Name: Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę tworzenia mammosfer z tkanek raka piersi i linii komórkowych w celu oceny zdolności samoodnawiania komórek macierzystych. Technika ta pozwala ilościowo oszacować potencjał nowotworowy próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Imperial BRC, National Institute for Health Research i Action Against Cancer, ze szczególnym uwzględnieniem Hilary Craft i Sir Douglasa Myersa.

Poniższe procedury zostały etycznie zatwierdzone przez Imperial College w Londynie.
1. Generowanie pierwotnych mammosfer z linii komórkowych ludzkiego raka piersi
UWAGA: Wykonaj następujące kroki pod sterylnym kapturem hodowlanym.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę Mammosphere zawierającą DMEM/F12 uzupełnioną o 2 mM L-glutaminę, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny. Przygotować kompletną pożywkę bezpośrednio przed użyciem, dodając 20 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinowany ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF; R&D Systems) oraz 1x suplement B27.</li>
	<li>Odessać pożywkę z kolby zawierającej przylegające komórki MCF-7 lub MDA-MB-231 (lub wybraną linię komórkową raka piersi; 70-80% konfluencji), przemyć dwukrotnie w 1x PBS i trypsynizować komórki.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1-5 ml pożywki mammosferowej. Pipetować w górę i w dół, a w razie potrzeby użyć filtra siatkowego o wielkości 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Użyj hemocytometru, aby upewnić się, że utworzyła się zawiesina pojedynczej komórki (jeśli nie, użyj igły 25 G, aby strzykawką zawiesinę komórek do 3 razy).</li>
	<li>W razie potrzeby wyizolować podzbiór komórkowy CD44 + CD24- za pomocą FACS przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-CD24-fikoerytryny (PE) i izotiocyjanianu anty-CD44-fluoresceiny (FITC)9. Alternatywnie, wyizoluj taką populację za pomocą systemu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) z mikrogranulkami połączonymi anty-CD44 i anty-CD24-biotyną zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadź selekcję pozytywną za pomocą kolumn LS i selekcję negatywną za pomocą kolumn LD i potwierdź fenotypy wszystkich izolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej17.</li>
	<li>Oblicz liczbę żywotnych komórek na ml za pomocą błękitu trypanowego. 
	UWAGA: Żywotność komórek oblicza się jako liczbę żywotnych komórek podzieloną przez całkowitą liczbę komórek w siatkach na hemocytometrze. Komórki, które pobierają błękit trypanowy, są uważane za niezdolne do życia. Poniższa procedura służy do dokładnego określenia proporcji żywotnych komórek.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,4% roztwór błękitu trypanowego w PBS. Dodać 0,1 ml roztworu podstawowego błękitu trypanowego do 1 ml komórek. Załaduj hemocytometr i zbadaj natychmiast pod mikroskopem w małym powiększeniu. Policz łączną liczbę komórek i liczbę niebieskich komórek barwiących. 
		Żywe komórki = [1.00 – (Liczba niebieskich komórek ÷ Liczba wszystkich komórek)] × 100.</li>
		<li>Aby obliczyć liczbę żywotnych komórek na ml hodowli, skorzystaj z poniższego wzoru. Należy pamiętać o skorygowaniu współczynnika rozcieńczenia. 
		Liczba komórek zdolnych do życia × 104 × 1,1 = komórki/ml hodowli</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić wcześniej określoną ilość komórek w 2 ml kompletnej pożywki mammosfery w każdym dołku 6-dołkowej płytki o bardzo niskiej przyczepności. Gęstość wysiewu wynosi zwykle 500-4,000 komórek/cm2 komórki na studzienkę. Opcjonalnie należy użyć 24-dołkowych płytek o niskim natężeniu podczas wysiewu komórek o tej samej gęstości w 0,5 ml pożywki. 
	UWAGA: Zalecamy optymalizację gęstości wysiewu i czasu hodowli dla każdej interesującej nas linii komórkowej.</li>
