Name: Wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj test tworzenia kolonii w miękkim agarze do oceny tumoryczności komórek raka piersi i identyfikacji inhibitorów PADI. Ta metoda pozwala ilościowo zmierzyć zdolność proliferacji komórek w półstałym podłożu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Richardowi Cerione, dr Marcowi Antonyakowi i Kelly Sullivan z Cornell University za udzielenie porad technicznych, a także dr Gerlinde Van de Walle z Cornell University za udostępnienie ich odwróconego mikroskopu Olympus CKX41.

1. Przygotowanie 3% agarozy 2-hydroksyetylowej
<ol>
	<li>Do czystej, suchej szklanej butelki o pojemności 100 ml dodaj 0,9 g 2-hydroksyetyloagarozy (Agaroza VII), a następnie 30 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez 15 sekund i delikatnie zamieszaj. Powtórz ten krok jeszcze co najmniej trzy razy, aż proszek agarozy całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Butelkę z roztworem należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut.</li>
	<li>Odczekać, aż roztwór agarozy ostygnie do temperatury pokojowej przed dalszym użyciem. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie dolnej warstwy: 0,6% żelu agarozowego
<ol>
	<li>W inkubatorze o temperaturze 37 °C należy wstępnie rozgrzać kilka pipet o pojemności 5 ml i 10 ml, aby zapobiec zastyganiu agarozy w pipecie podczas obsługi.</li>
	<li>Częściowo poluzuj pokrywkę butelki i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przygotowany 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund. Następnie delikatnie obracaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sekund. UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wirowania roztworu agarozy, ponieważ roztwór unosi się pod wpływem powietrza i może się rozlać.</li>
	<li>Jeśli w butelce znajdują się resztki stałego żelu, podgrzewaj w kuchence mikrofalowej jeszcze przez kilka sekund.</li>
	<li>Przechowywać butelkę zawierającą roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C podczas następnych czynności, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się roztworu agarozy.</li>
	<li>Ciepłe podłoże MCF10DCIS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Uwaga: MCF10DCIS pożywka składa się z DMEM/F12, 5% surowicy końskiej, 5% penicyliny streptomycyny.</li>
	<li>Przenieść 3 ml 3% roztworu agarozy za pomocą wstępnie podgrzanych pipet do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Natychmiast dodaj 12 ml ciepłej pożywki MCF10DCIS i delikatnie odwróć stożkową rurkę, aby wymieszać agarozę z podłożem. Staraj się nie tworzyć żadnych pęcherzyków, ponieważ będzie to przeszkadzać w późniejszym liczeniu kolonii.</li>
	<li>Delikatnie dodać 2 ml tej mieszaniny do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej, nie tworząc żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Inkubować 6-dołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, aby mieszanina mogła się zestalić.</li>
	<li>Po zestaleniu się mieszaniny umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut. Dolna warstwa jest teraz gotowa do użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie warstwy zawierającej komórkę: 0,3% żel agarozowy
<ol>
	<li>Trypsynizować MCF10DCIS komórki i rozcieńczyć je do stężenia komórek 4 x 104 / ml.</li>
	<li>Pobrać 2 ml 3% agarozy za pomocą wstępnie podgrzanych pipet i przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Natychmiast dodaj 8 ml pożywki MCF10DCIS do stożkowej probówki i delikatnie odwróć, aby wymieszać agarozę z podłożem. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Pobrać 2 ml komórek MCF10DCIS (4 x 10 4 /ml) i potraktować BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM).</li>
