Labirynt Double-H: solidny test behawioralny do uczenia się i pamięci u gryzoni
8 lipca 2015
Celem tego protokołu jest zbadanie poznania przestrzennego u gryzoni. Wodny labirynt z podwójnym H to nowatorski test, który jest szczególnie przydatny do wyjaśnienia różnych elementów uczenia się, konsolidacji i pamięci, a także wzajemnego oddziaływania systemów pamięci.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie przestrzennej pamięci roboczej i gryzoni oraz ocena ich strategii uczenia się i zachowania. Osiąga się to poprzez najpierw skonstruowanie labiryntu z podwójnym H w celu oceny wydajności uczenia się i pamięci. W drugim kroku zwierzęta są przyzwyczajane do środowiska labiryntu przed treningiem behawioralnym.
Następnie zwierzęta są codziennie szkolone w labiryncie przy użyciu egocentrycznego paradygmatu uczenia się, aby rozwinąć nawykową reakcję. Alternatywnie, paradygmat allocentryczny może być wykorzystany do opracowania odpowiedzi miejsca. Ostatnim krokiem jest ocena strategii uczenia się zwierzęcia w próbie sondowej, w której jego pozycja wyjściowa jest zmieniana, a wzorzec usuwany.
Wyniki dają wgląd w wybór strategii uczenia się stosowanej w labiryncie na podstawie nagrań zachowań zwierząt. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ośmioramienny labirynt radiowy lub labirynt Morris Water, jest to, że można ją szybko zdobyć w ciągu zaledwie dwóch dni i pozwala eksperymentatorowi ukierunkować rodzaj strategii, której zwierzę ma się nauczyć. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zachowania, takie jak dynamiczne oddziaływanie między systemami pamięci proceduralnej i deklaratywnej oraz sposób, w jaki różne metody leczenia wpływają na te systemy.
Procedurę tę zademonstruje dr Richard Pinnell, doktor habilitowany z laboratorium systemów neuroelektronicznych. Pierwszym krokiem jest skonstruowanie labiryntu z podwójnym H. Labirynt składa się z centralnej alejki przeciętej trzema równoległymi ramionami.
Każdy korytarz ma 20 centymetrów szerokości i jest otoczony wysokimi przezroczystymi ścianami z pleksi. Ściany są zabezpieczone specjalnym klejem, na przykład agri fix i oraz uszczelnione pod wszystkimi kątami wewnętrznymi. Najpierw pleksi jest przycinana na wymiar, a wewnętrzne połączenia są zakleszczane.
Ochronna powłoka z tworzywa sztucznego jest usuwana w pobliżu klejonej złącza, a wszystkie cząsteczki kurzu są usuwane za pomocą rozpuszczalnika czyszczącego. Obie strony są umieszczone w formie pod kątem 90 stopni, a do uszczelnienia końców służy specjalna taśma, aby zapobiec wyciekaniu kleju. Podczas procesu utwardzania klej przygotowuje się przez zmieszanie środka polimeryzującego i delikatnie miesza, klej Croix nakłada się za pomocą strzykawki napędzanej powietrzem.
Złącze jest następnie mocowane i impregnowane i pozostawia się do utwardzenia. W labiryncie należy umieścić odpływ w celu drenażu. Umieść labirynt na stole, który umożliwia dostęp ze wszystkich stron.
Dobrze skontrastowane wskazówki powinny być umieszczone na otaczających ścianach. Następnie oznacz ramiona północne i południowe w celu orientacji później podczas analizy wideo. Na koniec umieść kamerę nad labiryntem, aby przeprowadzić analizę zachowania zwierząt po teście.
Włącz kamerę, aby rejestrować ruchy zwierzęcia przed każdą próbą. Aby przygotować się do fazy przedtreningowej, napełnij labirynt przezroczystą wodą do przybliżonej wysokości 17 centymetrów. Trening wstępny może odbyć się dzień przed sesjami treningowymi lub tego samego dnia, w którym odbywają się sesje treningowe.