	<li>Inkubować 6-dołkowe płytki o bardzo niskim przyczepie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5-10 dni (w zależności od linii komórkowej i wielkości mammosfery) bez naruszania płytek, szczególnie w fazie wzrostu pierwszych 5 dni.</li>
</ol>
2. Generowanie pierwotnych mammosfer z próbek klinicznych ludzkiego raka piersi
UWAGA: Ludzka tkanka raka piersi może być pobrana od pacjentek poddawanych operacji usunięcia guzów piersi. Przechowywać tkankę na lodzie do 24 godzin w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml w pożywkach hodowlanych zawierających 100 j./ml penicyliny i 100 j./ml streptomycyny. Wykonaj następujące czynności pod sterylnym kapturem hodowlanym.
<ol>
	<li>Przenieść próbkę na 100-milimetrową szalkę Petriego z tkanką o małej objętości podłoża. Usuń tkankę tłuszczową za pomocą sterylnych nożyczek, skwinu i pęsety.</li>
	<li>Dodać 2-3 ml DMEM/F12 i zmielić próbkę na1 mm 3 kawałki za pomocą sterylnego skletu lub żyletki, aż nie pozostaną żadne duże kawałki.</li>
	<li>Zawiesić fragmenty tkanek we wstępnie podgrzanym 10 ml DMEM zawierającym enzymy proteolityczne (3 000 U/ml kolagenazy i 1 000 U/ml hialuronidazy) i inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce obrotowej, aż wszystkie fragmenty tkanki zostaną strawione. Zazwyczaj całkowite trawienie trwa od 1 do 3 godzin. Dostosuj czas trawienia do patologicznych cech nowotworów. (Na przykład gruczolakorak piersi jest zwykle trudniejszy do strawienia w porównaniu z rakiem śluzowym, który jest bardziej kruchy i wymaga krótszego czasu trawienia). Oceniaj stopień trawienia co 1/2 godziny, obserwując 20 μl zawiesiny pod hemocytometrem.</li>
	<li>Pozostawić fragmenty do osadzenia się na 5 minut, następnie przenieść supernatant do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1-5 ml pożywki mammosferowej.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami 1.1-1.4 opisanymi powyżej, aby linie komórkowe otrzymały i pokryły zawiesiny pojedynczych komórek. Przepuścić komórki przez strzykawkę 25 G maksymalnie 2 razy, jeśli to konieczne, aby ograniczyć uszkodzenia komórek.</li>
</ol>
3. Obliczanie wydajności formowania mammosfery (%)
<ol>
	<li>Po okresie hodowli policz średnicę mammosfer (większych niż 40 μm) pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu. Zobrazuj cyfrowo 5 losowych pól za pomocą kamery cyfrowej na mikroskopie świetlnym i określ rozmiar mammosfery za pomocą oprogramowania do akwizycji. Użyj dowolnego oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	<li>Obliczać Wydajność formowania mammosfery (MFE%) za pomocą następującego równania: 
	MFE (%) = (# komórek zasianych na studzienkę) / (# komórek zasianych na studzienkę) x 100</li>
</ol>
4. Seryjne przechodzenie mammosfer do oceny samoodnawiania
<ol>
	<li>Odpipetować pożywkę zawierającą mammosfery z każdej studzienki do probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienki PBS i dodaj do zebranej pożywki. Wirować przy 115 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl wstępnie podgrzanego 0,5% trypsyny/0,2% EDTA. Inkubować przez 2-3 minuty.</li>
	<li>Dodaj 500 μl FCS, aby zneutralizować trypsynę. Wirować przy 500 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl pożywki mammosfery, pipetując w górę i w dół do zdezagregowanych kulek.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ, czy komórki są w zawiesinie pojedynczej komórki. Jeśli nie, należy przepuścić przez strzykawkę 25 G do 3 razy, aby uzyskać pojedyncze komórki. Wysiewaj komórki na nową, 6-dołkową płytkę o bardzo niskim przyczepie o tej samej gęstości, co w pokoleniu pierwotnym.</li>
	<li>Po 5-10 dniach policz kule >40 μm i oblicz wydajność formowania kuli, korzystając ze wzoru podanego wcześniej.</li>
</ol>

