Wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie wpływu leczenia na zdolność komórek do proliferacji w matrycach półstałych, ponieważ zwiększona zdolność jest cechą charakterystyczną geniczności guza komórkowego za pomocą miękkiego testu agarowego, geniczność guza mierzy się poprzez zdolność komórki do tworzenia kolonii w półstałym żelu AROS. Ponieważ nieprzekształcone komórki nie są w stanie szybko rozmnażać się w tym środowisku, półstały żel AROS jest konstruowany przez wykonanie najpierw 0,6% dolnej warstwy AROS. Następnie nad dolną warstwą dodaje się komórkę zawierającą 0,3% warstwę żelu AROS.

W tym teście komórki eksperymentalne są traktowane inhibitorem peptydylu, argininy, dazy lub enzymu pad opracowanego przez dr Subramaniana. Co tydzień dodawana jest dodatkowa warstwa odżywcza, która jest żelem 0,3% aros z leczeniem lub bez. Ostatnim krokiem jest policzenie liczby kolonii większych niż 70 mikrometrów do analizy.

Ostatecznie mikroskopia odwrócona służy do pokazania różnicy w liczbie kolonii między grupą kontrolną a grupą leczoną. Cześć, nazywam się Achi Huta. Jestem doktorantem w laboratorium Dr. Scotta Krosa w Baker Institute for Animal Health.

Na Uniwersytecie Cornell test tworzenia miękkich kolonii tygrysów może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii raka, takie jak ocena genicity guza szerokiej gamy komórek rakowych pod kątem ich wrażliwości na leki, hormony i wiele innych schorzeń leczenia. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 3%dwa hydroksyetylo aros do czystej, suchej szklanej butelki o pojemności 100 mililitrów. Dodaj 0,9 grama dwóch hydroksyetyloaros, a następnie 30 mililitrów wody destylowanej.

Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez 15 sekund i delikatnie zamieszaj. Powtarzaj ten krok, aż proszek AROS całkowicie się rozpuści. Następnie należy sterylizować butelkę z roztworem w autoklawie przez 15 minut.

Pozwól roztworowi agros ostygnąć do temperatury pokojowej. Zanim przejdziesz dalej, użyj wstępnie podgrzanych kilku pipet pięciomililitrowych i 10-mililitrowych w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapobiec zastyganiu aros w pipecie. W przypadku częściowego obchodzenia się poluzuj pokrywkę butelki i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej gotowy roztwór 3%2% HYDROKSYETYLU aro przez 15 sekund.

Następnie delikatnie zamieszaj roztwór i wstaw do kuchenki mikrofalowej przez kolejne 15 sekund. Zachowaj ostrożność podczas wirowania roztworu ARO, ponieważ roztwór unosi się pod wpływem powietrza i może się rozlać, jeśli w butelce mikrofalowej znajdują się resztki stałego żelu. Przez kilka kolejnych sekund trzymaj butelkę zawierającą roztwór ARO w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza podczas kolejnych kroków, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się roztworu agro.

Następnie przenieś 12 mililitrów podgrzanego podłoża za pomocą pipet Prewarm do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Natychmiast dodaj trzy mililitry 3% roztworu aros i delikatnie odwróć stożkową rurkę, aby wymieszać aros z podłożem. Następnie delikatnie dodaj dwa mililitry tej mieszaniny do każdej studzienki sześciodołkowej płytki hodowlanej, nie tworząc żadnych pęcherzyków powietrza.

Inkubować sześciodołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, aby mieszanina mogła zestalić się. Po zestaleniu się mieszaniny umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Dolna warstwa jest teraz gotowa do użycia.

Trudnym aspektem tej procedury jest upewnienie się, że wszystkie komórki są rozmieszczone równomiernie i że stopiona skorupa agra nie zestala się przed dodaniem do każdej studzienki, aby zapewnić, że seltz jest zmieszany z pożywką przed dodaniem płynnego żelu rolniczego. Dodatkowo rury są wcześniej podgrzewane, aby zapobiec zastyganiu roztworów podczas przenoszenia. Aby przygotować warstwę zawierającą komórkę, najpierw trypsyna oczka MCF 10 DCIS i rozcieńczyć je do stężenia 40 000 komórek na mililitr, a następnie pobrać osiem mililitrów pożywki za pomocą wstępnie ciepłych pipet i przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Natychmiast dodaj dwa mililitry 3% aros do stożkowej probówki i delikatnie odwróć, aby wymieszać aros z podłożem. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Następnie weź dwa mililitry komórek i potraktuj je dwumikromolową chloraminą BB w DMSO lub samym DMSO jako kontrolę po zabiegu, wymieszaj komórki z 0,6% aros w rozcieńczeniu jeden do jednego, aby uzyskać końcowe stężenie jednej mikromolowej chloraminy BB.