	<li>W rozcieńczeniu 1:1 wymieszać komórki z 0,6% agarozą.</li>
	<li>Pobrać 1 ml mieszaniny komórka i agaroza i delikatnie dodać na dolną warstwę 6-dołkowej płytki hodowlanej (2 x 104 komórki/ml).</li>
	<li>Umieścić 6-dołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby umożliwić zestalenie się wierzchniej warstwy.</li>
	<li>Po zestaleniu się mieszaniny umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na tydzień przed dodaniem warstwy zasilającej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie warstwy zasilającej: 0,3% żel agarozowy
<ol>
	<li>Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej gotowy 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund, delikatnie obracaj roztwór i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sekund.</li>
	<li>Zrównoważyć butelkę z roztworem agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.</li>
	<li>Ogrzej podłoże MCF10DCIS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wymieszać 1 ml 3% roztworu agarozy z 9 ml ciepłej pożywki MCF10DCIS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie odwrócić, aby wymieszać agarozę z pożywką. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Mieszaninę należy poddać działaniu BB-CLA (0 μM (DMSO) lub 1 μM).</li>
	<li>Delikatnie dodać 1 ml tej mieszaniny (bez tworzenia pęcherzyków) do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej dolną i miękką warstwę.</li>
	<li>Umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby mieszanina mogła się zestalić.</li>
	<li>Po zestaleniu się warstwy zasilającej umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Powtarzaj tę procedurę karmienia co tydzień, nakładając 1 ml 0,3% roztworu agarozy/pożywki/roztworu do leczenia na istniejącą warstwę zasilającą, aby uzupełnić komórki nową pożywką, aż do zaobserwowania tworzenia kolonii. Uwaga: Agar w warstwach miękkich i karmiących jest bardzo miękki, dlatego dodane składniki odżywcze z warstwy zasilającej łatwo dyfundują do warstwy zawierającej komórki, aby dotrzeć do komórek.</li>
</ol>
5. Gromadzenie danych
<ol>
	<li>Po 2,5 tygodnia wzrostu komórek w miękkim agarze policz liczbę kolonii w każdym dołku za pomocą mikroskopu świetlnego. Aby ułatwić kwantyfikację, wydrukuj siatkę na folii przezroczystej i przymocuj siatkę do płytki 6-dołkowej, aby pomóc zlokalizować miejsca, w których znajdują się komórki podczas liczenia. Ponieważ wielkość kolonii (określana ilościowo przez średnicę każdej kolonii) będzie się różnić, wstępnie zdefiniuj referencyjną wielkość kolonii, aby określić, które kolonie zostaną ocenione. Na przykład w analizie danych należy uwzględnić rozmiary kolonii 70 μm lub większe.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się kolonii i do przyszłego liczenia. Uszczelnij 6-dołkową płytkę hodowlaną za pomocą Parafilm, aby zapobiec wysychaniu żeli.</li>
</ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szybkość tworzenia kolonii w miękkim agarze różni się w zależności od typu komórki9. Dlatego liczba komórek, od których należy zacząć, powinna być zoptymalizowana i odpowiednio dostosowana. Sugerowany zakres początkowy wynosi od 5 x 102 do 1 x 104 komórek na studzienkę przy użyciu płytki 6-dołkowej. Ponadto wielkość kolonii różni się w zależności od tempa wzrostu każdej komórki. W związku z tym potrzebna jest predefiniowana wartość graniczna dla wielkości kolonii, aby oznaczyć poszczególn...

