlatego symulują tylko jedną indywidualną reakcję na lek, a koszty są bardzo wysokie. Ze względu na immunosupresję zwierzęta wymagają specjalnych warunków utrzymania, a wszczepienie ludzkiego szpiczaka szpiczaka u myszy trwa od 6 tygodni do 2 miesięcy 9,12, chyba że komórki są przeszczepiane bezpośrednio do szpiku kostnego przy użyciu technicznie wymagającej procedury o niższych wskaźnikach przeżywalności zwierząt 7,13. W związku z tym opracowano nowe metody wykorzystujące modele organoidów oparte na komórkach macierzystych 14 , inżynierię tkankową 15 lub zaawansowane modele hodowli komórkowych 3D 16 . W niedalekiej przyszłości będą one konkurować z klasycznymi eksperymentami na zwierzętach w zakresie przedklinicznych testów leków, ale nie mogą zastąpić testów toksyczności ogólnoustrojowej w organizmach żywych.
Wykazano wcześniej, że zarodek kurczaka jest odpowiednim organizmem do ksenotransplantacji ludzkich komórek i tkanek ze względu na brak adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej do 17-19 roku życia. Co więcej, każdy zarodek kurczaka odzwierciedla indywidualną reakcję na stosowane leki lub komórki nowotworowe ze względu na różnorodność genetyczną w populacji kurczaków. Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest dobrze ugruntowanym systemem do badania angiogenezy zależnej od guza 20-22. Kiedy guzy lite są przeszczepiane do CAM, wykazują wiele cech nowotworów in vivo, w tym proliferację, inwazję, angiogenezę i przerzuty 23-27. 
Na podstawie wcześniejszych doświadczeń naszej grupy z modelami ksenoprzeszczepów CAM20,26,27, stworzono model ludzkiego MM, który łączy zalety ludzkiego systemu hodowli 3D z modelem rozwoju zarodków kurczaków ex ovo. Ten system modelowy MM umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym postępu wzrostu MM, ilościowe określanie masy komórek i przedkliniczne testowanie leków.

<table><tbody><tr><td>RPMI-8226 komórki</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR profilowane</td></tr><tr><td>komórki OPM-2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR profilowane</td></tr><tr><td>ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste&nbsp;</td><td>Ogniwa HEK293FT PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu&nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut- Pen- Strep</td><td>roztwór Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Transfekcja Medium/Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>eGFP lentiviral particles</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>Gotowe do użycia cząsteczki wirusowe</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 eGFP vector</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>od autorów</td></tr><tr><td>ViralpowerTM packaging mix&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji/ Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Neomycyna</td><td>Biochrom</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>Collagen-Type1&nbsp; Rat Tail</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM w proszku</td><td>Life Technologies</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>plitidepsyna</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bortezomib</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF-białe jaja kurze</td> Charles <td>River</td><td></td><td>Zapłodnione&nbsp; biały Leghorn&nbsp; jaja kurze</td></tr><tr><td>Plastikowe łodzie wagowe</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>do hodowli ex-ovo</td></tr><tr><td>Kwadrat Petrydisha (pokrywki)</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td>do hodowli ex-ovo</td></tr><tr><td>Bufor RIPA (10x)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza Tabletki inhibitorowe</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna mini</td> komórka ELISA ELISA bez EDTA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe SuperFrost</td><td>R. Langenbrinck&nbsp;</td><td>Art.-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>Labor- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania DakoCytomation 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania celu (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>Kod DAKO-Nr.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu ASMA klon 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 klon MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Vimentin klon V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Desmin klon D33</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; klon MIB-1&nbsp; &nbsp;</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M7240</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowana koza anty-mysie IgG</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td># Zestaw tabletek PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>FAST DAB.</td><td>Sigma Biochemikalia#</td> <td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s haemalaun solution</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>Stołowy mikrotom obrotowy</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stacja do zatapiania tkanek</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator jaj</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny wyposażony w połączony z kamerą cyfrową (Olympus E410) i elastyczne zimne światło&nbsp;</td><td>Olympus, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax&nbsp;</td><td>Homogenizator</td> <td>IKA T10</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Szpiczak mnogi (MM), złośliwa choroba komórek plazmatycznych, pozostaje nieuleczalna i potrzebne są nowe leki, aby poprawić rokowania pacjentów. Ze względu na brak mikrośrodowiska kostnego i auto/parakrynnych czynników wzrostu, ludzkie komórki szpiczaka szpiczanego są trudne do wyhodowania. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia odpowiednich systemów hodowli in vitro i in vivo w celu zbadania działania nowych terapii na ludzkie komórki szpiczaka. Tutaj przedstawiamy model do hodowli ludzkich komórek szpiczaka mnogiego w złożonym środowisku 3D in vitro i in vivo. Linie komórkowe MM OPM-2 i RPMI-8226 transfekowano w celu ekspresji transgenu GFP i hodowano w obecności ludzkich komórek mezenchymalnych i matrycy kolagenu typu I jako trójwymiarowych sferoid. Ponadto sferoidy szczepiono na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) zarodków kurczaków, a wzrost guza monitorowano za pomocą stereofluorescencji mikroskopowej. Oba modele umożliwiają badanie nowych leków terapeutycznych w złożonym środowisku 3D oraz ilościowe określanie masy komórek nowotworowych po homogenizacji przeszczepów w transgenowym GFP-ELISA. Co więcej, angiogenne odpowiedzi gospodarza i inwazja komórek nowotworowych do tkanki gospodarza mogą być codziennie monitorowane przez mikroskop stereoskopowy i analizowane przez barwienie immunohistochemiczne przeciwko ludzkim komórkom nowotworowym (Ki-67, CD138, Vimentin) lub komórkom ściennym gospodarza pokrywającym naczynia krwionośne (desmin / ASMA).
Podsumowując, system onplant pozwala badać wzrost komórek MM i angiogenezę w złożonym środowisku 3D oraz umożliwia badania przesiewowe nowych związków terapeutycznych ukierunkowanych na przeżycie i proliferację komórek MM.