<ol><li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epigenetic+switch+involving+NF-kappaB%2C+Lin28%2C+Let-7+MicroRNA%2C+and+IL6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6.</a> Cell. 139 (4), 693-706 (2009).</li>
<li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+formation+of+breast+cancer+stem+cells+and+their+dynamic+equilibrium+with+non-stem+cancer+cells+via+IL6+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).</li>
<li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+current+status+and+evolving+complexities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: current status and evolving complexities.</a> Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).</li>
<li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+cancer+stem+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm.</a> Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).</li>
<li>Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL6-mediated+suppression+of+miR-200c+directs+constitutive+activation+of+inflammatory+signaling+circuit+driving+transformation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis.</a> Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).</li>
<li>Chen, J., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li>
<li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li>
<li>Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li>
<li>Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Ginestier, C., Hur, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Liu, S., Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 
 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558</a> 1707-1710 (1992).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3A+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem+%2F+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells.</a> Genes Dev. , 1253-1270 (2003).</li>
<li>Ponti, D., Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).</li>
<li>Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+breast+cancer+stem+cells+by+knockdown+of+CD44%3A+promising+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy.</a> J Transl Med. 9 (1), 209(2011).</li>
<li>Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+in+breast+carcinoma+cell+lines+depends+upon+expression+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin.</a> PloS one. 8 (10), e77281(2013).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%E2%80%99t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+mammary+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of mammary gland stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Al-Hajj, M., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+solid+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and solid tumor stem cells.</a> Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).</li>
<li>Yu, F., Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((let-7+regulates+self+renewal+and+tumorigenicity+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.</a> Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów, który mógłby być postrzegany jako przesądzający o bezstronności tego artykułu.

Skuteczna ocena mammosfer pierwotnych i wtórnych opiera się na posiewaniu komórek w wystarczająco niskiej gęstości, aby mammosfery tworzyły się z pojedynczych klonów, przy minimalnej agregacji sfer. Jednak przy zbyt niskich gęstościach może powstać zbyt mało mammosfer, aby statystycznie odróżnić efekty leczenia. Gęstość wysiewu powinna być zoptymalizowana dla każdej użytej linii komórkowej, ponieważ mogą się one znacznie różnić pod względem wydajności tworzenia sfery (te wykazujące niską ekspresję E-kadheryny mogą tworzy...

