Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych
13 czerwca 2015
Przedstawiamy zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster jako model zaburzeń neurodegeneracyjnych. Będąc bardziej wrażliwym na łagodne wady narządu ruchu, test ten pomoże w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych interakcji genetycznych i celów leków.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zdolności wspinaczkowej much typu dzikiego i much zmutowanych dla genów zaangażowanych w poruszanie się. Osiąga się to poprzez uprzednie przeniesienie much do szklanego cylindra z podziałką. Drugim krokiem jest przemieszczenie much na dno cylindra poprzez lekkie stukanie cylindrem w piankową wyściółkę.
Kolejne muchy przekraczające linię celu są rejestrowane za pomocą kamery wideo przez dwie minuty. Ostatnim krokiem jest przeanalizowanie filmów i wykreślenie liczby much powyżej linii docelowej co 10 sekund. Ostatecznie test wspinaczkowy służy do identyfikacji defektów zdolności do wspinania się zmutowanych linii muszek owocowych.
Główną zaletą tej techniki lub istniejących technik, takich jak metoda dzika, jest to, że ma ona zdolność wykrywania niewielkich różnic w zdolności wspinaczkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takie jak rola określonych genów dziedzicznej paraplegii spastycznej w postępującym upośledzeniu chodu. Implikacją tej techniki jest dążenie do rozwoju terapii.
IP dla zaburzeń neurologicznych, ponieważ zapewnia prosty test ilościowy do testowania odpowiedzi na lek i mutantów dla potencjalnych genów neurodegeneracyjnych Zacznij od znieczulenia 20 much za pomocą dwutlenku węgla i umieść wszystkie muchy w fiolce o wymiarach 25 milimetrów na 95 milimetrów, która zawiera pokarm. Następnie należy przechowywać fiolkę zawierającą muchy poziomo w tekturowej tacy, aby uniknąć uwięzienia ich w płynie, który może gromadzić się na dnie fiolki. Umieść muchy w inkubatorze na co najmniej 21 godzin w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności następnego ranka, ustaw test wspinaczkowy, przenosząc muchy z fiolki do 250-mililitrowego szklanego cylindra z podziałką i uszczelnij górną część folią woskową, aby zapobiec ucieczce much.
Przeprowadź eksperyment w świetle otoczenia w temperaturze 22 stopni Celsjusza i wilgotności 40%. Zawsze wykonuj eksperymenty o tej samej porze dnia, aby uniknąć zakłóceń z cyklami snu. Zaznacz również położenie cylindra na blacie, aby utrzymać go na stałym poziomie każdego dnia.
Policz liczbę martwych much na dnie cylindra i w fiolkach z jedzeniem, zapisz tę liczbę jako śmiertelność. Następnie ustaw kamerę wideo na statywie. Bardzo delikatnie ustaw ostrość aparatu na 190-mililitrowej linii 250-mililitrowego cylindra z podziałką.
Uderz cylindrem od pięciu do 10 razy w podkładkę piankową o zamkniętych komórkach z wystarczającą siłą, aby przemieścić muchy na wewnętrzną powierzchnię dna. Następnie drugą ręką naciśnij przycisk nagrywania w aparacie. Następnie stuknij w cylinder sześć razy w wyraźny nierytmiczny wzór, podczas gdy kamera nagrywa.
Przeprowadzaj każdą próbę przez dwie minuty od czasu ostatniego stuknięcia much. Na koniec wyrzuć muchy w 95% etanolu. Po zakończeniu próby powtórz ten test wspinaczkowy 10 razy, używając za każdym razem 20 świeżych much, aby wykryć niewielkie różnice w lokomocji między grupami.
Umyj cylindry w zmywarce i wysusz przez noc do ponownego użycia po zakończeniu eksperymentu w celu analizy wydajności much, zacznij od obejrzenia filmów z każdego zapisu próby muchy. Całkowita liczba much, które przelatują przez linię celu co 10 sekund. Jeśli mucha zejdzie z powrotem w dół lub spadnie, zapisz tę muchę jako minus jeden i policz następną muchę, która przekroczy linię celu, jako tę samą liczbę, co mucha, która zeszła z powrotem w dół lub spadła.
Na przykład, jeśli 15. mucha spadnie poniżej linii docelowej, następna mucha, która przekroczy linię, jest uważana za 15. muchę, a nie 16. muchę. Następnie odejmij śmiertelność od całkowitej liczby much, aby uzyskać liczbę much, które pozostały na poletku doświadczalnym. Odsetek much powyżej linii docelowej w każdym punkcie czasowym podczas pracy z ciężkimi mutacjami, różne stopnie wady wspinaczkowej można zaobserwować przy użyciu różnych testów wspinaczkowych.
W tym przypadku zarejestrowano liczbę ośmiodniowych much, które wspięły się na wierzch pustej fiolki z jedzeniem po 18 sekundach, nie wykazując znaczącej różnicy w zachowaniu wspinaczkowym między obiema grupami. Z drugiej strony, przy użyciu testu wspinaczkowego z tego protokołu, Bastin 17 dash seven over TM trzy zmutowane muchy wykazują deficyt wydajności w porównaniu z kontrolami. Ponieważ wiele zaburzeń ruchowych ma charakter postępujący, ważne jest, aby obserwować ewolucję much w czasie.
W wieku dwóch dni występuje znaczna różnica w liczbie much, które wspinają się ponad linię docelową. W porównaniu z kontrolami. Ta wydajność wspinaczkowa nadal spada wraz z wiekiem zmutowanych much od dwóch do dwóch dni.