In vitro analiza związków docelowych w testach 3D sferoidów szpiczaka mnogiego
Ze względu na ograniczenia w hodowli pierwotnych ludzkich komórek MM in vitro, opracowaliśmy nowe modele hodowli 3D in vitro dla ludzkich linii komórkowych MM, wykorzystując macierz wzrostu pozakomórkowego oraz wspomagające pierwotne ludzkie komórki mezenchymalne z szpiku kostnego (Rysunek 1A, B). Transgeniczne linie komórkowe MM z eGFP um...

Ludzkie komórki szpiczaka mnogiego (MM) wymagają wspierającego mikrośrodowiska komórek mezenchymalnych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej do przetrwania i proliferacji. Stworzyliśmy model zarodka kurczaka in vivo z wszczepionym ludzkim szpiczakiem i komórkami mezenchymalnymi, aby zbadać wpływ leków przeciwnowotworowych na wzrost, inwazję i angiogenezę guza.

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest stworzenie in vivo modelu zarodka kurczaka z wszczepionymi ludzkimi komórkami szpiczaka i komórkami mezenchymalnymi w celu zbadania wpływu leków przeciwnowotworowych na wzrost guza, inwazję oraz angiogenezę. Osiąga się to poprzez generowanie transgenicznych ludzkich komórek szpiczaka mnogiego do analizy w modelach 3D in vitro oraz in vivo. Komórki są transfekowane lentiwirusem dostarczającym GFP do wizualizacji oraz oporność na blastynę w celu selekcji komórek transfekowanych.W drugim kroku tworzy się 3D viroidy. Z transfekowanych komórek powstają komórki mezenchymalne oraz macierz zewnątrzkomórkowa, co umożliwia prowadzenie przesiewowych badań leków przeciwnowotworowych na szeroką skalę w złożonym środowisku 3D in vitro. Następnie tworzy się guz 3D.PHE można hodować in vivo w zarodkach kurzych, aby przetestować wpływ nowych leków na wzrost guza, jego naciekanie oraz angiogenezę. Ostatecznie wielkość guza i odpowiedzi angiogenne można dokumentować codziennie oraz po eutanazji. Guzów można poddać analizie za pomocą GFP, testu ELISA i immunohistochemii.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak modele ksenoprzeszczepów lustrzanych, jest możliwość manipulowania i obrazowania ludzkich guzów w systemie ECX. Ludzkie komórki nowotworowe wraz z wspierającymi je ludzkimi komórkami zrębowymi oraz składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej mogą rosnąć in vivo w embrionach kurczęt, które nie wykształciły jeszcze adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Metoda ta może pomóc w opracowaniu nowych terapii i umożliwia szybki screening przedkliniczny w celu leczenia pacjentów cierpiących na szpiczaka mnogiego.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ ludzkie komórki szpiczaka mnogiego łatwo ulegają apoptozie pod wpływem stresu, a embriony kurcząt mogą obumrzeć w przypadku niewłaściwej obsługi, mimo zastosowania odpowiednich warunków hodowli ex ovo. Procedurę oraz wszystkie jej krytyczne etapy zaprezentuje Cornelia Hes, doświadczona technik z naszego laboratorium. Do realizacji tego protokołu należy przygotować hodowle linii komórkowych szpiczaka mnogiego OPM2 w pożywce RPMI 1640 oraz ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z szpiku kostnego. Komórki należy inkubować w standardowy sposób w pożywce suplementowanej zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie przeprowadzić transfekcję 1 000 000 komórek szpiczaka mnogiego za pomocą 100 000 cząsteczek lentiwirusowych.W płytce 24-dołkowej z pełną pożywką wzrostową, po trzech dniach, rozpocznij selekcję komórek przetransfekowanych poprzez dodanie 2 µg blastycyny na każdy 1 mL pożywki hodowlanej lub zastosuj 500 µL neomycyny na 1 mL w przypadku komercyjnie dostępnego lentiwirusa EGFP. Po dwóch tygodniach selekcji poszukaj skupisk komórek wykazujących ekspresję EGFP. Zbierz pływające lub przylegające skupiska komórek, ostrożnie resuspendując je w probówce do wirowania; pelletuj komórki EGFP przy 1000 ×g przez pięć minut i namnóż je jako linie podrzędne. Po selekcji i propagacji komórek szpiczaka mnogiego wykazujących ekspresję GFP, zawsze sprawdź ich zdolność do ekspresji przed wykorzystaniem ich w dalszych eksperymentach.W celu rozpoczęcia schłodzić na lodzie roztwór kolagenu typu I oraz 10X DMEM. Po ochłodzeniu wymieszać roztwór kolagenu z medium 10X DMEM w stosunku objętościowym 1:10. Następnie dodawać kroplami 0,2 N wodorotlenek sodu, aby zneutralizować roztwór do pH 7,4.Przechowywać roztwór w lodzie i sprawdzić pH za pomocą paska testowego. Następnie wymieszać transgeniczne linie komórek szpiczaka mnogiego z ludzkimi komórkami mezenchymalnymi. Odwirować mieszaninę komórek w probówkach 15 ml przy 1000 Gs przez pięć minut, odlać nadsącz i za pomocą pipety P 1000 resuspender osad w 1 ml zimnej mieszaniny kolagenu.Używając końcówki P 100, niezwłocznie przenieś 30 µL aliquoty mieszaniny na sterylną parafinię. W 24-dołkowej płytce hodowlanej pozostaw mieszaninę do polimeryzacji na 30 minut w temperaturze 37 °C, tworząc w ten sposób steroidy. Następnie przykryj steroidy jednym mililitrem przygotowanego medium z różnymi wariantami traktowania.Na przykład lek można podawać w różnych stężeniach. Po 72 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C należy