Utrzymuj temperaturę wody między 21 a 23 stopniami Celsjusza, aby zachęcić szczury do szukania platformy ewakuacyjnej. Napełnij labirynt wodą dzień przed badaniem, aby temperatura wody się ustabilizowała. Niezależnie od pozycji startowej, zawsze blokuj wejście do przeciwległego ramienia przezroczystymi drzwiami gilotyny.
Kiedy będziesz gotowy, uwolnij szczura z końca jednego ze środkowych ramion. Po dotarciu na platformę ewakuacyjną pozwól szczurowi odpocząć i obserwować otoczenie przez około 15 sekund. Wykonaj cztery kolejne próby z co najmniej 10-sekundowym odpoczynkiem między próbami.
Aby rozpocząć trening, przenieś platformę ewakuacyjną z pozycji przedtreningowej na wybrane ramię i dodaj wodę, aby zanurzyć platformę na jeden centymetr poniżej powierzchni wody. Następnie spraw, aby woda była nieprzezroczysta, mieszając z 250 gramami odtłuszczonego mleka w proszku. Najpierw wymieszaj mleko w proszku i wodę w osobnej butelce i rozprowadź tę mieszaninę w kilku miejscach w labiryncie.
Mieszanie pomoże szybciej osiągnąć jednorodność w wodzie labiryntu. Wypuść szczury ze środkowej alejki, jak pokazano wcześniej, upewniając się, że wejście do przeciwległego ramienia jest zablokowane. Po wypuszczeniu obserwuj zachowanie zwierzęcia i nagrywaj jego zachowanie ręcznie lub za pomocą kamery wideo.
Jeśli platforma docelowa nie zostanie osiągnięta w ciągu 60 sekund, delikatnie poprowadź szczura na platformę ewakuacyjną i pozwól szczurowi odpocząć i obserwować otoczenie. Przez około 15 sekund szczur jest następnie usuwany i spulchniany suszony ręcznikiem przed następną próbą. Jest to ważne, aby szczury nie były zbyt schłodzone przez następne cztery dni.
Postępuj zgodnie z podstawowym protokołem treningowym. Wypuść szczury z północnego lub południowego ramienia startowego w nieprzewidywalnej kolejności, tak aby obie ręce były używane dwukrotnie. Usuń platformę ewakuacyjną, aby przeprowadzić próby sondy w szóstym dniu.
Uwolnij szczura z innego ramienia niż to, które było używane podczas treningu. Na przykład, jeśli szczur zostanie wypuszczony w północnym ramieniu uwolnionym z północno-wschodniego ramienia z zamkniętym południowo-wschodnim ramieniem, pozwól szczurowi pływać przez maksymalnie 60 sekund. Uwolnij szczura z tego samego ramienia startowego dla każdej z czterech prób treningowych dziennie.
Szóstego dnia usuń platformę ewakuacyjną na czas próby sondy. Uwolnij szczura z innego ramienia niż to, w którym został uwolniony podczas próby. Pozwól szczurom pływać przez 60 sekund.
Po przetestowaniu. Przeglądaj nagrania wykonane z kamery nad głową, ręcznie śledź reakcje, opóźnienia, błędy początkowe i powtarzalne, pierwsze wybory i typy odpowiedzi. Na koniec przeprowadź analizę statystyczną dotyczącą błędów odpowiedzi, opóźnień do osiągnięcia celu i czasu spędzonego w ramieniu docelowym.
Na tym diagramie strefy błędów labiryntu są podświetlone na szaro, a zamknięte ramiona są podświetlone na czarno zarówno dla południowej, jak i północnej pozycji startowej. Zakreskowana linia przedstawia przykładową ścieżkę pływania, w której szczur odwiedza wszystkie cztery strefy błędu. Przed dotarciem na platformę ewakuacyjną te reprezentatywne ślady pływania obrazują ruch podczas próby sondy.
