Name: Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj ilościową analizę wad wspinaczkowych w modelu Drosophila melanogaster dla badań nad zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Ta metoda pozwala wykrywać subtelne defekty lokomocyjne i identyfikować potencjalne cele terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez grant zespołu Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) dla dr Bolduca (współkierownika) i dr Guya Rouleau (kierownika). Serdecznie dziękujemy dr Oksanie Suchowersky, dr Kathryn Todd, członkom klubu muchowego University of Alberta oraz dr Claytonowi Dicksonowi za pomoc w opracowaniu metody i analizie statystycznej.

Badania nad Drosophila melanogaster były zgodne z wytycznymi badawczymi Uniwersytetu Alberty.
1. Kolekcja much
<ol>
	<li>Zebrać 20 much za pomocą znieczulenia CO2 (g) i umieścić w fiolce o wymiarach 25 mm x 95 mm zawierającej pokarm.</li>
	<li>Fiolki zawierające muchy należy przechowywać poziomo, aby uniknąć uwięzienia much w płynach, które mogą gromadzić się na dnie fiolki.</li>
	<li>Inkubować muchy przez co najmniej 21 godzin w temperaturze 22 °C przy wilgotności 45% w inkubatorze przez około 15 godzin. Ustawić inkubator na 12-godzinny cykl światło: ciemność.</li>
</ol>
2. Test wspinaczkowy
<ol>
	<li>Następnego ranka przenieś 20 much z jednej fiolki do szklanego cylindra z podziałką o pojemności 250 ml. Zaznacz położenie cylindra, aby utrzymać go na stałym poziomie każdego dnia. Użyj jednego szklanego cylindra na genotyp, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między genotypami. Umyj je na końcu każdego eksperymentu i zmieniaj między genotypami.
	<ol>
		<li>Przeprowadzaj eksperymenty w świetle otoczenia (lub czerwonym świetle, jeśli występuje potencjalna wada wzroku) w temperaturze i wilgotności odpowiednio 22 °C i 40%. Aby uniknąć zakłóceń rytmu okołodobowego, zawsze wykonuj eksperymenty o tej samej porze dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszczelnij górną część cylindra folią barierową (folią woskową), aby zapobiec ucieczce much (rysunek 2).</li>
	<li>Ustaw kamerę wideo na statywie. Ustaw ostrość kamery na linii 190 ml cylindra z podziałką 250 ml (17,5 cm).</li>
	<li>Policz liczbę martwych much na dnie cylindra i w fiolkach z jedzeniem. Zapisz tę liczbę jako śmiertelność.</li>
	<li>Bardzo delikatnie kilkakrotnie uderzaj cylindrem o podkładkę piankową o zamkniętych komórkach z wystarczającą siłą, aby przemieścić muchy na wewnętrzną powierzchnię dna. Stuknij 5–10 razy, używając drugiej ręki, aby nacisnąć przycisk nagrywania w aparacie.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Nagraj" na aparacie.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie z kamery wideo i dotknij cylindra sześć razy w wyraźny nierytmiczny wzór.</li>
	<li>Przeprowadzaj każdą próbę przez 2 minuty od czasu ostatniego stukania muchówek i zapisuj liczbę much przekraczających wysokość 17,5 cm (190 ml) w każdym wybranym punkcie czasowym (oznaczaj ilościowo co 10 sekund). Uwaga: Oznaczenie ml na butli będzie się różnić w zależności od modelu butli w zależności od średnicy. Aby uniknąć błędu, zmierz wysokość każdego używanego cylindra.</li>
	<li>Po zakończeniu badania wyrzuć muchy w 95% etanolu.</li>
	<li>Powtarzać kroki od 2.1 do 2.9, aż wszystkie kontrpróby zostaną za każdym razem przetestowane na świeżych muchach. 
	Uwaga: Chociaż 5 powtórzeń może wystarczyć w przypadku mutacji mającej silny wpływ na lokomocję, zaleca się 10 powtórzeń biologicznych na 20 much (200 much) w celu wykrycia mniejszych różnic.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu umyj cylindry w zmywarce laboratoryjnej i wysusz O/N do ponownego użycia.</li>
</ol>
3. Analiza
<ol>
	<li>Przeanalizuj filmy z każdej próby muchy. Co 10 sekund zapisuj całkowitą liczbę much, które przekraczają linię docelową.
	<ol>
		<li>Jeśli mucha wspina się z powrotem w dół lub spada, zapisz tę muchę jako -1 i policz następną muchę, która przekroczyła linię celu, jako tę samą liczbę, co mucha, która zeszła z powrotem w dół lub spadła. Na przykład, jeśli 15. mucha spadnie poniżej linii docelowej, następna mucha, która przekroczy linię (16. mucha) jest uważana za 15. muchę, a nie 16. muchę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odejmij śmiertelność od całkowitej liczby much (20), aby uzyskać liczbę much, które pozostały w badaniu. W każdym punkcie czasowym uzyskaj frakcję much powyżej linii celu.</li>
	<li>Wykreślić każdą wartość procentową w każdym punkcie czasowym (zob. rysunek 3).</li>
	<li>Przeanalizuj wydajność w 120-sekundowym punkcie danych i wykonaj test t-studenta, gdy obecne są 2 grupy lub ANOVA i test końcowy dla wielokrotnych porównań (z modyfikacją Bonferroniego dla porównań planowanych i Tukey dla porównań nieplanowanych). Testy Kołmogorowa-Smirnowa17 są również wykonywane w celu ustalenia normalności i równej wariancji, ale także w celu porównania rozkładu grupy zmutowanej w stosunku do grupy kontrolnej.</li>
	<li>Aby przedstawić dane dotyczące starzenia się, wykreśl odsetek much wspinających się w ciągu 120 sekund z muchami w różnym wieku (2 dni, 1 tydzień, 2 tygodnie), aby sprawdzić, czy występuje postępujący deficyt (ryc. 4).</li>
</ol>