udokumentować PHE za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Następnie, używając szerokich płaskich pęset, należy przenieść każdy steroid do probówki reakcyjnej w celu pomiaru ekspresji GFP.W ramach przygotowania do tej procedury należy inkubować jaja kurze w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy wilgotności 70% przez trzy dni. Następnie należy otworzyć jaja i przenieść embriony do wysterylizowanych, kwadratowych, plastikowych łódeczek wagowych o wymiarach 10 cm z płytkami do hodowli komórkowej, aby uzyskać wyższą przeżywalność embrionów kurzych w hodowli ex ovo. Zamiast 10-centymetrowych naczyń do hodowli tkanek należy zastosować plastikowe łódeczki wagowe.Ponadto, przed użyciem należy wysterylizować i wstępnie zwilżyć łódki oczekujące za pomocą PBS. Kontynuuj inkubację jaj in ovo przez kolejne sześć dni, podczas których rozwinie się błona CAM. Następnie przygotuj PHE z szpiczaka mnogiego i komórek mezenchymalnych zgodnie z poprzednią procedurą, ale na płytce 6-dołkowej, a następnie za pomocą pęsety przenieś sterylizowane implanty na niepoddaną działaniu preparatu powierzchnię CAM, w odległości około dwóch centymetrów od zarodka w dziewięciodniowych zarodkach kurzych.Umieść cztery rośliny na każdym zarodku kurczaka. Pozostaw zarodki ex ovo z naniesionymi roślinami w inkubatorze do jaj przez pięć dni. Następnie udokumentuj ksenoprzeszczepy za pomocą fluorescencyjnej stereomikroskopii.Po udokumentowaniu, przy użyciu nożyczek okulistycznych i pęsety, należy usunąć ksenoprzeszczepy wraz z częścią sąsiadującej tkanki camp. Aby zmierzyć ekspresję GFP lub przeprowadzić analizę immunohistochemiczną, należy najpierw przenieść każdy ksenoprzeszczep szpiczaka mnogiego z podaniem steroidów lub wycięty ksenoprzeszczep do 0.5 milliliters buforu RIPA z inhibitorami proteaz. Następnie, przy użyciu homogenizatora w lodzie, należy zhomogenizować tkanki; po homogenizacji homogenaty należy zamrozić w ciekłym azocie, a następnie rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 degrees Celsius.Powtórz tę czynność trzy razy, a następnie odwiruj homogenaty w temperaturze 4 °C przez 20 minut przy 12 000 G i zachowaj nadnadstany. Następnie rozcieńcz część nadnadstanu w stosunku od 1 do 20 w buforze do analizy z zestawu ELISA. Po tym zmierz poziomy GFP za pomocą biotynilowanych przeciwciał anty-GFP, korzystając z zestawu.Zacznij od całonocnej fiksacji wyciętych ksenoprzeszczepów w paraformaldehydzie. Następnego dnia odwodnij i zatop w parafinie ufiksowane ksenoprzeszczepy. Najpierw umieść je w kasetkach.Następnie poddaj kasety działaniu serii alkoholi o malejącym stężeniu. Każda kąpiel powinna trwać pełną godzinę, a proces należy zakończyć odlewaniem w parafinie. Następnie, przy użyciu laboratoryjnego mikrotomu obrotowego, wykonaj skrawki ksenoprzeszczepów o grubości 5 µm i pozostaw zebrane skrawki parafinowe na szkiełkach przedmiotowych w temperaturze 56 °C przez całą noc w celu ich utrwalenia.Następnego dnia odparafinizować skrawki, stosując malejący szereg stężeń alkoholu, a następnie wodę dwukrotnie destylowaną. Preparat powinien pozostawać w każdej kąpieli przez dokładnie 10 minut. Następnie, zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadzić inkubację z odpowiednimi przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi oraz wykonać detekcję kolorymetryczną z użyciem enzymu i substratu. Po barwieniu przeciwciałami wykonać kontrastowanie hematyną i zamontować skrawki w syntetycznym medium montującym.Dwie linie komórkowe szpiczaka mnogiego wykazujące ekspresję EGFP. Linie komórkowe utworzono i hodowano przez trzy dni w obecności leku. Komórki nowotworowe traktowane bortedzomibem oraz steroidami zwizualizowano następnie poprzez analizę ekspresji GFP pod stereomikroskopem fluorescencyjnym.Masę komórek nowotworowych po leczeniu lekiem określono po homogenizacji PHE i pomiarze zawartości EGFP za pomocą testu GFP ELISA. W innym eksperymencie embriony kurcząt w trzecim dniu rozwoju hodowano ex ovo przez sześć dni. W dziewiątym dniu przeszczepiono PHE komórek szpiczaka mnogiego.Do każdego embrionu przymocowano cztery szczepy roślinne. Substancję docelową, bortezomib, zastosowano miejscowo w stężeniu 1 mol; po pięciu dniach w roślinach utworzyły się guzy w porównaniu z grupami kontrolnymi. Bortezomib zahamował wzrost komórek szpiczaka mnogiego w szczepach, co potwierdzono poprzez wizualizację fluorescencyjnej masy guza.Pojedyncze przeszczepy od trzech różnych zwierząt zostały następnie wycięte, homogenizowane, a następnie poddane analizie GFP Eliza. W porównaniu z grupami kontrolnymi, tkanki traktowane bortezomibem wykazały znacznie mniejszą masę komórek szpiczaka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentów z wykorzystaniem hodowli wybranych komórek nowotworowych w embrionach kurcząt w celu analizy wzrostu, genezy guza oraz jego inwazji w tkanki gospodarza po jego rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny szpiczaka mnogiego do eksploracji nowych związków lub leków w łatwym w obsłudze organizmie modelowym, co jest niezbędne w przedklinicznych badaniach leków.