Po treningu allocentrycznym, po treningu egocentrycznym, szczury trenują, aby zacząć od północnego lub południowego ramienia, głównie reakcji proceduralnych, gdy ich pozycja początkowa jest przesunięta w lewo. Jednak szczury, które miały ramię startowe obrócone o 180 stopni, wykazywały większą liczbę reakcji w miejscu. Odpowiedzi, które zostały albo złożone, albo odpowiedzi proceduralne zostały oznaczone jako inne typowe ścieżki pływackie, są pokazane zarówno dla grup pozorowanych operacji, jak i noworodków z uszkodzeniem brzusznego hipokampa podczas fazy treningu.
Zwróć uwagę na różnicę w wydajności. Podczas czwartej próby treningowej podczas sesji sondy, pierwotne ramię startowe zostało zamknięte, a szczury zostały wypuszczone z ramienia południowo-zachodniego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż pięć minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o codziennej wymianie wody z mlekiem, w przeciwnym razie stanie się ona zjełczała. Od czasu opracowania, procedura ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się zachowaniem do badania proceduralnych i deklaratywnych systemów pamięci u przebudzonych zwierząt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół bada poznanie przestrzenne u gryzoni z wykorzystaniem labiryntu wodnego w kształcie podwójnego litery H. Jego celem jest wyjaśnienie komponentów uczenia się, konsolidacji i pamięci, a także współoddziaływania systemów pamięciowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Psychologia behawioralna
- Kognitywistyka
Wstęp
- Przestrzenna pamięć robocza ma kluczowe znaczenie dla nawigacji i przetrwania.
- Gryzonie są powszechnie wykorzystywane do modelowania funkcji poznawczych.
- Labirynt w kształcie litery H (double-H maze) jest nowatorskim narzędziem do oceny sprawności pamięci.
- Zrozumienie systemów pamięci może pomóc w opracowaniu metod leczenia zaburzeń poznawczych.
Cel badania
- Badanie przestrzennej pamięci roboczej u gryzoni.
- Ocena strategii uczenia się i behawioralnych w kontrolowanym środowisku.
- Rozróżnienie między paradygmatami uczenia się egocentrycznego i allocentrycznego.
Zastosowane metody
- Budowa labiryntu w kształcie podwójnego H do testów.
- Habituacja zwierząt do środowiska labiryntu.
- Codzienny trening z wykorzystaniem paradygmatu uczenia się egocentrycznego.
- Próby badawcze w celu oceny strategii uczenia się poprzez zmianę pozycji startowych.
Główne wyniki
- Gryzonie wykazały odmienne strategie uczenia się w zależności od zastosowanego paradygmatu.
- Wyniki w próbach badawczych (probe trials) różniły się znacząco.
- Otrzymane wyniki przyczyniają się do zrozumienia systemów pamięci u gryzoni.
- Wyniki mogą mieć znaczenie dla badań nad procesami poznawczymi u ludzi.
Wnioski
- Labirynt w kształcie podwójnego H jest skuteczny w badaniu poznania przestrzennego.
- Różne paradygmaty uczenia się wywołują zróżnicowane reakcje behawioralne.
- Dalsze badania są niezbędne do zgłębienia mechanizmów leżących u podstaw tych zjawisk.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Labirynt w kształcie podwójnego litery H umożliwia precyzyjne kontrolowanie przydzielania strategii uczenia się w modelach gryzoni, rozwiązując kluczowy problem w testach poznawania przestrzennego, gdzie zmienność strategii utrudnia interpretację wyników. Możliwość ta wspomaga mechanistyczną redukcję ryzyka podczas walidacji celu, pozwalając badaczom wyizolować wkład pamięci egocentrycznej względem allocentrycznej, co zwiększa wiarygodność predykcyjną w przedklinicznych badaniach przesiewowych funkcji poznawczych. Szybki czas nabywania umiejętności w tym teście (już w dwa dni) oraz kompatybilność z perturbacjami farmakologicznymi lub genetycznymi sprawiają, że jest on skalowalnym narzędziem w procesach wczesnego odkrywania leków, skoncentrowanych na modulacji systemów pamięci.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez stosowanie specyficznych strategii uczenia się (allocentrycznych lub egocentrycznych) w celu wyizolowania wkładu poszczególnych systemów pamięci.