<ol><li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
<li>Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+protein+synthesis+in+Drosophila+fragile+X+mutants+impairs+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory.</a> Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).</li>
<li>McBride, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+synaptic+plasticity%2C+courtship+behavior%2C+and+mushroom+body+defects+in+a+Drosophila+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome.</a> Neuron. 45, 753-764 (2005).</li>
<li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+epilepsy%3A+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. 187, 523-534 (2011).</li>
<li>Marley, R., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+persistent+Na%2B+current+contributes+to+seizure+in+the+slamdance+bang-sensitive+Drosophila+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant.</a> Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).</li>
<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Mutants+Of+Drosophila+Isolated+By+Countercurrent+Distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).</li>
<li>Ganetzky, B., Flanagan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+senescence+and+age-related+changes+in+two+wild-type+strains+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster.</a> Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+Drosophila+melanogaster+geotaxis%2C+a+complex+behavioral+trait%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait.</a> Nature genetics. 31, 349-353 (2002).</li>
<li>Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+simple+gravity+sensing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster.</a> Nature protocols. 5, 20-25 (2010).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Botella, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+carbonyl+reductase+sniffer+prevents+oxidative+stress-induced+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration.</a> Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Chakraborty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Drosophila+Alzheimer%27s+disease+model%3A+pharmacological+rescue+of+cognitive+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects.</a> PLoS One. 6, e20799(2011).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-related+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+are+ameliorated+by+treatment+with+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine.</a> J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).</li>
<li>Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLehmann%2C+EL+%22Nonparametrics+%3A+statistical+methods+based+on+ranks%22">Nonparametrics : statistical methods based on ranks</a>. , 1st edn, Springer. (2006).</li>
<li>Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spastin+regulates+synaptic+microtubule+networks+and+is+required+for+normal+motor+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function.</a> PLoS biology. 2, e429(2004).</li>
<li>Inlow, J. K., Restifo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+comparative+genetics+of+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular and comparative genetics of mental retardation.</a> Genetics. 166, 835-881 (2004).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila.</a> Genetics. 161, 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Drosophila już okazała się doskonałym modelem w chorobie Parkinsona14 i innych chorobach neurodegeneracyjnych1,2. Oprócz narzędzi genetycznych dostępnych u Drosophila, jego genom jest wysoce konserwatywny pod kątem genów zaangażowanych w zaburzenia neurologiczne19. Pojawienie się metod genetycznych badań przesiewowych całego genomu (w tym sekwencjonowania całego eksomu) prawdopodobnie nadal będzie dostarczać większej listy genów kandydujących związanych z zaburzeniami ru...