Po opanowaniu tego eksperymentu i analizy można ukończyć w ciągu trzech godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo wady lokomotywy w modelach zmutowanych dola dla zaburzeń neurologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster, służącej jako model schorzeń neurodegeneracyjnych. Test został zaprojektowany tak, aby był bardziej czuły na łagodne deficyty lokomotoryczne, co wspomaga przesiewowe poszukiwanie potencjalnych interakcji genetycznych i celów terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Testy behawioralne
- Genetyka
Wstęp
- Drosophila melanogaster jest powszechnie stosowanym organizmem modelowym w neurobiologii.
- Testy negatywnej geotaksji służą do pomiaru zdolności wspinaczkowych muszek owocówek.
- Identyfikacja deficytów lokomocyjnych może dostarczyć cennych informacji na temat zaburzeń neurodegeneracyjnych.
- Mutacje genetyczne mogą wpływać na lokomocję, co czyni ten test wartościowym narzędziem badawczym.
Cel badania
- Ilościowe określenie zdolności wspinania się dzikiego typu oraz mutantów Drosophila.
- Identyfikacja deficytów w zdolności wspinania się związanych ze specyficznymi mutacjami genetycznymi.
- Przesiewowe poszukiwanie potencjalnych interakcji genetycznych i celów terapeutycznych związanych z lokomocją.
Zastosowane metody
- Przenieś muchy do szklanego cylindra miarowego.
- Przemieszcz muchy na dno, delikatnie opukując cylinder.
- Za pomocą kamery wideo zarejestruj liczbę much przekraczających wyznaczoną linię w ciągu dwóch minut.
- Przeanalizuj nagrania w celu wykreślenia liczby much znajdujących się powyżej linii wyznaczonej w odstępach 10 sekund.
Główne wyniki
- Test ten pozwala na skuteczną kwantyfikację zdolności wspinania się zarówno u much typu dzikiego, jak i mutantów.
- Wykazuje on czułość na łagodne defekty lokomotoryczne.
- Wyniki mogą dostarczyć informacji o potencjalnych interakcjach genetycznych i celach terapeutycznych dla leków.
- Metoda ta jest niezawodna i efektywna kosztowo do celów przesiewowych.
Wnioski
- Test ujemnego geotaksis jest cennym narzędziem do badania lokomocji u Drosophila.
- Może on pomóc w identyfikacji czynników genetycznych wpływających na schorzenia neurodegeneracyjne.
- Metoda ta zwiększa możliwość przesiewowego wyznaczania celów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy test zapewnia czułą i kosztowo efektywną metodę wykrywania wczesnych defektów lokomocyjnych w modelach Drosophila w badaniach nad zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, co umożliwia wcześniejszą identyfikację modyfikatorów genetycznych i kandydatów na leki. Poprzez kwantyfikację zdolności wspinania się w czasie, metoda ta wspomaga mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do hipotez dotyczących celów terapeutycznych w procesach odkrywania leków. Powtarzalność i skalowalność tej metody sprawiają, że jest ona odpowiednia do kampanii przesiewowych mających na celu walidację mechanizmów istotnych dla danej choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji genów w szlakach lokomocyjnych istotnych dla modeli chorób neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe, rozdzielcze w czasie odczyty fenotypowe do oceny sprawności much mutantów lub poddanych działaniu leków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wykrycie niewielkich defektów wspinania, które mogą zostać pominięte w standardowych testach, co zwiększa czułość przesiewową we wczesnych etapach badań.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje niedrogie, wielorazowe cylindry szklane i wymaga minimalnego przeszkolenia, co zapewnia kompatybilność z analizami wysokoprzepustowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na śledzenie zależnego od wieku spadku zdolności wspinaczkowych, modelując postępującą dysfunkcję lokomotoryczną obserwowaną w ludzkiej neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Generuje dane podłużne do oceny efektów interwencji terapeutycznych w czasie w badaniach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, wspierając walidację celu oraz identyfikację związków wiodących poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z mierzalnymi fenotypami behawioralnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar aktywności lokomocyjnej jako funkcjonalnego wskaźnika integralności neuronalnej.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalną kwantyfikację wspinania się much w celu oceny efektów związków chemicznych lub modyfikatorów genetycznych.
- Analityka: Generuje dane szeregów czasowych dotyczące pozycji much, co pozwala na obliczenie prędkości wspinania się oraz wskaźników wytrzymałości.
- Badania translacyjne: Modeluje progresywny spadek funkcji motorycznych, co jest zgodne z przedkliniczną oceną kandydatów na leki modyfikujące przebieg choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Standaryzowany protokół pozwala na ponowne zastosowanie w wielu liniach mutantów i kampaniach przesiewowych przy minimalnej rewalidacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez powiązanie genotypu z mierzalnym fenotypem lokomotorycznym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom stukania, rejestracji wideo oraz ślepej analizy.
- Wartość strategiczna: Redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych we wczesnym przesiewie poprzez wykrywanie subtelnych defektów, co poprawia efektywność procesu hit-to-lead.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko, w oparciu o stopień nasilenia i progresję fenotypu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowych umiejętności obchodzenia się z muchami oraz znieczulania ich za pomocą CO2.
- Wymagany jest szklany cylinder mierniczy o pojemności 250 mL, woskowa folia uszczelniająca, podkładka piankowa, statyw oraz urządzenie do rejestracji wideo.
- Wymagane są stałe warunki środowiskowe (22°C, 40% wilgotności, ta sama pora dnia) w celu zminimalizowania zmienności.
- Wymaga przeszkolenia w zakresie analizy wideo, aby prawidłowo oceniać liczbę przejść much oraz właściwie interpretować upadki lub zawracanie.
- Metoda ogranicza się do pomiaru negatywnej geotaksji; nie ocenia innych zachowań motorycznych, takich jak lot czy koordynacja chodu.
