Name: Enzymatyczna metoda ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę enzymatyczną ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego przy użyciu urokinazy. Ta technika umożliwia ekspansję MSC bez konieczności ponownego pobierania materiału.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Fundację Narodową Grant CR3I3_140717/1 oraz Szwajcarską Fundację Paraplegiczną.

UWAGA: Ludzkie aspiracje szpiku kostnego z grzebienia biodrowego zostały pobrane od dawców, którzy wyrazili na to zgodę, za zgodą komisji etycznej kantonu Lucerna. Aspiraty szpiku kostnego psów z grzebienia biodrowego zostały pobrane za zgodą właściciela psa. Aspiraty szpiku kostnego u ludzi (ok. 20 ml) i psów (ok. 10 ml) przeciwzakrzepowo podano przez dodanie 15 ml 3,8% cytrynianu sodu natychmiast po odstawieniu na sali operacyjnej. Próbki przeniesiono do środowiska laboratoryjnego w celu przetworzenia tego samego dnia, w którym zostały pobrane.
1. Przygotowanie urokinazy (przed pierwszym użyciem)
<ol>
	<li>Rozpuścić urokinazę przy użyciu sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z instrukcją producenta: Dodać 10 ml PBS do kolby wlotowej przegrody za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Rozpuścić suchą masę przez wirowanie, aby uzyskać 50 000 jednostek iniekcyjnych (U) na ml.</li>
	<li>Przygotować 500 μl podwielokrotności (po 25 000 j. każdy) do sterylnych probówek. Przechowywać porcje w temperaturze -20 °C i używać w razie potrzeby przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Etapy przygotowawcze (przed każdym leczeniem szpikiem kostnym)
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną porcję urokinazy (25 000 j.) na zakrzepły aspirat szpiku kostnego (objętości aspiratu do 25 ml zostały skutecznie leczone przy użyciu pojedynczej podwielokrotności 25 000 j.).</li>
	<li>Podgrzej łaźnię wodną lub inkubator z wytrząsaniem do temperatury 37 °C.</li>
</ol>
3. Enzymatyczne trawienie skrzepu
<ol>
	<li>Wszystkie prace należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologicznego próbek szpiku kostnego podczas przetwarzania. Podczas pracy z potencjalnie zakaźnym materiałem ludzkim zaleca się stosowanie rękawic ochronnych oraz ostrożne obchodzenie się z nim.</li>
	<li>Umieść sitko o pojemności 100 μm na sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie przelej odessany szpik kostny przez sitko komórkowe, przechylając sitko lub poruszając się wokół materiału skrzepu. Użyj sterylnej końcówki pipety, aby uzyskać lepszy przepływ przez siatkę filtracyjną. 
	UWAGA: Należy unikać rozcieńczania skrzepu, np. poprzez przemywanie skrzepu PBS. Urokinaza działa pośrednio i do efektywnego trawienia wymaga składników surowicy (tj. plazminogenu) z biopsji. Kontynuując procedurę z materiałem skrzepowym, filtrat można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia w kroku 3.6.</li>
	<li>Przenieś materiał skrzepu szpiku kostnego do pustego naczynia do hodowli komórek za pomocą sterylnych kleszczy. Pokrój szczątki na małe kawałki o wielkości około 2 mm3 za pomocą sterylnego skalpela.</li>
	<li>Przenieść małe kawałki skrzepu do probówki reakcyjnej o pojemności 50 ml za pomocą sterylnych kleszczyków. Upewnij się, że zmielony skrzep ma mokry wygląd. Jeśli wydaje się, że jest suchy, użyj części filtratu z kroku 3.1, aby zwilżyć.</li>
	<li>Rozcierać skrzep, pipetując w górę i w dół przez 5 razy za pomocą pipety do mikromiareczkowania o pojemności 5 ml. Dodać 1 podwielokrotność urokinazy do próbki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej lub w inkubatorze z wytrząsaniem (delikatnie).</li>
	<li>Rozcierać pipetując w górę i w dół 5 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Inkubować przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji ponownie roztrzeć 5 razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przepuścić przez świeże sitko o wielkości 100 μm do puli z filtratem z kroku 3.2.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze otoczenia przez 10 minut przy 500 x g. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce, jak opisano poniżej lub zgodnie ze standardową procedurą laboratorium dla hodowli ekspansywnej MSC.</li>
</ol>
4. Siew do hodowli komórek ekspansywnych i płytek CFU
<ol>
	<li>Zawiesić komórki (składające się z erytrocytów i komórek jednojądrzastych) w 50 ml podłoża podstawowego: Alpha-MEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny i 2,5 mg/ml amfoterycyny B. Policz komórki rozcieńczone w stosunku 1:10 w roztworze błękitu trypanowego, używając komory Neubauera.</li>