Istnienie linii komórek nowotworowych, na czele z komórkami macierzystymi podobnymi do nowotworów macierzystych, znacznie wzbogaciło nasze zrozumienie heterogeniczności nowotworów. Podczas gdy pewna różnorodność fenotypowa nowotworów wynika z klonalnego wyrastania genetycznie odrębnych klonów, istotny składnik wydaje się wynikać z różnic epigenetycznych: komórki rakowe mogą przechodzić (czasami odwracalnie) między stanami macierzystymi, progenitorowymi i zróżnicowanymi poprzez aktywację lub represję określonych programów ekspresji genów 1-3. Może to odzwierciedlać wewnętrzne lub zewnętrzne czynniki komórki, odzwierciedlające program ekspresji genów obecnie wyrażany w komórce z wynikającą z tego sygnalizacją autokrynną w połączeniu z sygnalizacją parakrynną z sąsiedniego raka, komórek zrębowych lub odpornościowych dostarczających czynniki modulujące oraz warunków mikrośrodowiskowych, takich jak stopień niedotlenienia2,4,5.
Chociaż innowacyjne metody śledzenia linii produkcyjnej zwiększają naszą zdolność do badania domniemanych komórek macierzystych raka w ich niszy in vivo 6-8, testy formowania kulek pozostają popularnym i wygodnym podejściem do szacowania potencjału komórek raka piersi do zachowywania się jak komórki macierzyste, przynajmniej w stosowanych warunkach testowych. Jest często stosowany wraz z retrospektywnymi metodami oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych, poprzez ekspresję markerów błonowych CD44 i CD249 oraz poziomów aktywności enzymu ALDH (dehydrogenazy aldehydowej)10, markerów, które zaproponowano jako odpowiadające odpowiednio bardziej mezenchymalnym i nabłonkowym komórkom macierzystym raka11. Podejście do tworzenia kuli zostało po raz pierwszy opracowane jako test neurosfery, umożliwiający wzrost przypuszczalnych komórek macierzystych z pojedynczych klonów w nieprzylegających warunkach wolnych od surowicy z dodatkiem nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF)12, a następnie z pożytkiem zastosowano je do normalnych i nowotworowych tkanek piersi.
Tożsamość komórki założycielskiej tworzącej sferę, oraz mieszane typy komórek tworzące masę kuli, są istotne dla wniosków, które można wyciągnąć z testów formowania mammo- lub innych sfer. Długotrwałe komórki macierzyste w stanie spoczynku, o których sądzi się, że spoczywają w fazie G0, nie doświadczą precyzyjnej kombinacji czynników, które sprzyjałyby aktywacji in vivo. Zamiast tego test mammosfery umożliwia wzrost komórek albo gotowych do podziału mitotycznego, albo już dzielących13. Te komórki progenitorowe, choć nie są naprawdę spokojne, mogą być etapem komórki, który proliferuje z mitogenami EGF i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) stosowanymi w teście. Niemniej jednak zawierają one szereg aktywowanych szlaków sygnałowych związanych z komórkami macierzystymi14. Ponadto szybkość ich powstawania odnosi się do rakotwórczości tkanki, z której zostały pobrane, mierzonej ich siłą działania w testach o ograniczonym rozcieńczeniu w ksenoprzeszczepach myszy2,15,16.
Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły izolowania pojedynczych komórek i generowania pierwotnych mammosfer zarówno z ludzkich linii komórkowych raka piersi, jak i klinicznych próbek guzów piersi. Opisujemy również, jak wykonywać seryjne przejścia pierwotnych mammosfer w celu oceny samoodnawiania się oraz jak obliczać wydajność formowania kul, która umożliwia porównanie między różnymi gęstościami wysiewu (patrz schemat na rysunku 1).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml Penicylina & Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Rekombinowany ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>R& Systemy D</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x suplement B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0,5% trypsyna/0,2% EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe o niskim nasadce</td><td>Corning</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ 1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne żyletki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny skalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne mikropreparowanie nożyczki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Podobnie jak w przypadku zdrowych tkanek, wiele nowotworów krwi i litych jest obecnie uważanych za zorganizowane hierarchicznie, z podzbiorem komórek rakowych podobnych do macierzystych, które same się odnawiają, dając początek bardziej zróżnicowanemu potomstwu. Zrozumienie i ukierunkowanie tych nowotworowych komórek macierzystych w raku piersi, które mogą mieć zwiększoną oporność na chemo- i promieniowanie w porównaniu z masą guza innego niż macierzysty, stało się ważnym obszarem badawczym. Markery, w tym aktywność CD44, CD24 i ALDH, można ocenić za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu prospektywnego wyizolowania komórek, które wykazują zwiększoną rakotwórczość po wszczepieniu myszom z obniżoną odpornością: test mammosfery stał się również szeroko stosowany ze względu na jego zdolność do retrospektywnej identyfikacji komórek tworzących kule, które rozwijają się z klonów podobnych do pojedynczych komórek macierzystych. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do odpowiedniego hodowania mammosfer z linii komórkowych lub pierwotnych próbek pacjentów, ich pasażowania oraz obliczeń w celu oszacowania wydajności formowania kul (SFE). Najpierw omówimy kluczowe kwestie i pułapki związane z właściwym planowaniem i interpretacją eksperymentów z mammosferą.

