Test labiryntu wodnego Morrisa: optymalizacja pod kątem obciążenia myszy i środowiska testowego

Celem tej procedury jest identyfikacja deficytów poznawczych w mysim modelu choroby Alzheimera poprzez zastosowanie protokołu labiryntu wodnego Morrisa, dostosowanego do użycia ze szczepem tła 1 2 9 6 FBB. Osiąga się to poprzez uprzednią aklimatyzację myszy do zadania mającego na celu złagodzenie deficytów wydajności wywołanych stresem. Drugim krokiem jest wykorzystanie zadania platformy wizualnej, w którym platforma jest podniesiona o jeden cal ponad linię wody, aby ocenić funkcjonowanie wizualne i motoryczne.

Następnie przeprowadzane są próby ukrytej platformy, w której platforma jest zanurzona pięć milimetrów pod powierzchnią wody. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie prób sondowych, w których platforma jest usuwana, w celu oceny pamięci odniesienia przestrzennego i określenia rodzaju zastosowanej strategii wyszukiwania. Ostatecznie, ta dostosowana do potrzeb procedura MA wody pozwala na ocenę uczenia się przestrzennego i pamięci w powszechnie używanym mysim modelu choroby Alzheimera.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z powodu konieczności optymalizacji procedur testowych, takich jak liczba prób treningowych i używanych sond w oparciu o szczep tła linii myszy i środowisko, w którym myszy są testowane. Ta część procedury przyzwyczaja myszy do wciągania i usuwania. Najpierw umieść pudełko tak, aby było podniesione na wygodną wysokość i napełnij je dwoma litrami wody o temperaturze 21 stopni Celsjusza i do poziomu około jednego centymetra.

Po przyniesieniu myszy do pokoju testowego, wyjmij osobę z klatki, zweryfikuj tożsamość osoby, a następnie oznacz ogon nietoksycznym trwałym markerem, aby odróżnić go od myszy, które nie przeszły procedury. Umieść mysz w zlewce do przenoszenia na około pięć sekund. Następnie delikatnie wylej mysz ze zlewki do basenu przed obsługą, odmierzając czas myszy w basenie przez 20 sekund.

Po upływie tego czasu delikatnie umieść miarkę przed myszą, nie ustawiając jej pod kątem. Pozwól myszy wejść i zbadać miarkę W razie potrzeby zachęć mysz do wejścia na miarkę, delikatnie wsuwając miarkę pod mysz, powoli podnosząc. Uważaj, aby nie przestraszyć myszy miarką.

Powtarzaj te procedury dla każdej myszy w klatce raz dziennie przez 10 dni. Po każdym zwierzęciu podnieś kał boli i ściółkę z basenu, używając siatki będącej zlewką do przenoszenia między klatkami. Wykonuj widoczne szkolenie w pierwszym, drugim i trzecim dniu testowym z sześcioma próbami każdego dnia i około 10 minut między każdą próbą.

Najpierw skonfiguruj oprogramowanie do śledzenia wydajności myszy i utwórz arkusze uruchamiania zgodnie z instrukcjami w części tekstowej protokołu. Po skonfigurowaniu oprogramowania skonfiguruj pomieszczenie, najpierw wieszając zasłony, aby wszelkie wskazówki przestrzenne były zasłonięte. Następnie ustaw wannę, napełniając ją wodą z kranu o temperaturze 21 stopni Celsjusza.

Użyj termometru, aby upewnić się, że temperatura wody utrzymuje się w granicach jednego stopnia tej temperatury. Przez cały czas testowania. Umieść platformę, która ma zamontowaną flagę, która osiąga wysokość 13 centymetrów i ma wymiary 4,5 na 4,5 centymetra z wytłoczonym na niej pogrubionym znakiem w kształcie litery S, w pierwszym z góry ustalonym miejscu wanny tak, aby wznosiła się około jednego cala nad powierzchnię wody.

Teraz wyjmij pierwszą mysz z klatki. Zweryfikuj tożsamość obiektu, oznacz ogon trwałym markerem o odpowiednim kolorze i umieść go w zlewce transferowej. Delikatnie umieść mysz w wannie.

Uruchom minutnik i upewnij się, że oprogramowanie śledzące śledzi zwierzę. Poczekaj kilka minut, aby mysz zlokalizowała platformę. Gdy mysz zlokalizuje platformę, pozwól myszy na 20 sekund na platformie.

Jeśli zwierzę nie znajdzie platformy w ciągu dwóch minut, zgarnij mysz i umieść ją na platformie na 20 sekund. Po 20 sekundach na platformie zdejmij mysz z platformy, tak jak to zrobiono podczas treningu aklimatyzacyjnego, i umieść ją w podgrzewanej klatce wyłożonej ręcznikami papierowymi i ogrzej do około 31 stopni Celsjusza za pomocą poduszki grzewczej i lampy grzewczej przez 30 sekund. Następnie przenieś mysz do klatki trzymającej tylko z poduszką grzewczą, ale bez lampy grzewczej, aby odzyskać siły między próbami.