	<li>Umieścić komórki w kolbach do hodowli komórkowych o gęstości 5 x 10 7 komórek/cm2 i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jeśli to możliwe, użyj warunków hipoksyjnych (5% tlenu). Do kontroli testu CFU umieścić 109 komórek w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Po 3 dniach hodowli mezenchymalne komórki macierzyste są przyłączane do naczynia do hodowli komórkowej, podczas gdy inne komórki pozostają w zawiesinie. Zmienić pożywkę na podłoże podstawowe uzupełnione 5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). W przypadku kontroli testu CFU należy traktować szalkę z hodowlą komórkową w podobny sposób.</li>
	<li>Kontynuuj hodowlę komórkową w sumie przez 2 tygodnie, wymieniając pożywkę trzy razy w tygodniu. Jeśli komórki przekraczają 80% zbieżności, podziel je przez trypsynizację. W przypadku kontroli testu CFU należy również wymienić pożywki, ale nie należy dzielić komórek w ciągu dwóch tygodni.</li>
</ol>
5. Barwnik Giemsa do testu CFU
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml roztworu Giemsy na każde naczynie: rozcieńczyć roztwór podstawowy (7,6 g/l Giemsa w glicerolu:metanolu) w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie (zawsze należy przygotować świeże robocze rozcieńczenie).</li>
	<li>Wyjmij pożywkę z naczynia do hodowli komórkowych i umyj komórki PBS. Zachowaj szczególną ostrożność podczas nakładania płynu na szalkę Petriego i unikaj zmywania komórek.</li>
	<li>Utrwalić komórki w czystym metanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć metanol. Dodać roztwór Giemsa i inkubować przez 60 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj dwa razy PBS. Wysuszyć głowicę talerza na powietrzu na ręczniku papierowym. Policz kolonie ręcznie. Najlepiej osiągnąć to za pomocą markera umieszczonego na odwrocie tabliczki.</li>
</ol>
6. Zróżnicowanie MSC
<ol>
	<li>Różnicowanie MSCs u psów 
	UWAGA: Psie MSCs różnicowano na linie chondrogenne, osteogenne i adipogenne poprzez stymulację odpowiednimi pożywkami przez cztery tygodnie.</li>
	<li>W przypadku różnicowania adipogennego należy hodować MSCs w monowarstwie w odległości 4 x 105 komórek/cm2, naprzemiennie w dwóch różnych warunkach hodowli w następujący sposób;
	<ol>
		<li>Hodowla w pożywkach podtrzymujących adipogenezę zawierających DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B i 170 mM insuliny.</li>
		<li>Hodowla w pożywce indukującej adipogenezę z pożywką podtrzymującą uzupełnioną 3% FBS, 5% surowicą króliczą, 1 μM deksametazonem, 500 μM 3-izobutylo-1-metyloksantyną, 33 μM biotyną, 5 μM rozyglitazonem i 17 μM pantotenianem 16.</li>
		<li>Uwolnij kropelki lipidów, barwiąc olejem Red-O. Krótko mówiąc, utrwal komórki 10% formaldehydem, przemyj PBS i zabarwij 0,35% czerwienią olejową O w izopropanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do różnicowania osteogennego hodowla MSCs w monowarstwie w 7 x 103 komórki/cm2 i stymulowanie w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Advanced DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B, 50 μM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego, 10 mM ß-glicerofosforanu i 100 nM deksametazonu.</li>
		<li>Zidentyfikować osady mineralizacji za pomocą barwnika Von Kossa (5 % AgNO3). Krótko mówiąc, utrwalić komórki 10% formaldehydem, przemyć PBS i zabarwić 5% AgNO3w wodzie destylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie chondrogenne
	<ol>
		<li>Wytnij kostki (3 mm z każdej strony) z wyrobu medycznego w kształcie gąbki, utworzonego z liofilizowanego kolagenu typu I i używanego jako materiał rusztowania do podtrzymywania komórek 17.</li>
		<li>Nasiona MSCs na wierzchu kostek w stężeniu 4 x 106 komórek/ml (~70 000 komórek/kostkę).</li>
		<li>Przed dodaniem pożywki pozwól komórkom przylegać do kostek przez 30 minut.</li>
		<li>Utrzymuj konstrukty kolagenu MSC w pożywkach chondrogennych składających się z DMEM/F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B, 40 ng/ml deksametazonu, 50 μg/ml 2-fosforanu kwasu askorbinowego, 50 μg/ml L-proliny, 1x Insulina-Transferyna-Selen X i 10 ng/ml transformującego czynnika wzrostu-β1.</li>
		<li>Użyj barwienia alcian blue, aby uwidocznić akumulację proteoglikanów w sekcjach konstruktów. Krótko zabarwić skrawki O/N 0,4% błękitu alcyjnego rozpuszczonego w 0,01% H2SO4 i 0,5M chlorowodorku guanidyny. Następnie umyj sekcje myto przez 30 min w 40% DMSO i 0,05M MgCl2. Komórki zostały podbarwione ogniem jądrowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).</li>