Różne próbki lub próbki poddane różnym działaniom mogą różnić się liczbą mammosfer o średnicy &gt;40 µm, które powstają po normalizacji względem początkowej liczby wysianych komórek. Oblicz efektywność tworzenia mammosfer (MFE) dla każdej grupy traktowanej, hodując je w trzech powtórzeniach. Pozwala to na porównanie eksperymentów o różnych gęstościach wysiewu. Dane najlepiej przedstawić na wykresie słupkowym, najlepiej z kontrolami pozytywną i negatywną, z zaznaczeniem odchylenia standardowego dla trzech powtórzeń. Komór...

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom. Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest oszacowanie proporcji komórek macierzystych w linii komórek nowotworowych lub próbce tkanki guza oraz ocena ich zdolności do samoodnowy w kolejnych pasażach. W tym celu linia komórek nowotworowych lub tkanka guza są przetwarzane w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, która następnie jest sortowana w celu wyizolowania podgrup komórkowych CD 44 dodatnich i CD 24 ujemnych. Komórki są wysiewane na płytki o niskim powinowactwie, pozostawione na czas wzrostu, a następnie badane pod mikroskopem świetlnym pod kątem tworzenia sfer.Wydajność tworzenia sfer określa się poprzez wyznaczenie liczby powstałych sfer w stosunku do liczby pierwotnie wysianych komórek. Proces generowania zawiesiny pojedynczych komórek, zapewnienie czasu na wzrost oraz wyznaczanie wydajności tworzenia sfer jest powtarzany w kolejnych pasażach, co ostatecznie pozwala na ocenę zdolności komórek do samoodnawiania w czasie. Metoda ta stanowi prosty test perspektywiczny służący do identyfikacji komórek wykazujących funkcjonalne właściwości komórek macierzystych, takie jak samoodnawianie, a także pozwala na ilościową ocenę liczby komórek macierzystych pochodzących z guzów in vivo.Głównym założeniem testów tworzenia sfer jest to, że każda sfera pochodzi z pojedynczej komórki, a zatem jest klonalna. Z tych powodów gęstość komórek jest najważniejszym parametrem w tym badaniu, ponieważ ma krytyczny wpływ na wynik. Pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy rozpocząć tę procedurę z komórkami MCF-7 lub MDA-MB-231, które osiągnęły 70 do 80% konfluencji.Odssać pożywkę z kolby i dwukrotnie przemyć komórki roztworem PBS. Następnie dodać trypsynę z EDTA i inkubować od dwóch do sześciu minut; po odklejeniu komórek dodać pożywkę mammosphere zawierającą 10% FBS. Po odklejeniu komórek przenieść je do stożkowatej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 200 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Po odwirowaniu zlej nadosad. Następnie ponownie zawieś komórki w od 1 do 5 ml pożywki manosphere, pipetując roztwór w górę i w dół 10 razy, aby rozbić pellet komórkowy. Następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr doyściejący o rozmiarze oczek 40 µm i zbierz filtrat do dołączonej probówki.Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, nanoszę 20 µL alykwoy resuspenderowanych komórek na cytometr hematologiczny i badam ją pod mikroskopem. Jeśli zaobserwowano skupiska komórek, tak jak pokazano tutaj, należy użyć strzykawki, aby jeden lub dwa razy przepuścić zawiesinę przez igłę o rozmiarze 25 G. Gdy komórki zostaną rozproszone do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, jak pokazano tutaj, należy przejść do izolacji subpopulacji komórek CD44-dodatnich i CD24-ujemnych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) lub sortowania komórek aktywowanego magnetycznie (MACS).Użyć kolumny LS do selekcji pozytywnej komórek CD 44 dodatnich. Ponieważ pożądane komórki przylegają do ścianek kolumny LS, należy odrzucić frakcję przepływową, a następnie usunąć komórki z kolumny. Nalać pięć mililitrów buforu i nacisnąć tłok dołączony do kolumny, aby wypłukać pożądane komórki.Następnie należy wykorzystać kolumnę LD, aby dodatkowo oczyścić populację za pomocą selekcji negatywnej. W tym etapie komórki CD 24 dodatnie przylegają do kolumn LD. Należy zebrać frakcję przepływową, która zawiera komórki CD 24 ujemne.Następnie, za pomocą cytometrii przepływowej, potwierdź fenotypy wszystkich wyizolowanych komórek. Stosując metodę wykluczania błękitu trypanu, oblicz gęstość żywych komórek po odpowiednim rozcieńczeniu zawiesiny komórkowej. W każdym dołku płytki sześcio-dołkowej o ultra-niskim przywieraniu (ultralow attachment) wysiej od 500 do 4 000 komórek cm⁻² w 2 mL kompletnej pożywki do mammosfer.Inkubować płytki, dbając o to, aby ich nie niepokoić, od pięciu do 10 dni, aż do zaobserwowania sfer. Kontynuować hodowlę do momentu, gdy sfery osiągną średnicę co najmniej 40 mikronów, ale nie zaczęły jeszcze przechodzić w stan