Coraz częściej rozpoznawane są wyniszczające zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne i dziedziczna paraplegia spastyczna. Niestety, większość z tych zaburzeń neurodegeneracyjnych nadal nie ma leczenia. Powszechne kliniczne stosowanie obejmujących cały genom, bezstronnych testów genetycznych, takich jak sekwencjonowanie całego egzomu, doprowadziło do wzrostu liczby genów związanych z zaburzeniami lokomocji u ludzi. Pomimo tego postępu, patologiczna progresja od wczesnych do późnych stadiów pozostaje nieuchwytna w tych zaburzeniach. Drosophila dostarcza narzędzi genetycznych do badania zapotrzebowania na geny w kontrolowany sposób przestrzenny i czasowy. Ponadto Drosophila okazała się przydatna w badaniach przesiewowych leków na schorzenia neurologiczne, takie jak między innymi choroba Parkinsona1, choroba Alzheimera2, niepełnosprawność intelektualna3,4 i padaczka5,6. Naszym celem było opracowanie opłacalnego i wiarygodnego testu, który pozwoliłby na analizę o wysokiej przepustowości, a jednocześnie byłby wystarczająco czuły, aby wykryć niewielkie zmiany w wydajności silnika.
Istnieje kilka testów używanych do ilościowego określenia wpływu mutacji genetycznej i/lub warunków środowiskowych na zachowanie wspinaczki Drosophila. Większość testów wykorzystuje naturalną tendencję much do wspinania się, znaną jako geotaksja ujemna lub test wspinaczkowy. Benzer7 zasugerował w 1967 roku, że aparatura przeciwprądowa używana do badania fototaksji może być również używana do badania grataksji. Od tego czasu Ganetsky8 i wiele innych 9-12 oparło się na początkowym teście. Zasada polega na umieszczeniu znanej liczby much w fiolce i silnym uderzeniu fiolką o twardą powierzchnię, powodując upadek much na dno fiolki. Ponieważ jest to zachowanie wrodzone, muchy będą próbowały wspiąć się na szczyt fiolki, w przeciwieństwie do grawitacji. Ten test jest ilościowy i mierzy, ile much przekroczyło znacznik na fiolce w wyznaczonym czasie. Pomiar prędkości zamiast całkowitej liczby wznoszących się much stał się wiarygodnym parametrem i wykazał wady w przypadkach, gdy kryterium liczby much nie było znaczące13.
Test wspinaczkowy okazał się przydatny w badaniu wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona14. Zauważyliśmy jednak, że wady lokomocji mogą nie być wykrywalne w czasie, gdy neurodegeneracja jest już obserwowana w badaniach patologicznych14. W związku z tym zastosowanie tradycyjnego testu może ograniczyć możliwość badania wczesnych etapów patogenezy choroby. Pojawienie się wad lokomotywy w późniejszych stadiach patologii może odzwierciedlać chorobę, której postęp jest zbyt zaawansowany, aby można było go całkowicie uratować.
To rodzi potencjalny problem z czułością tradycyjnego testu wspinaczkowego. Potencjalną niezdolność tradycyjnego testu wspinaczkowego do wykrycia łagodnych wad lokomotywy można przypisać wysokości, na którą muszki muszą się wspinać. Tradycyjny test15,16 mierzy liczbę much, które z powodzeniem wspinają się na wysokość od 2 do 5 cm w ciągu 10 do 20 sekund.

<table><tbody><tr>Stada <td></td><td></td><td>Drosophila Stada</td><td>są wybierane w zależności od eksperymentów. Temperatura i wilgotność w pomieszczeniu i inkubatorze muszą być kontrolowane i stałe, aby muchy nie były zbyt statyczne lub zbyt mokre.</td></tr><tr><td>Kamera</td><td></td><td></td> wideo <td>Każda kamera cyfrowa będzie odpowiednia. Upewnij się, że mogą ustawić ostrość na bliskim obiekcie.</td></tr><tr><td>Cylinder z podziałką</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Różne modele cylindra z podziałką mogą mieć różną średnicę. Dlatego ważne jest, aby zmierzyć wysokość.</td></tr><tr><td>Komputer</td><td></td><td></td><td>Każdy model się nada. Używaliśmy komputera do monitorowania wspinania się much i rejestrowania liczby much w każdym punkcie czasowym.</td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Wady lokomotywy wynikające z zaburzeń neurodegeneracyjnych mogą być późnym początkiem choroby, po latach subklinicznej degeneracji, a zatem obecne strategie leczenia nie są lecznicze. Dzięki zastosowaniu sekwencjonowania całego egzomu zidentyfikowano coraz większą liczbę genów, które odgrywają rolę w poruszaniu się człowieka. Pomimo zidentyfikowania tych genów, nie wiadomo, w jaki sposób geny te są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania lokomotywy. Dlatego bardziej niż kiedykolwiek potrzebny jest wiarygodny test, który wykorzystuje organizmy modelowe do wyjaśnienia roli tych genów w celu identyfikacji nowych celów terapeutycznych. Zaprojektowaliśmy uwrażliwioną wersję negatywnego testu geotaksji, która pozwala na wcześniejsze wykrycie łagodniejszych wad i ma możliwość oceny tych wad w czasie. Test przeprowadza się w szklanym cylindrze z podziałką, który jest uszczelniony folią barierową woskową. Zwiększając odległość progową do pokonania do 17,5 cm i wydłużając czas trwania eksperymentu do 2 minut, zaobserwowaliśmy większą czułość w wykrywaniu łagodnych dysfunkcji ruchowych. Test jest opłacalny i nie wymaga intensywnego szkolenia w celu uzyskania wysoce powtarzalnych wyników. To sprawia, że jest to doskonała technika do badań przesiewowych potencjalnych leków u mutantów Drosophila z wadami lokomocji.