- Wartość operacyjna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w odczytach behawioralnych, co pozwala na dokładniejszą ocenę stopnia zaangażowania celu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia selekcję projektów w portfolio poprzez rozróżnianie związków, które selektywnie modulują szlaki pamięci proceduralnej w stosunku do deklaratywnej.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych, specyficznych dla strategii odczytów (opóźnienia, rodzaje błędów, preferencje ramienia), odpowiednich do przesiewów o wysokiej zawartości danych (high-content screening).
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowane protokoły treningu i prób z sondą zwiększają powtarzalność między laboratoriami i kampaniami przesiewowymi.
- Wartość strategiczna: Kompatybilność z nieprzejrzystą wodą (np. mlekiem odtłuszczonym) w celu zapobiegania poleganiu na wskazówkach wizualnych, co zapewnia poprawność testu podczas przesiewania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje dynamiczne oddziaływanie między proceduralnymi a deklaratywnymi systemami pamięci, co ma znaczenie dla mechanizmów chorób neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Stabilne formowanie śladu pamięciowego pozwala na spójne testowanie podłużne w różnych fazach leczenia.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko poprzez identyfikację związków, które różnie wpływają na systemy pamięci, przed kosztownymi badaniami w późniejszych etapach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Labirynt typu podwójne H wpisuje się w ciąg procesów badawczych, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, w szczególności w przypadku celów poznawczych, gdzie kluczowym wyróżnikiem jest selektywność układów pamięci.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących wkładu systemów pamięci poprzez umożliwienie kierowanej przez eksperymentatora alokacji strategii podczas treningu.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników behawioralnych (latencja ucieczki, wejścia do ramion, wzorce błędów), które ułatwiają porównywanie związków i potwierdzanie trafień.
- Analityka: Generuje analizowalne punkty końcowe, takie jak latencje reakcji, błędy początkowe i powtarzalne oraz wybór pierwszego ramienia, co służy do statystycznej oceny zmian w strategiach uczenia się.
- Badania translacyjne: Modeluje znaczenie translacyjne poprzez badanie interakcji między systemami allocentrycznymi a egocentrycznymi, co odzwierciedla kliniczne oceny domen pamięci.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Projekt platformy pozwala na ponowne wykorzystanie w wielu badaniach przy minimalnej rekonfiguracji, wspierając podłużne kampanie przesiewowe lub kampanie obejmujące wiele związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję zmiennych zakłócających wynikających z niekontrolowanych strategii uczenia się w zadaniach dotyczących pamięci przestrzennej.
- Wartość operacyjna: Wysoka powtarzalność dzięki standaryzowanej konstrukcji labiryntu, kontroli mętności wody i zdefiniowanej strukturze prób.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji go/no-go poprzez izolację efektów w konkretnych domenach poznawczych, co redukuje liczbę odrzuceń na późnych etapach badań wynikających z nieoczekiwanych interakcji systemów pamięci.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków w oparciu o mechanizm działania, celując w konkretne ścieżki pamięci, co poprawia efektywność kapitałową w odkrywaniu leków na schorzenia OUN.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu neuronauki behawioralnej oraz systemów śledzenia wideo w celu dokładnej kwantyfikacji wyników.
- Metoda zależy od precyzyjnego wykonania przezroczystego labiryntu z pleksiglasu z uszczelnionymi połączeniami i odpływem, aby zapobiec wyciekom i zapewnić przejrzystość optyczną.
- Konieczna jest stała kontrola temperatury wody (21–23°C) oraz codzienna wymiana nieprzezroczystego roztworu mleka odtłuszczonego w celu zachowania ważności testu i dobrostanu zwierząt.
- Wymagane jest zbalansowanie pozycji startowych i przydziału ramion podczas treningu i prób badawczych, aby uniknąć zakłóceń wynikających z uczenia się miejsca.
- Metoda jest ograniczona do gatunków gryzoni (szczurów/myszy) ze względu na wymiary labiryntu i motywację do ucieczki z wody; nie jest bezpośrednio skalowalna dla gatunków wyższego rzędu bez zmiany projektu.