apoptyczny. Pozyskać tkankę raka piersi u ludzi od pacjentek poddawanych operacjom usunięcia guzów piersi.Przechowywać tkankę w lodzie do 24 godzin w 50 ml sterylnych probówek z DMEM zawierającym 100 units/ml penicyliny i 100 units/ml streptomycyny, pracując w sterylnej komorze do hodowli tkanek.Przenieś próbkę do 100 milimetrowej szalki do hodowli tkanek zawierającej niewielką objętość pożywki, używając sterylnych nożyczek, skalpela i pęsety. Usuń tkankę tłuszczową. Dodaj od dwóch do trzech mililitrów D-M-E-M-F 12 i używając sterylnego skalpela lub żyletki, rozdrobnij próbkę, aż do całkowitego usunięcia dużych fragmentów.Kawałki tkanki umieszczono w 10 mililitrach podgrzanego DMEM zawierającego enzymy proteolityczne i inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze rotacyjnym przez jedną do trzech godzin. Podczas izolowania żywych komórek guza naczelnych przy użyciu enzymów trawiennych istnieje krytyczny kompromis między śmiercią komórek a wystarczającym wydobyciem z macierzy komórkowej. Aby zapewnić sukces, niezbędne jest regularne monitorowanie tego procesu trawienia. Co pół godziny należy nanieść 20 mikrolitrów zawiesiny na hemocytometr i ocenić stopień trawienia za pomocą mikroskopu.Po zakończeniu trawienia należy odstawić fragmenty na pięć minut w celu ich osadzenia. Następnie nadsącz należy przenieść do 15 ml stożkowej probówki z polipropylenu.Wirować z prędkością 200 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu ostrożnie odlać nadsącz i resuspenderować komórki w 1–5 ml pożywki do mammosfer. Następnie przygotować i wysiać zawiesiny pojedynczych komórek zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji.W tym kroku, jeśli jest to konieczne, aby rozproszyć komórki, należy pipetować je w górę i w dół za pomocą strzykawki o rozmiarze 25G maksymalnie dwa razy. Po okresie inkubacji obserwować komórki pod mikroskopem wyposażonym w kamerę cyfrową przy powiększeniu 40x. Wykonać zdjęcia pięciu losowo wybranych pól widzenia.Po wykonaniu wszystkich zdjęć, należy użyć oprogramowania do akwizycji w celu określenia liczby mikrosfer o średnicy większej niż 40 µm. Następnie oblicz wydajność tworzenia metasfer, dzieląc liczbę mamosfer w każdej studzience przez liczbę wysianych w każdej studzience komórek i mnożąc wynik przez 100. Przenieś medium zawierające mamosfery z każdej studzinki do probówki o pojemności 15 ml. Przepłucz każdą studzinkę PBS i dodaj go do zebranego medium.Następnie odwiruj komórki przy 115 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odlej nadosad. Resuspender osad w 500 µL uprzednio ogrzanego roztworu trypsyny-EDTA i inkubuj przez dwie do trzech minut.Po inkubacji dodaj 500 µl FBS, aby zneutralizować trypsynę, a następnie odwiruj przy 500 ×g przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania odlej nadsącz i zresuspenduj osad w 100 µL pożywki do mammosfer, pipetując w górę i w dół w celu rozbicia ewentualnych sfer. Ponownie, używając komory countingowej (hemocytometru), policz komórki i określ, czy uległy one rozproszeniu do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.Jeśli nie, należy przepuścić je do dwóch razy przez igłę o rozmiarze 25 G w celu uzyskania pojedynczych komórek, a następnie wysiać komórki na nową płytkę 6-dołkową o ultraniskiej adhezji z zachowaniem tej samej gęstości, która była stosowana w generacji pierwotnej. Po 5 do 10 dniach należy policzyć sfery o średnicy większej niż 40 µm i obliczyć wydajność tworzenia sfer w sposób opisany wcześniej, aby oszacować efektywność tworzenia sfer. Mammosfery hodowano z nabłonkowych, estrogenowo-dodatnich komórek CF7 oraz mezenchymalnych, potrójnie ujemnych komórek linii MDA 231 zgodnie z opisem w tym filmie. Liczba mammosfer większych niż 40 µm pozwala oszacować wydajność tworzenia sfer dla każdej linii komórkowej.Należy zauważyć, że minimalna agregacja fuzji komórek zaobserwowana w tym przypadku została osiągnięta dzięki wysiewowi o niskiej gęstości: 500 komórek na centymetr kwadratowy dla MCF 7 oraz 1000 komórek na centymetr kwadratowy dla MDA 2 3 1. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak hodować i zliczać mammosfery pochodzące z różnych linii komórkowych lub z chirurgicznych próbek nowotworowych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wysiewać komórki przy niskich gęstościach w celu zapewnienia klonalności, a w przypadku izolowania komórek z próbek chirurgicznych – aby zapewnić wysoką przeżywalność komórek.Oprócz tej procedury należy przeprowadzić inne metody, takie jak wszczepienie populacji komórek ksenogenicznych myszom z niedoborem odporności, aby określić geniczność nowotworową badanych tkanek in vivo.