Wspinanie się jest zachowaniem silnym i powtarzalnym. W rzeczywistości jednodniowe muchy typu dzikiego szybko osiągają docelową wydajność wspinania się (25 - 30 s). Muchy mutanty wykazują zakres wydajności od łagodnej (lub opóźnionej) do całkowitej niezdolności do wspinania się do celu. Ilustrujemy to tutaj na przykładzie dwóch różnych alleli mutantów. Pierwszym jest ciężki allel genu spastin spowodowany całkowitym delecją genu spastin (spas5.75) 18. W tej linii (spas5.75 z TM6b) jednodni...

Przedstawiamy zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster jako model zaburzeń neurodegeneracyjnych. Będąc bardziej wrażliwym na łagodne wady narządu ruchu, test ten pomoże w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych interakcji genetycznych i celów leków.

Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zdolności wspinania się much typu dzikiego oraz much z mutacjami w genach zaangażowanych w lokomocję. Jest to realizowane poprzez najpierw przeniesienie much do szklanego cylindra miarowego. W drugim kroku muchy sprowadza się na dno cylindra poprzez delikatne opukiwanie go o podkładkę z pianki.Kolejne muchy przekraczające linię docelową są rejestrowane za pomocą kamery wideo przez dwie minuty. Ostatnim krokiem jest analiza nagrań i wykreślenie liczby much znajdujących się powyżej linii docelowej w odstępach co 10 sekund. Ostatecznie test wspinaczkowy służy do identyfikacji defektów zdolności wspinania się u linii mutantów muszek owocówek.Główną zaletą tej techniki, podobnie jak istniejących metod, takich jak metoda dzika, jest zdolność do wykrywania niewielkich różnic w umiejętności wspinania się. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń neurodegeneracyjnych, np. dotyczące roli specyficznych genów w dziedzicznej spastycznej paraplegii w postępującym upośledzeniu chodu. Zastosowanie tej techniki zmierza w stronę opracowania nowych terapii.IP w przypadku schorzeń neurologicznych, ponieważ zapewnia prosty test ilościowy do badania odpowiedzi na leki oraz mutantów w przypadku kandydatów na geny neurodegeneracyjne. Należy rozpocząć od znieczulenia 20 much dwutlenkiem węgla i umieszczenia wszystkich much w probówce zbiorczej o wymiarach 25 mm na 95 mm zawierającej pożywkę. Następnie probówkę z muchami należy przechowywać poziomo w tekturowej tacy, aby zapobiec uwięzieniu owadów w cieczy, która może nagromadzić się na dnie probówki. Muchy należy umieścić w inkubatorze na co najmniej 21 h w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność. Następnego ranka należy przygotować test wspinania, przenosząc muchy z probówki do szklanego cylindra miarowego o pojemności 250 mL i uszczelnić górną część folią woskową, aby zapobiec ucieczce much.Eksperyment należy przeprowadzić w świetle otoczenia, w temperaturze 22 °C i wilgotności 40%. Doświadczenia zawsze wykonuj o tej samej porze dnia, aby uniknąć czynników zakłócających związanych z cyklami snu. Ponadto zaznacz położenie cylindra na blacie, aby pozostawało ono niezmienne każdego dnia.Policz liczbę martwych much na dnie cylindra oraz w fiolkach z pożywką i zapisz tę liczbę jako śmiertelność. Następnie ustaw kamerę wideo na statywie. Bardzo precyzyjnie ustaw ostrość kamery na linii 190 ml cylindra mierniczego o pojemności 250 ml.Uderz cylindrem od pięciu do 10 razy o zamkniętą piankową podkładkę z siłą wystarczającą do przemieszczenia much na wewnętrzną powierzchnię dna. Następnie drugą ręką naciśnij przycisk nagrywania w kamerze. Po tym uderz cylindrem sześć razy w wyraźnym, nierytmicznym wzorze podczas nagrywania obrazu przez kamerę.Każdą próbę należy przeprowadzać przez dwie minuty, licząc od momentu ostatniego uderzenia w probówkę z muchami. Na koniec muchy należy zutylizować w 95% etanolu. Po zakończeniu próby należy powtórzyć ten test wspinania się 10 razy, używając za każdym razem 20 świeżych much, aby wykryć niewielkie