<li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19(2012).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videos+in+clinical+medicine.+Bone+marrow+aspiration+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy.</a> N Engl J Med. 361 (15), e28(2009).</li>
<li>Cuthbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-platform+quality+control+assay+to+quantify+multipotential+stromal+cells+in+bone+marrow+aspirates+prior+to+bulk+manufacture+or+direct+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use.</a> Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).</li>
<li>Veyrat-Masson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+content+of+fresh+bone+marrow%3A+a+proposed+quality+control+method+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy.</a> Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).</li>
<li>Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+and+subsequent+infusion+of+human+bone+marrow-derived+stromal+progenitor+cells+%28mesenchymal+progenitor+cells%29%3A+implications+for+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use.</a> Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+expansion+score+for+tissue-engineering+applications+with+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cell+therapy+and+risk+of+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies.</a> Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).</li>
<li>Bonab, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+mesenchymal+stem+cell+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging of mesenchymal stem cell in vitro.</a> BMC Cell Biol. 7, 14(2006).</li>
<li>Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes+from+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes from clotted blood.</a> J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).</li>
<li>De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+immunophenotyping+of+leukemia+cells+in+clotted+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow.</a> J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).</li>
<li>St Antoine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+thrombolytic+drugs+on+clotted+blood+and+bone+marrow+specimens+to+generate+usable+cells+for+cytogenetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).</li>
<li>Kisiel, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+proliferation+of+canine+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+muscle%2C+and+periosteum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum.</a> Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+commercial+scaffolds+on+the+in+vitro+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+to+nucleus+pulposus-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells.</a> Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).</li>
<li>Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+insights+into+the+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stem cells: insights into the secretome.</a> Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).</li>
<li>Benvenuti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+stimulates+adipogenesis+and+decreases+osteoblastogenesis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells.</a> J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).</li>
<li>Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+purified%2C+culture-expanded+human+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.</a> J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+banking+for+research--bench+to+bedside+and+back--myth%2C+reality+or+fast+fading+reality+at+the+dawn+of+a+personalised+healthcare+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era.</a> Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Smith, H. W., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+signalling+by+uPAR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell signalling by uPAR.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rutynowo pobieramy szpik kostny w trakcie operacji pacjenta (w naszym przypadku głównie chirurgii kręgosłupa), z tą zaletą, że personel na sali operacyjnej musi wykonywać niewiele dodatkowej pracy. Mimo że próbki są mieszane z cytrynianem sodu natychmiast po pobraniu, wiele próbek zostało częściowo zakrzepłych, gdy dotarły do laboratorium w celu przetworzenia. Na tym etapie ponowne pobieranie próbek w celu zastąpienia skrzepniętych próbek byłoby oddzielną dodatkową interwencją wymagającą ponownego znieczulenia miejscoweg...