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test formowania mamosfera z ludzkich tkanek raka piersi i linii komórkowych

Różnicowanie laktogenne komórek HC11 można scharakteryzować poprzez tworzenie się struktur kopułkowatych, określanych jako mammosfery. Struktury te można zliczyć za pomocą mikroskopii fazowej, co ułatwia ilościowe określenie stopnia różnicowania laktogennego.

Mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego

Ten film opisuje izolowanie komórek macierzystych raka piersi od linii komórkowych raka piersi. Hodujemy te nowotworowe komórki macierzyste w celu wygenerowania pierwotnych mammosfer do oceny samoodnawiania się i obliczania wydajności formowania kul, co pozwala na porównanie różnych gęstości wysiewu.

Wytwarzanie mammosfer pierwotnych: technika określania siły działania komórek

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Tutaj opisujemy implementację i interpretację wyników ilościowego testu samoodnawiania mammosfery in vitro.

Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Ten protokół opisuje budowę mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi in vitro przy użyciu pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z gotowych materiałów.

Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Ten protokół opisuje metodę ustawiania assayu formacji mammosfer w celu badania inhibitora apoptozy 5 (Api5) wywołanej skurczliwości komórek macierzystych raka w nienowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Lizat zebrany z mammosfer pierwszej generacji jest analizowany pod kątem różnych markerów skurczliwości w celu oceny indukcji właściwości przypominających komórki macierzyste.

Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi

Poznaj metodę tworzenia mammosfer z tkanek raka piersi i linii komórkowych w celu oceny zdolności samoodnawiania komórek macierzystych. Technika ta pozwala ilościowo oszacować potencjał nowotworowy próbek.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Przeglądaj więcej filmów