Analiza ilościowa wad wspinaczkowych w modelu Drosophila zaburzeń neurodegeneracyjnych
June 13th, 2015
Przedstawiamy zoptymalizowany, niedrogi i wiarygodny test negatywnej geotaksji u Drosophila melanogaster jako model zaburzeń neurodegeneracyjnych. Będąc bardziej wrażliwym na łagodne wady narządu ruchu, test ten pomoże w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych interakcji genetycznych i celów leków.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zdolności wspinaczkowej much typu dzikiego i much zmutowanych dla genów zaangażowanych w poruszanie się. Osiąga się to poprzez uprzednie przeniesienie much do szklanego cylindra z podziałką. Drugim krokiem jest przemieszczenie much na dno cylindra poprzez lekkie stukanie cylindrem w piankową wyściółkę.
Kolejne muchy przekraczające linię celu są rejestrowane za pomocą kamery wideo przez dwie minuty. Ostatnim krokiem jest przeanalizowanie filmów i wykreślenie liczby much powyżej linii docelowej co 10 sekund. Ostatecznie test wspinaczkowy służy do identyfikacji defektów zdolności do wspinania się zmutowanych linii muszek owocowych.
Główną zaletą tej techniki lub istniejących technik, takich jak metoda dzika, jest to, że ma ona zdolność wykrywania niewielkich różnic w zdolności wspinaczkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych, takie jak rola określonych genów dziedzicznej paraplegii spastycznej w postępującym upośledzeniu chodu. Implikacją tej techniki jest dążenie do rozwoju terapii.
IP dla zaburzeń neurologicznych, ponieważ zapewnia prosty test ilościowy do testowania odpowiedzi na lek i mutantów dla potencjalnych genów neurodegeneracyjnych Zacznij od znieczulenia 20 much za pomocą dwutlenku węgla i umieść wszystkie muchy w fiolce o wymiarach 25 milimetrów na 95 milimetrów, która zawiera pokarm. Następnie należy przechowywać fiolkę zawierającą muchy poziomo w tekturowej tacy, aby uniknąć uwięzienia ich w płynie, który może gromadzić się na dnie fiolki. Umieść muchy w inkubatorze na co najmniej 21 godzin w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności następnego ranka, ustaw test wspinaczkowy, przenosząc muchy z fiolki do 250-mililitrowego szklanego cylindra z podziałką i uszczelnij górną część folią woskową, aby zapobiec ucieczce much.
Przeprowadź eksperyment w świetle otoczenia w temperaturze 22 stopni Celsjusza i wilgotności 40%. Zawsze wykonuj eksperymenty o tej samej porze dnia, aby uniknąć zakłóceń z cyklami snu. Zaznacz również położenie cylindra na blacie, aby utrzymać go na stałym poziomie każdego dnia.
Policz liczbę martwych much na dnie cylindra i w fiolkach z jedzeniem, zapisz tę liczbę jako śmiertelność. Następnie ustaw kamerę wideo na statywie. Bardzo delikatnie ustaw ostrość aparatu na 190-mililitrowej linii 250-mililitrowego cylindra z podziałką.
Uderz cylindrem od pięciu do 10 razy w podkładkę piankową o zamkniętych komórkach z wystarczającą siłą, aby przemieścić muchy na wewnętrzną powierzchnię dna. Następnie drugą ręką naciśnij przycisk nagrywania w aparacie. Następnie stuknij w cylinder sześć razy w wyraźny nierytmiczny wzór, podczas gdy kamera nagrywa.
Przeprowadzaj każdą próbę przez dwie minuty od czasu ostatniego stuknięcia much. Na koniec wyrzuć muchy w 95% etanolu. Po zakończeniu próby powtórz ten test wspinaczkowy 10 razy, używając za każdym razem 20 świeżych much, aby wykryć niewielkie różnice w lokomocji między grupami.
Umyj cylindry w zmywarce i wysusz przez noc do ponownego użycia po zakończeniu eksperymentu w celu analizy wydajności much, zacznij od obejrzenia filmów z każdego zapisu próby muchy. Całkowita liczba much, które przelatują przez linię celu co 10 sekund. Jeśli mucha zejdzie z powrotem w dół lub spadnie, zapisz tę muchę jako minus jeden i policz następną muchę, która przekroczy linię celu, jako tę samą liczbę, co mucha, która zeszła z powrotem w dół lub spadła.
Na przykład, jeśli 15. mucha spadnie poniżej linii docelowej, następna mucha, która przekroczy linię, jest uważana za 15. muchę, a nie 16. muchę. Następnie odejmij śmiertelność od całkowitej liczby much, aby uzyskać liczbę much, które pozostały na poletku doświadczalnym. Odsetek much powyżej linii docelowej w każdym punkcie czasowym podczas pracy z ciężkimi mutacjami, różne stopnie wady wspinaczkowej można zaobserwować przy użyciu różnych testów wspinaczkowych.