różnice w lokomocji pomiędzy grupami.Umyj cylindry w zmywarce i pozostaw do wyschnięcia na noc, aby można było ich ponownie użyć po zakończeniu eksperymentu. Aby przeanalizować wyniki much, zacznij od oglądania nagrań wideo z każdej próby. Zapisuj całkowitą liczbę much, które przekraczają linię docelową co 10 sekund. Jeśli mucha zejdzie w dół lub spadnie, zapisz tę muchę jako minus jeden, a następną muchę, która przekroczy linię docelową, policz jako tę samą liczbę, co mucha, która zejdzie w dół lub spadła.Na przykład, jeśli 15. mucha spadnie poniżej linii docelowej, następna mucha, która przekroczy tę linię, jest uznawana za 15. muchę, a nie 16. Następnie należy odjąć śmiertelność od całkowitej liczby much, aby otrzymać liczbę much pozostałych na działce próbnej. Procent much powyżej linii docelowej w każdym punkcie czasowym podczas pracy z ciężkimi mutacjami pozwala zaobserwować różne stopnie deficytu wspinania, co można zweryfikować za pomocą różnych testów wspinania.W tym przypadku odnotowano liczbę ośmiodniowych much, które wspięły się na górę pustej fiolki z pożywką po 18 sekundach, co nie wykazało istotnych różnic w zachowaniu wspinaczkowym między dwiema grupami. Z drugiej strony, przy zastosowaniu testu wspinaczkowego opisanego w niniejszym protokole, muchy mutanty Bastin 17-7/TM3 wykazują deficyt sprawności w porównaniu z grupą kontrolną. Ponieważ wiele zaburzeń lokomocyjnych ma charakter postępujący, ważne jest obserwowanie ewolucji stanu much w czasie.W drugim dniu życia obserwuje się istotną różnicę w liczbie much wspinających się powyżej linii docelowej w porównaniu z grupą kontrolną. Zdolność wspinania się ta nadal spada w miarę starzenia się much mutantów od drugiego dnia życia.Po opanowaniu metody, eksperyment oraz analiza mogą zostać przeprowadzone w ciągu trzech godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak kwantyfikować defekty lokomocyjne w modelach mutantów drosophila w schorzeniach neurologicznych.

quantitative-analysis-climbing-defects-drosophila-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Ten film opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania lokomocji muchy i pokazuje przeprowadzony test wspinaczki. Test wspinaczki muchowej jest ogólnym testem funkcji motorycznych, który opiera się na negatywnej odpowiedzi geotaksji.

Test wspinaczki muchowej: metoda testowania ogólnej lokomocji u Drosophila melanogaster

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Ten krok po kroku protokół analizuje zachowanie Drosophila w ujemnej geotaksji za pomocą zautomatyzowanego systemu wielocylindrowego, który pomieści setki much i synchronizuje ich działania za pomocą silnika elektrycznego. Po synchronizacji zachowanie ujemnej geotaksji much jest badane, nagrywane cyfrowo i analizowane za pomocą oprogramowania RflyDetection.

Automatyczne, szybkie, iteracyjne badanie ujemnej geotaksji do analizy zachowania wspinaczy u dorosłych w modelu Drosophila neurodegeneracji

Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Celem tej procedury jest wypreparowanie tkanki mięśnia podłużnego grzbietu (DLM) w celu oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych DLM (NMJs) w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy użyciu Drosophila melanogaster.

Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Ten protokół przedstawia test do modelowania zaparć w modelu choroby Parkinsona opartym na alfa-synukleinie Drosophila.

Pomiar zaparć w modelu choroby Parkinsona Drosophila

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj ilościową analizę wad wspinaczkowych w modelu Drosophila melanogaster dla badań nad zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Ta metoda pozwala wykrywać subtelne defekty lokomocyjne i identyfikować potencjalne cele terapeutyczne.

Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych

Przeglądaj więcej filmów