establishment-human-multiple-myeloma-xenograft-model-chicken-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ustanowienie modelu ksenografii ludzkiego mięsaka wielomielowego u kurczaków w celu badania wzrostu guza, inwazji i angiogeneszy

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Ten film demonstruje procedurę dożylnego wstrzykiwania komórek rakowych do naczyń krwionośnych błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu wygenerowania modelu przerzutów raka CAM. Wstrzyknięte komórki ostatecznie tworzą rozproszone kolonie pojedynczych komórek nowotworowych, co pozwala na badanie inwazji raka i przerzutów.

Dożylne wstrzyknięcie komórek rakowych do naczyń błony moczowo-omoczniowej kurczaka: procedura mająca na celu ustalenie modelu raka błony moczowo-omoczniowej w celu zbadania inwazji raka i przerzutów

Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka.  Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza.  Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.

Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest niedoszczepiona immunologicznie i wysoce unaczyniona, co czyni ją naturalnym modelem in vivo wzrostu guza i angiogenezy. W tym protokole opisujemy wiarygodną metodę hodowli trójwymiarowych, unaczynionych guzów raka wątrobowokomórkowego (HCC) za pomocą testu CAM.

Test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (CAM) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

Protokół ten opisuje ksenoprzeszczep in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, który występuje 4 dni po wstrzyknięciu.

In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)

Poznaj model ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt do badania wzrostu guza, inwazji i angiogenezy. Ta metoda umożliwia szybki przesiew leków przeciwnowotworowych w żywym układzie 3D.

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Przeglądaj więcej filmów