Po oczyszczeniu wanny z gruzu za pomocą siatki powtórz te kroki dla każdej myszy w grupie. Po zakończeniu każdej myszy, pierwszej próby, przenieś platformę do drugiej, wcześniej określonej lokalizacji. Wykonuj trening z ukrytą platformą od czwartego do dziesiątego dnia po zawieszeniu zasłon.

Tak jak poprzednio, umieść wskazówki strategicznie na zasłonach. Upewnij się, że wskazówki są duże i zawierają kontrastujące kolory dla lepszej widoczności oraz są ustawione na odległość i wysokość, na której są widoczne dla myszy z wnętrza wanny. Skonfiguruj oprogramowanie zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu.

Następnie ustaw wannę, najpierw napełniając ją wodą tak, aby platforma znajdowała się około pięciu milimetrów pod powierzchnią wody. Umieść platformę w ustalonym wcześniej miejscu. Lokalizacja platformy pozostanie taka sama, ponieważ będzie ona testowana przez prawie wszystkie dni i próby.

It.It jest niezbędne, aby zmienić miejsce startu, aby zwierzęta nie rozwinęły nieprzestrzennej, niehipokampowej strategii motorycznej. Aby rozwiązać labirynt, użyj nietoksycznej białej farby w klimacie umiarkowanym, aby woda była nieprzezroczysta. Zrób to, aby upewnić się, że górna część platformy jest niewidoczna z poziomu oczu zwierzęcia podczas pływania.

Po wcześniejszym zidentyfikowaniu i oznaczeniu myszy, delikatnie wlej mysz do labiryntu, tak aby laryngolog był skierowany w stronę ściany. Każda mysz zostanie umieszczona w tym samym miejscu startowym, aby przeprowadzić unikalną próbę. Po pierwszym zwolnieniu myszy uruchom stoper i stań w miejscu, w którym tester nie jest łatwo widoczny dla myszy.

Gdy zwierzę dotrze do platformy, pozwól mu pozostać na platformie przez 15 sekund, aby zorientować się w jego położeniu przestrzennym w pomieszczeniu. Jeśli mysz nie zlokalizuje platformy w ciągu 60 sekund, delikatnie zgarnij mysz i umieść ją na platformie. Po 15 sekundach na platformie wyjmij mysz z labiryntu i włóż ją z powrotem do podgrzewanej klatki.

Po wcześniejszym oczyszczeniu labiryntu z gruzu, powtórz te procedury dla pozostałych myszy w grupie. Tak więc, w dniach testowych od czwartego do dziewiątego, przeprowadź cztery próby treningu z ukrytą platformą dziennie, z około 20-minutową przerwą między każdą próbą. Wykonaj próby sondy przed szkoleniem platformy w szóstym, siódmym i ósmym dniu oraz ostatnią próbą sondy.

W dniu 10 przeprowadź próby sondy w podobny sposób, jak w przypadku treningu z ukrytą platformą, z wyjątkiem tego, że w labiryncie nie ma żadnej platformy. Zwolnij mysz z wcześniej ustalonego punktu wypuszczenia i pozwól myszy na 60 sekund pływać w labiryncie Po próbie z sondą w dniu 10 nie przeprowadza się żadnych dodatkowych prób podczas prób z sondą. Użyj oprogramowania do śledzenia zwierząt, aby śledzić długość ścieżki zwierzęcia, procent czasu, jaki zwierzę spędza w każdym kwadrancie labiryntu oraz liczbę przepłynięć zwierzęcia nad wcześniej wyznaczonym obszarem.

Otwórz zakładkę listy eksperymentalnej i uzyskaj pomiary z zakładki analizy danych oraz zakładki labirynt wodny. Eksportuj bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego Excel. Następnie przeanalizuj dane zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu.

41 myszy TP 3 0 1 L zawierające ludzki gen P 3 0 1 LTL i 46 osób z grupy kontrolnej przetestowano przy użyciu tego protokołu w wieku około 6,5 miesiąca. Odpowiada to trzymiesięcznej ekspresji Tau P 3 0 1 L u transgeników. Każda grupa zawierała w przybliżeniu równą liczbę samców i samic o długości ścieżki.

Trening na niewidzialnej platformie nie różnił się między kontrolą a myszami TP 3 0 1 L. Ten brak różnic wskazuje, że kontrola i tau P 3 0 1 LM nie różnią się zdolnościami wzrokowymi lub lokomotorycznymi, a zatem deficyty wydajności w ukrytych testach próbnych można przypisać zaburzeniom pamięci. Jednak podczas treningu z ukrytą platformą, TP 3 0 1 LM wykazał się znacznie dłuższymi długościami ścieżek we wszystkich blokach treningowych.

Wreszcie, kontrola poprawiła się we wszystkich czterech próbach sondowych. Podczas gdy myszy Tau P 3 0 1 L nie kontrolowały, myszy były w stanie lepiej wykorzystać strategię przestrzenną do rozwiązania zadania i lepiej nauczyły się lokalizować platformę w strefie docelowej. Dostosowując tę procedurę do użytku z innymi liniami myszy, ważne jest, aby ocenić tempo uczenia się kontrol, określić liczbę potrzebnych prób treningu uderzeń i określić, kiedy należy wprowadzić pierwszą próbę sondy.