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) odgrywają ważną rolę w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Mogą migrować, różnicować się w różne typy komórek1 i wszczepiać się, co czyni je idealnymi kandydatami do terapii autologicznych 2,3. Ostatnio rozpoczęto badania kliniczne z wykorzystaniem MSCs do naprawy kości i chrząstek, choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi lub choroby serca 4. Te MSCs można pobrać z pępowiny lub tkanki tłuszczowej, ale najbardziej obiecujące wyniki uzyskano z komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego 5.
Grzebień biodrowy pozwala na pobranie znacznej ilości szpiku kostnego i dlatego służy jako główne miejsce aspiracji 6. Jednak jakość aspiratu spada wraz ze wzrostem objętości wycofywanego szpiku kostnego. Podczas gdy pierwsze 5 ml aspiratu szpiku kostnego zawiera MSCs wysokiej jakości, pobranie większych objętości prowadzi do rozcieńczenia aspiratu krwią obwodową z silnie unaczynionej kości 7. Ze względu na obecne megakariocyty i płytki krwi, aspiraty szpiku kostnego są podatne na krzepnięcie, chyba że stosuje się antykoagulanty. Ale nawet w przypadku leków przeciwzakrzepowych mogą wystąpić skrzepy.
W szpiku kostnym MSCs stanowią tylko niewielką część całkowitej puli komórek 8 i muszą być rozwijane w hodowli dla większości zastosowań inżynierii tkankowej lub terapeutycznej 4. Jakość takiej hodowli w dużej mierze zależy od początkowej puli komórek, czyli różnorodności i wysokiej liczby wyjściowej 9. Niską liczbę MSC pochodzących z odstawienia można częściowo wytłumaczyć zmiennością dawców. Z drugiej strony, MSCs z próbek niskiej jakości wymagają dłuższego czasu w hodowli i wydłużonego pasażowania, aby osiągnąć pożądaną liczbę komórek. W obu przypadkach przedłużone pasażowanie jest źródłem starzenia się komórek i może prowadzić do utraty potencjału różnicowania 10. W związku z tym należy opracować zoptymalizowane protokoły, które mogą zmaksymalizować wydajność komórek i zapobiec szkodliwym skutkom 11,12.
Gdy zaczęliśmy pracować z psami MSC, byliśmy zdumieni widząc, że około trzy na cztery próbki szpiku kostnego psów zawierały skrzepy, podczas gdy na szczęście zakrzepłe próbki ludzkie (jedna na dziesięć) były rzadsze. Z drugiej strony nie było niespodzianką, że zaobserwowaliśmy znacznie niższe plony MSCs z zakrzepłych próbek. Aby rozwiązać powtarzający się problem zakrzepłych próbek, opracowaliśmy protokół wykorzystujący lek trombolityczny urokinazę zamiast ponownego pobierania próbek.
Terapie trombolityczne mogą przeciwdziałać sytuacjom zagrażającym życiu, takim jak niedrożność naczyń krwionośnych powodująca zawał serca, udar mózgu lub zatory z powodu niechcianych zakrzepów. Działają one poprzez degradację skrzepów poprzez enzymatyczne rozszczepienie fibryny przez plazminę i enzymatyczne aktywatory plazminogenu. Pomimo szerokiego zastosowania w leczeniu pacjentów, istnieje tylko bardzo niewiele publikacji, które wykorzystywały działania trombolityczne do zastosowań laboratoryjnych w celu ratowania zakrzepłych próbek, koncentrując się głównie na limfocytach. W 1987 roku Niku i wsp. opisali zastosowanie streptokinazy do rozpuszczania skrzepów krwi, w wyniku czego powstają funkcjonalne limfocyty 13 i cztery lata później, De Vis i wsp. Rozszerzono zastosowanie streptokinazy do izolowania komórek białaczkowych z krwi i szpiku kostnego do zastosowań w cytometrii przepływowej 14. Nowsza publikacja sugeruje stosowanie alteplazy w diagnostyce nowotworów 15. Stosując to samo podejście enzymatyczne, nasz protokół koncentruje się na izolacji multipotencjalnych MSCs ze szpiku kostnego, aby zapewnić narzędzie dla badaczy w dziedzinie komórek macierzystych.