Następnie weź jeden mililitr mieszaniny komórek aros i delikatnie dodaj do dolnej warstwy sześciodołkowej płytki hodowlanej. Umieść sześciodołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut, aby umożliwić zestalenie się wierzchniej warstwy. Po zestaleniu się mieszaniny umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na tydzień przed dodaniem warstwy zasilającej.

Rozpocznij przygotowanie warstwy karmienia od podgrzewania w kuchence mikrofalowej gotowego 3% roztworu dwuwodorowodorkowego aro, jak poprzednio, i zrównoważenia butelki z roztworem agro w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza, wymieszaj jeden mililitr 3% roztworu agro z dziewięcioma mililitrami ciepłej pożywki do 50-mililitrowej stożkowej rurki i delikatnie odwróć, aby wymieszać aros z podłożem. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. Po potraktowaniu mieszaniny chloraminą BB delikatnie dodać jeden mililitr mieszaniny do każdej studzienki z sześciodołkowej płytki hodowlanej zawierającej dolną i miękką warstwę.

Następnie umieść sześciodołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut, aby mieszanina mogła się zestalić. Po zestaleniu się warstwy podajnika umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bader, powtarzaj tę procedurę karmienia co tydzień, nakładając jeden mililitr 0,3% roztworu do obróbki pożywki agros na istniejącą warstwę podajnika, aby uzupełnić komórki nową pożywką, aż do zaobserwowania tworzenia kolonii.

Po dwóch i pół tygodnia wzrostu komórek w miękkim agarze liczy się liczbę kolonii w każdym dołku. Używając mikroskopu świetlnego w celu ułatwienia oceny ilościowej, wydrukuj siatkę na przezroczystości i przymocuj siatkę do płytki sześciodołkowej, aby pomóc zlokalizować miejsce, w którym znajdują się komórki podczas liczenia. Wielkość kolonii jest określana ilościowo na podstawie średnicy każdej kolonii i będzie się różnić, wstępnie zdefiniuj referencyjną wielkość kolonii, aby określić, które kolonie zostaną ocenione.

Na przykład w tym przypadku w analizie danych uwzględniane są kolonie o wielkości 70 mikrometrów lub większej. Po policzeniu uszczelnij sześciodołkową płytkę hodowlaną paraformem, aby zapobiec wysychaniu żeli. Próbki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się kolonii i do przyszłego liczenia.

Wyniki pokazują, że chloramina BB znacząco hamuje tworzenie kolonii pochodzących z komórek MC 10 DCIS w obecności inhibitora podkładki. Nastąpiło zmniejszenie zarówno tworzenia kolonii, jak i wielkości kolonii w porównaniu z kontrolą DMSO. Wielkość kolonii komórek MCF 10 DCIS traktowanych chloraminą BB mieściła się głównie w zakresie od 20 do 100 mikrometrów.

Podczas gdy wielkość kolonii do kontroli DMSO wykazywała większy zakres od 70 do 150 mikrometrów po dwóch i pół tygodniu wzrostu, kolonie większe niż 70 mikrometrów zostały policzone i przeanalizowane. W grupie kontrolnej DMSO znajdowało się średnio około 3 500 kolonii, podczas gdy w grupie leczonej chloraminą BB zaobserwowano tylko około 2000 kolonii. Po dwóch i pół tygodniach miękkiego rolnictwa oznacza to 44% spadek średniego tworzenia kolonii w obecności jednej mikromolowej BB Chloraminy, co wskazuje na znaczne zahamowanie nowotworowe komórek raka piersi przez inhibitor podpaski.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wcześniejszym podgrzaniu wszystkich odczynników i sprzętu, aby uniknąć zestalenia się roztworów podczas obchodzenia się z roztworem i dziękuję za oglądanie.