Zarówno nieprzekształcone (normalne), jak i przekształcone komórki mogą łatwo namnażać się w jednowarstwowej hodowli 2D. Ta forma przylegającego wzrostu komórek jest dość odmienna od tej, która występuje in vivo, gdzie przy braku stymulacji mitogennej komórki często nie dzielą się szybko w swoim mikrośrodowisku. Z drugiej strony test miękkiego agaru różni się od systemów hodowli 2D, ponieważ określa ilościowo rakotwórczość, mierząc zdolność komórki do namnażania się i tworzenia kolonii w zawiesinie w półstałym żelu agarozowym1. W tym otoczeniu nieprzekształcone komórki nie są w stanie szybko się rozmnażać przy braku zakotwiczenia w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i ulegają apoptozie, procesowi znanemu jako anoikis. Natomiast komórki, które przeszły transformację złośliwą, tracą zależność od zakotwiczenia z powodu aktywacji szlaków sygnałowych, takich jak kinaza 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K)/Akt i Rac/Cdc42/PAK. Dlatego komórki te są w stanie rosnąć i tworzyć kolonie w półstałej miękkiej matrycy agarowej2.
Powszechnym zastosowaniem miękkiego testu agarowego jest sprawdzenie, czy określone związki, takie jak inhibitory PADI, są w stanie zahamować wzrost guza in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, liczba kolonii lub rozmiary kolonii są ilościowymi odczytami z testu, które można porównać między grupami kontrolnymi i leczonymi w celu oceny różnic w rakotwórczości komórkowej. W związku z tym, jeśli okaże się, że tworzenie kolonii jest odwrotnie skorelowane ze wzrostem stężenia leku, można wyciągnąć wniosek, że lek jest skutecznym inhibitorem rakotwórczości in vitro. Z drugiej strony, jeśli lek nie wpływa na tworzenie kolonii, lek albo nie jest w odpowiedniej dawce, albo nie jest skutecznym inhibitorem rakotwórczym. Oprócz użycia miękkiego testu agarowego do zbadania przeciwnowotworowego działania leku, test ten może być również wykorzystany do zbadania związku między określonym genem a nowopowstaniem. Na przykład wpływ hamowania ekspresji PADI2 na rakotwórczość można rozwiązać za pomocą leczenia siRNA specyficznego dla PADI2.
PADI to zależne od wapnia enzymy, które po translacji modyfikują białka poprzez przekształcanie dodatnio naładowanych reszt argininy w neutralnie naładowaną cytrulinę w procesie znanym jako cytrulinacja lub deiminacja3-5. Niedawno odkryliśmy, że deiminaza peptydyloargininy 2 (PADI2) może funkcjonować jako nowy biomarker raka piersi i że inhibitory PADI stanowią potencjalne terapie we wczesnym stadium raka piersi6. Na przykład, wcześniej wykazaliśmy, że inhibitor "pan-PADI", Cl-amidyna, hamuje proliferację komórek raka piersi za pomocą monowarstw 2D i że inhibitor hamuje wzrost sferoid guza 3D6. W tym raporcie rozszerzamy te badania i podkreślamy użyteczność testu z miękkim agarem, testując skuteczność nowego inhibitora PADI, BB-CLA, w hamowaniu wzrostu MCF10DCIS kolonii raka piersi7. Zwracamy uwagę, że użyliśmy komórek MCF10DCIS w tym eksperymencie, ponieważ są one onkogennymi pochodnymi nieprzekształconych ludzkich komórek MCF10A i ponieważ zawierają wysokie poziomy białka PADI28 w stanie stacjonarnym. Stawiamy hipotezę, że aktywność enzymatyczna PADI2 odgrywa kluczową rolę w rakotwórczości tej linii komórkowej i że hamowanie aktywności PADI2 za pośrednictwem BB-CLA zahamuje postęp raka.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop odwrócony Zeiss Axiopot</td><td>Carl Zeiss 1021859251Mikroskopia</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>Surowica koni dawcy hyklonów</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-hydroksyetyloagaroza: Typ VII, niska temperatura żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Biorąc pod uwagę trudności w badaniu mechanizmów progresji nowotworu in vivo, testy oparte na komórkach, takie jak test tworzenia miękkiego kolonii agaru (dalej nazywany miękkim testem agarowym), który mierzy zdolność komórek do proliferacji w półstałych matrycach, pozostają znakiem rozpoznawczym badań nad rakiem. Kluczową zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi jednowarstwowymi lub sferoidalnymi testami hodowli komórek sferoidalnych 2D jest ścisła mimikra środowiska komórkowego 3D do tego obserwowanego in vivo. Co ważne, test z miękkim agarem stanowi również idealne narzędzie do rygorystycznego testowania wpływu nowych związków lub warunków leczenia na proliferację i migrację komórek. Dodatkowo test ten umożliwia ilościową ocenę potencjału transformacji komórek w kontekście zaburzeń genetycznych. Niedawno zidentyfikowaliśmy deiminazę peptydyloargininy 2 (PADI2) jako potencjalny biomarker raka piersi i cel terapeutyczny. W tym miejscu podkreślamy użyteczność testu z miękkim agarem w przedklinicznych badaniach przeciwnowotworowych poprzez testowanie wpływu inhibitora PADI, BB-Cl-amidyny (BB-CLA), na rakotwórczość ludzkich komórek raka przewodowego in situ (MCF10DCIS).