<table><tbody><tr><td>Podstawowe składniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>podłoża PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha z nukleozydem, ze stabilną glutaminą</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Inaktywowany termicznie</td><td>Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr>Składniki <td></td><td></td><td></td><td>podłoża adipogennego</td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla królika&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rozyglitazon&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenatenat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Olej Czerwony-O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Składniki podłoża</td><td></td><td></td><td></td>osteogennego</tr><tr><td>2-fosforan kwasu L-askorbinowego</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-glicerofosforan</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra (AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Składniki</td><td></td><td></td><td></td> podłoża chondrogennego</tr><tr><td>Biopad - wyrób medyczny w kształcie gąbki&nbsp;</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-prolina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki transformujący czynnik wzrostu-&beta; 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear fast red</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Generic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri-Sodium citretret dihydrate</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Urokinaza</td><td>Medac</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA</td><td>Barwnik Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka reakcyjna</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Igła Sterican (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Mikroprobówki</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>sterylne kleszcze</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>sterylny skalpel</td><td></td><td></td> Naczynie do hodowli komórek Braun 5518059 <td></td></tr><tr><td>Primaria</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Improved</td><td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>kolba do hodowli komórkowych - Kolba T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Wyposażenie Komora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bezpieczeństwa biologicznego mikrobiologicznego klasy II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>kąpiel wodna</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna w paski 5ml</td><td>Mikroskop Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr> Inkubator nawilżany <tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Heracells 240</td><td>Thermo 51026331</td><td></td><td></td>naukowy</tr><tr><td>Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo 75004331 naukowy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatyczna metoda ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) - zwykle pozyskiwane ze szpiku kostnego - często wymagają hodowli ekspansywnej. Nasz protokół wykorzystuje urokinazę klasy klinicznej do degradacji skrzepów w szpiku kostnym i uwalniania MSCs do dalszego wykorzystania. Protokół ten stanowi szybką i niedrogą alternatywę dla ponownego pobierania próbek szpiku kostnego. Szpik kostny jest głównym źródłem MSC, które są interesujące dla inżynierii tkankowej i terapii autologicznymi komórkami macierzystymi. Po odstawieniu szpik kostny może krzepnąć, ponieważ obejmuje cały układ krwiotwórczy. Powstałe skrzepy zawierają również MSCs, które są tracone w celu hodowli ekspansywnej lub bezpośredniej terapii komórkami macierzystymi. Zauważyliśmy, że 74% próbek szpiku kostnego psów zawierało skrzepy i dało mniej niż połowę liczby komórek macierzystych oczekiwanej od próbek nieskrzepniętych. W związku z tym opracowaliśmy protokół enzymatycznego trawienia tych skrzepów, aby uniknąć pracochłonnego i kosztownego ponownego pobierania próbek szpiku kostnego. Urokinaza - klinicznie zatwierdzony i łatwo dostępny lek trombolityczny - prawie całkowicie usuwa skrzepy szpiku kostnego. W związku z tym aspiraty szpiku kostnego poddane działaniu środka dają podobną liczbę MSCs jak próbki nieskrzepnięte. Ponadto po leczeniu urokinazą komórki zachowały swoją aktywność metaboliczną i zdolność do różnicowania się w linie chondrogenne, osteogenne i adipogenne. Nasz protokół pozwala na odzyskanie zakrzepłych próbek krwi i szpiku kostnego bez wpływu na jakość komórek. Eliminuje to konieczność ponownego pobierania próbek, znacznie obniża koszty pobierania próbek i umożliwia wykorzystanie zakrzepłych próbek do badań lub terapii.