W tym przypadku zarejestrowano liczbę ośmiodniowych much, które wspięły się na wierzch pustej fiolki z jedzeniem po 18 sekundach, nie wykazując znaczącej różnicy w zachowaniu wspinaczkowym między obiema grupami. Z drugiej strony, przy użyciu testu wspinaczkowego z tego protokołu, Bastin 17 dash seven over TM trzy zmutowane muchy wykazują deficyt wydajności w porównaniu z kontrolami. Ponieważ wiele zaburzeń ruchowych ma charakter postępujący, ważne jest, aby obserwować ewolucję much w czasie.
W wieku dwóch dni występuje znaczna różnica w liczbie much, które wspinają się ponad linię docelową. W porównaniu z kontrolami. Ta wydajność wspinaczkowa nadal spada wraz z wiekiem zmutowanych much od dwóch do dwóch dni.
Po opanowaniu tego eksperymentu i analizy można ukończyć w ciągu trzech godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo wady lokomotywy w modelach zmutowanych dola dla zaburzeń neurologicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
W tym artykule przedstawiono zoptymalizowane, niedrogie i niezawodne badanie negatywnej geotaksji u muchy owocowej *Drosophila melanogaster*, służące jako model dla zaburzeń neurodegeneracyjnych. Badanie zostało zaprojektowane tak, aby było bardziej czułe na łagodne wady motoryczne, co ułatwia identyfikację potencjalnych interakcji genetycznych i celów lekowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Testy behawioralne
- Genetyka
Wprowadzenie
- *Drosophila melanogaster* jest powszechnie stosowanym organizmem modelowym w neurobiologii.
- Testy negatywnej geotaksji mierzą zdolność wspinaczkową owadów.
- Identyfikacja wad motorycznych może dostarczyć informacji na temat zaburzeń neurodegeneracyjnych.
- Mutacje genetyczne mogą wpływać na motorykę, co czyni to badanie cennym dla celów badawczych.
Cel badania
- Ilościowe określenie zdolności wspinaczkowej much *Drosophila* dzikich typów i mutantów.
- Identyfikacja wad zdolności wspinaczkowej związanych z konkretnymi mutacjami genetycznymi.
- Przeszukiwanie potencjalnych interakcji genetycznych i celów lekowych związanych z motoryką.
Wykorzystane metody
- Przeniesienie much do szklanego cylindra z podziałką.
- Przemieszczenie much na dno poprzez stuknięcie cylindra.
- Rejestracja much przekraczających linię docelową za pomocą kamery wideo przez dwie minuty.
- Analiza filmów w celu przedstawienia liczby much powyżej linii docelowej co 10 sekund.
Główne wyniki
- Badanie z powodzeniem ilościuje zdolność wspinaczkową u much dzikich typów i mutantów.
- Wykazuje czułość na łagodne wady motoryczne.
- Wyniki mogą informować o potencjalnych interakcjach genetycznych i celach lekowych.
- Metoda jest niezawodna i opłacalna pod względem celów przesiewowych.
Wnioski
- Badanie negatywnej geotaksji jest cennym narzędziem do badania motoryki u *Drosophila*.
- Może pomóc w identyfikacji czynników genetycznych wpływających na zaburzenia neurodegeneracyjne.
- Ta metoda zwiększa zdolność przesiewu potencjalnych celów terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay provides a sensitive, cost-effective method for detecting early locomotor defects in Drosophila models of neurodegenerative disorders, enabling earlier identification of genetic modifiers and therapeutic candidates. By quantifying climbing performance over time, it supports mechanistic de-risking of target hypotheses in discovery pipelines. The method’s reproducibility and scalability make it suitable for screening campaigns aimed at validating disease-relevant mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in locomotion pathways relevant to neurodegenerative disease models.
- Operational Value: Provides quantitative, time-resolved phenotypic readouts for assessing mutant or drug-treated fly performance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects mild climbing defects that may be missed in standard assays, increasing sensitivity for early-stage screening.
- Operational Value: Uses inexpensive, reusable glass cylinders and minimal training, supporting high-throughput compatibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks age-dependent decline in climbing ability, modeling progressive locomotor dysfunction seen in human neurodegeneration.
- Operational Value: Generates longitudinal data to evaluate therapeutic intervention effects over time in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by linking genetic perturbations to quantifiable behavioral phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring locomotor output as a functional readout of neuronal integrity.
- Screening: Enables reproducible quantification of fly climbing to assess compound or genetic modifier effects.
- Analytics: Generates time-series data on fly position, allowing calculation of climbing velocity and endurance metrics.
- Translational Research: Models progressive decline in motor function, aligning with preclinical evaluation of disease-modifying candidates.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol allows reuse across multiple mutant lines and screening campaigns with minimal revalidation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking genotype to quantifiable locomotor phenotype.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tapping, video capture, and blind analysis protocols.
- Strategic Value: Reduces false negatives in early screening by detecting subtle defects, improving hit-to-lead efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic severity and progression.
Implementation Considerations
- Requires basic fly handling and anesthesia skills using CO2.
- Needs a 250 mL glass graduated cylinder, wax film seal, foam pad, tripod, and video recording device.
- Demands consistent environmental conditions (22°C, 40% humidity, same time of day) to minimize variability.
- Requires training in video analysis to score fly crossings and handle falls or reversals correctly.
- Limited to measuring negative geotaxis; does not assess other motor behaviors like flight or gait coordination.