Test tworzenia kolonii w miękkim agarze może być stosowany w szerokim zakresie zastosowań dokumentujących potencjał nowotworowy komórek rakowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że półstała matryca selektywnie sprzyja wzrostowi komórek, które mogą proliferować w sposób niezależny od podłoża. Cecha ta jest przejawiana głównie przez komórki nowotworowe, a nie przez komórki prawidłowe. Technikę tę wykorzystujemy przede wszystkim do badania skuteczności hamowania wzrostu guza przez leki oraz do testowania wpływu nadekspr...

Tutaj dokumentujemy użycie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do testowania wpływu inhibitora enzymu deiminazy peptydyloargininowej (PADI), BB-Cl-amidyny, na rak piersi rak piersi w badaniach in vitro.

Wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie wpływu traktowania na zdolność komórek do proliferacji w macierzach półstałych, ponieważ zwiększona zdolność ta jest cechą charakterystyczną dla geniczności nowotworowej komórek; w teście z agarem miękkim geniczność nowotworową mierzy się poprzez zdolność komórek do tworzenia kolonii w półstałym żelu AROS. Ponieważ komórki nietransformowane nie są w stanie szybko namnażać się w tym środowisku, półstały żel AROS przygotowuje się poprzez utworzenie najpierw dolnej warstwy 0,6% AROS. Następnie, powyżej warstwy dolnej, dodaje się warstwę żelu 0,3% AROS zawierającą komórki.W tym teście komórki eksperymentalne są traktowane inhibitorem enzymu peptydylo-arginino-deaminazy (PAD) opracowanym przez dr. Subramaniana. Co tydzień dodawana jest dodatkowa warstwa pożywki w postaci żelu agarowego 0,3% z dodatkiem inhibitora lub bez niego. Końcowym etapem jest przeliczenie liczby kolonii o rozmiarze większym niż 70 µm w celu przeprowadzenia analizy.Ostatecznie mikroskopia odwrócona służy do wykazania różnicy w liczbie kolonii pomiędzy grupą kontrolną a grupą badaną. Cześć, nazywam się Achi Huta. Jestem doktorantem w laboratorium dr. Scotta Krosa w Instytucie Zdrowia Zwierząt Baker (Baker Institute for Animal Health).Na Uniwersytecie Cornell test tworzenia kolonii typu „soft agar” może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii nowotworów, takie jak ocena geniczności guzów w szerokim zakresie komórek nowotworowych pod kątem ich wrażliwości na leki, hormony i wiele innych warunków terapeutycznych. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 3% agarozy w czystej i suchej szklanej butelce o pojemności 100 ml. Dodaj 0,9 g agarozy, a następnie 30 ml wody destylowanej.Podgrzewaj mieszaninę w mikrofalówce przez 15 sekund, a następnie delikatnie zamieszaj ruchem okrężnym. Powtarzaj ten krok, aż proszek AROS całkowicie się rozpuści. Następnie autoklawuj butelkę z roztworem przez 15 minut.Pozostaw roztwór agarozy do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Następnie podgrzej kilka pipet o pojemności 5 ml i 10 ml w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby zapobiec krzepnięciu agarozy w pipecie. W przypadku pracy z gotowym roztworem, poluzuj zakrętkę butelki i podgrzewaj gotowy 3% roztwór hydroksyetyloagarozy w kuchence mikrofalowej przez 15 sekund.Następnie delikatnie zamieszaj roztwór ruchem okrężnym i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez kolejne 15 sekund. Należy zachować ostrożność podczas mieszania roztworu ARO, ponieważ pod wpływem powietrza roztwór unosi się i może wypłynąć, jeśli w butelce podgrzewanej w kuchence mikrofalowej pozostały resztki stałego żelu. Przez kilka kolejnych sekund, podczas następnych etapów, należy trzymać butelkę z roztworem ARO w kąpieli wodnej o temperaturze 45 stopni Celsius, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się roztworu agro.Następnie, używając pipet do podgrzewania, przenieś 12 ml podgrzanego medium do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Natychmiast dodaj 3 ml 3% roztworu aros i delikatnie odwróć probówkę stożkową, aby wymieszać aros z medium. Następnie ostrożnie dodaj 2 ml tej mieszaniny do każdego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.Inkubuj płytkę hodowlaną z sześcioma dołkami w pozycji poziomej na płaskiej powierzchni w temperaturze 4°C przez jedną godzinę, aby mieszanina stężała. Po stężeniu mieszaniny umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 30 minut. Warstwa dolna jest teraz gotowa do użycia.Trudnym aspektem tej procedury jest zapewnienie równomiernego rozłożenia wszystkich komórek oraz dopilnowanie, aby roztopiona powłoka agarozy nie zastygła przed dodaniem do każdego dołka, co ma zagwarantować wymieszanie się osadu w medium przed dodaniem płynnego żelu agarowego. Ponadto pipety są uprzednio podgrzane, aby zapobiec krzepnięciu roztworów podczas pracy. Aby przygotować warstwę zawierającą komórki, najpierw poddaje się komórki MCF 10 DCIS trypsynizacji i rozcieńcza je do stężenia 40 000 komórek na mililitr, następnie za pomocą podgrzanych pipet pobiera się 8 ml medium i przenosi do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Natychmiast dodaj dwa mililitry 3% aros do probówki stożkowej i delikatnie odwróć, aby wymieszać aros z medium. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie pobierz dwa mililitry komórek i potraktuj je dwiema mikromolami BB chloramine w DMSO lub samym DMSO jako kontrolą po opracowaniu, wymieszaj komórki z 0,6% aros w rozcieńczeniu jeden do jednego, aby uzyskać końcowe stężenie jednej mikromoli BB chloramine.Następnie pobierz 1 mL mieszaniny komórek i agarosu i ostrożnie dodaj do dolnej warstwy płytki hodowlanej z sześcioma dołkami. Umieść płytkę poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby górna warstwa mogła stężeć. Po zestaleniu mieszaniny umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na tydzień przed dodaniem warstwy karmiącej.Przygotowanie warstwy zasilającej rozpocznij od podgrzania w kuchence mikrofalowej wcześniej przygotowanego 3% roztworu dwa hydroksyetylu aro, zgodnie z wcześniejszą procedurą, a następnie wyrównaj temperaturę butelki z roztworem agro w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C. Wymieszaj 1 mL 3% roztworu agro z 9 mL ciepłej pożywki w probówce stożkowej o pojemności 50 mL i delikatnie odwróć, aby wymieszać aros z pożywką. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza. Po potraktowaniu mieszaniny BB chloraminą, delikatnie dodaj 1 mL mieszaniny do każdej studzienki 6-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej warstwę dolną i miękką.Następnie należy umieścić sześciodołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze 4 °C na co najmniej 15 minut, aby mieszanina mogła zestalić się. Po zastaleniu warstwy komórek dokarmiających należy umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Tę procedurę dokarmiania należy powtarzać co tydzień, nakładając 1 mL 0,3% roztworu medium agros na istniejącą warstwę komórek dokarmiających w celu uzupełnienia świeżego medium, aż do momentu zaobserwowania formowania się kolonii.Po dwóch i pół tygodniach wzrostu komórek w miękkim agarze należy policzyć liczbę kolonii w każdej studzience. W celu ułatwienia kwantyfikacji, przy użyciu mikroskopu świetlnego, wydrukuj siatkę na folii przezroczystej i przymocuj ją do płytki sześciodołkowej, aby pomóc w lokalizacji komórek podczas liczenia. Wielkość kolonii określa się poprzez pomiar średnicy każdej z nich; ze względu na zróżnicowanie rozmiarów, należy zdefiniować referencyjną wielkość kolonii, aby ustalić, które z nich zostaną uwzględnione w ocenie.Na przykład w tym przypadku do analizy danych włączono kolonie o rozmiarach 70 µm lub większych. Po przeliczeniu należy uszczelnić sześciodołkową płytkę hodowlaną parafolem, aby zapobiec wysychaniu żeli. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się kolonii oraz w celu późniejszego przeliczenia.Wyniki wykazują, że chloramina BB znacząco hamuje tworzenie kolonii pochodzących z komórek MC 10 DCIS w obecności inhibitora PAD. Odnotowano zmniejszenie zarówno liczby tworzących się kolonii, jak i ich wielkości w porównaniu z kontrolą DMSO. Wielkość kolonii dla komórek MCF 10 DCIS traktowanych chloraminą BB mieściła się głównie w zakresie od 20 do 100 mikrometrów.Podczas gdy rozmiar kolonii w przypadku kontroli DMSO wykazywał szerszy zakres od 70 do 150 µm po dwóch i pół tygodniach wzrostu, policzono i przeanalizowano kolonie większe niż 70 µm. W kontroli DMSO odnotowano średnio około 3 500 kolonii, podczas gdy w grupie traktowanej BB chloraminą zaobserwowano jedynie około 2000 kolonii. Po dwóch i pół tygodniach hodowli w miękkiej pożywce reprezentuje to 44% spadek średniej liczby tworzonych kolonii w obecności 1 µM BB chloraminy, co wskazuje na istotne zahamowanie potencjału nowotworowego komórek raka piersi przez ten inhibitor PAD.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wcześniejszym ogrzaniu wszystkich odczynników i sprzętu, aby zapobiec krzepnięciu roztworów podczas pracy; dziękujemy za uwagę.

utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie testu tworzenia kolonii na miękkiej agarze w celu zidentyfikowania inhibitorów tumorygeniczności w komórkach raka piersi

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Ten film opisuje test tworzenia miękkiego kolonii agaru w celu sprawdzenia wpływu inhibitora enzymu PADI i BB-Cl-amidyny na rak piersi in vitro. Test ten umożliwia również ilościową ocenę potencjału transformacji komórek w kontekście zaburzeń genetycznych.

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru: metoda testowania wpływu nowych związków na proliferację komórek rakowych

Ten film opisuje test tworzenia kolonii, który pomaga określić zdolność komórek raka płuc do rozmnażania się w nieskończoność i tworzenia indywidualnych kolonii. Możemy przeanalizować wpływ środka przeciwnowotworowego na komórki tworzące kolonie, analizując zmiany w liczbie i/lub wielkości powstałych kolonii.

Test tworzenia kolonii: ocena skuteczności środków przeciwnowotworowych na komórkach raka płuc tworzących kolonie

Ten film opisuje protokół dla jednostki tworzenia kolonii na bazie metylocelulozy lub testu CFU, który pomaga zidentyfikować i policzyć liczbę kolonii utworzonych przez komórki białaczkowe w odpowiedzi na leczenie związkami przeciwnowotworowymi.

Test CFU na bazie metylocelulozy: metoda określania wpływu związków przeciwnowotworowych na tworzenie kolonii w komórkach białaczkowych

Test tworzenia miękkiego kolonii agaru jest metodą używaną do potwierdzania wzrostu in vitro niezależnego od zakotwiczenia komórkowego. Celem tego protokołu jest zilustrowanie rygorystycznej metody wykrywania potencjału rakotwórczego transformowanych komórek oraz supresyjnego wpływu białek na transformowane komórki.

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru

Ta procedura pokaże, jak zsyntetyzowaliśmy i scharakteryzowaliśmy aktywność anty-NFκB i przeciwnowotworowych komórek macierzystych proleku aspiryny-fumaranu.

Synteza i charakterystyka proleku fumaranu aspiryny, który hamuje aktywność NFκB i komórki macierzyste raka piersi

Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.

Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown

Poznaj test tworzenia kolonii w miękkim agarze do oceny tumoryczności komórek raka piersi i identyfikacji inhibitorów PADI. Ta metoda pozwala ilościowo zmierzyć zdolność proliferacji komórek w półstałym podłożu.

Wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi

Przeglądaj więcej filmów