Fakt, że 74% próbek szpiku kostnego psów (n=54) zawierało skrzepy w momencie dostarczenia do naszego laboratorium (Rysunek 1A), wraz ze zmniejszoną wydajnością MSC z tych próbek, doprowadził nas do przekonania, że znaczna liczba MSC została uwięziona w skrzepach. Rzeczywiście, proste barwienie DAPI materiału z przekrojów skrzepu potwierdza obecność komórek jądrzastych o wysokiej gęstości (Rysunek 1B). Skutkuje to niską liczbą MSC dostępnych do hodowli ekspansyjnej, co skłoniło nas do opr...

Mezenchymalne komórki macierzyste są zwykle pozyskiwane ze szpiku kostnego i wymagają hodowli ekspansywnej. Gdy próbki krzepną przed przetworzeniem, można zastosować protokół z użyciem (enzymatycznej) urokinazy leku trombolitycznego w celu degradacji skrzepu. W ten sposób komórki są uwalniane i dostępne do hodowli ekspansyjnej. Protokół ten stanowi szybką i niedrogą alternatywę dla ponownego próbkowania.

Enzymatyczna metoda ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie skrzeplych próbek szpiku kostnego poprzez trawienie skrzepów za pomocą urokinazy. Osiąga się to najpierw poprzez przefiltrowanie próbki szpiku kostnego przez sitko komórkowe. Następnie skrzep szpiku kostnego zostaje pocięty na małe kawałki.Następnie skrzep przenosi się do probówki typu Falcon i poddaje trawieniu za pomocą urokinazy. Na koniec materiał z trawionego skrzepu wysiewa się w celu ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs). Ostatecznie płytki porównuje się z płytką kontrolną z zastosowaniem em sustain, aby ocenić skuteczność trawienia.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię autologicznymi komórkami macierzystymi lub diagnostykę. Wynika to z faktu, że przeszczep wymaga ekspansji i różnicowania znacznej liczby komórek macierzystych. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się u nas w momencie, gdy zauważyliśmy, że wiele próbek szpiku kostnego od DOC było skrzepniętych w chwili dostarczenia do naszego laboratorium.Po prostu nie chcieliśmy zmarnować tak cennych próbek. Aby zrekonstytuować urokinazę, wstrzyknij 10 ml sterylnego PBS do kolby przez wlot w przegrodzie, a następnie wymieszaj w vortexie, aby

an-enzymatic-method-to-rescue-mesenchymal-stem-cells-from-clotted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Metoda enzymatyczna ratowania komórek macierzystych mezenchymalnych z zakrzepniętych próbek szpiku kostnego

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) szczura wyizolowano z kości udowych i piszczeli, a następnie wzbogacono za pomocą magnetycznej separacji komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych w posortowanych komórkach potwierdzono metodą cytometrii przepływowej. Komórki te hodowano również w gęstości klonalnej w celu utworzenia pojedynczych kolonii, które następnie oddzielono za pomocą cylindrów do klonowania.

Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych (hMSC) za pomocą autologicznej surowicy, zmniejsza ryzyko odrzucenia przez materiał ksenogeniczny i inne negatywne skutki. Pozwala również na odzyskanie podzbioru mezodermalnych komórek progenitorowych, które mogą dostarczać świeże hMSC. Osadzenie hMSC w autologicznym skrzepie fibrynowym umożliwia łatwą obsługę i skuteczną implantację chirurgiczną.

Mezenchymalna hodowla komórek zrębowych i dostarczanie w warunkach autologicznych: inteligentne podejście do zastosowań ortopedycznych

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.

Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Ten protokół opisuje metodę sortowania opartą na magnesowych kulkach z wykorzystaniem przeciwciał cytometrii przepływowej oznaczonych fykoerytryną (PE) i przeciwciał anty-PE w celu izolacji określonych subpopulacji komórek macierzystych mezenchymalnych o wysokiej dodatniości markera posortowania i zachowanej proliferacji/aktywności metabolicznej opartej na CCK-8 w badanych warunkach, bez konieczności stosowania drogich sorterów komórkowych lub specyficznych dla celu niestandardowych kulek.

Izolacja i Walidacja Podpopulacji Komórek Macierzystych Mezenchymalnych Pozytywnych na Podoplaniny za Pomocą Pośredniej Strategii Używającej Magnesycznych Cząstek

Poznaj metodę enzymatyczną ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego przy użyciu urokinazy. Ta technika umożliwia ekspansję MSC bez konieczności ponownego pobierania materiału.

Enzymatyczna metoda ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów