Name: Hodowla zastawek serca myszy w miniaturowym systemie hodowli tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę hodowli zastawek serca myszy w miniaturowym systemie hodowli tkankowej MTCS. Technika umożliwia analizę histologiczną żywotności, morfologii i rozkładu macierzy pozakomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie jest wspierane przez Holenderską Fundację Serca i Holenderski Instytut Medycyny Regeneracyjnej.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi LUMC komisji etycznej ds. badań na zwierzętach.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywki hodowlanej i MTCS
Uwaga: Wszystkie przygotowania należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym. Komora perfuzyjna MTCS, pułapka bąbelkowa i stojak są opisane w Lieber et al., 201011.
<ol>
	<li>Zdezynfekuj kleszcze i mikronożyczki 70% etanolem. Przygotować strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą 21G ze sterylnym buforem Tyrode'a (130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 6,0 mM Hepes, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 20 mM Glukoza, 1,5 mM CaCl2,2H 2O, pH = 7,2). Przygotować strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą 21 G ze sterylnym roztworem KCl (100 mM).</li>
	<li>Przygotuj 65 ml pożywki na serce: DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą cielęcą, antybiotykiem/antybiotykiem (A/A; 100 jednostek penicyliny, 100 μg streptomycyny i 0,25 ug amfoterycyny B/ml), insuliną-transferyną-selenem (ITS; 10 μg/ml insuliny, 5,5 μg/ml transferyny, 6,7 ng/ml seleninu sodu) i sterylizować filtr.</li>
	<li>Wysterylizuj komorę perfuzyjną i pułapkę bąbelkową, spryskując 70% etanolem i osusz ręcznikiem papierowym. Zmontuj MTCS (rysunek 1D), jednak początkowo bez komory perfuzyjnej. Umieść pułapkę bąbelkową na stojaku. Użyj perystaltycznej pompy rolkowej z łatwymi do załadunku głowicami pompy.
	<ol>
		<li>Za pomocą rurki silikonowej wykonać połączenia między zbiornikiem (probówką 50 ml) a pompą, pompą i pułapką bąbelkową, pułapką bąbelkową i zbiornikiem (patrz rysunek 1D). Rurki wewnątrz inkubatora powinny być wystarczająco długie, aby podłoże osiągnęło równowagę gazową z gazem w inkubatorze przez przepuszczające gaz rurki silikonowe (1 m) i rurki na zewnątrz inkubatora tak krótkie, jak to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 70% etanolem, włącz pompę (prędkość przepływu około 1 ml/min, aby umożliwić prawidłową cyrkulację) i pozwól etanolowi krążyć przez 30 minut, aby wysterylizować wszystkie rurki. Usuń etanol, opróżniając zbiornik i wypompowując etanol z układu.</li>
	<li>Napełnij probówkę o pojemności 50 ml sterylną wodą destylowaną, włącz pompę i pozwól wodzie krążyć przez 30 minut, aby pozbyć się pozostałego etanolu. Usuń wodę, opróżniając zbiornik i wypompowując wodę z systemu.</li>
	<li>Napełnić probówkę o pojemności 50 ml 45 ml pożywki, umieścić podstawkę w inkubatorze. Włączyć pompę (prędkość przepływu około 1 ml/min) i wprowadzić cyrkulację pożywki, aby napełnić wszystkie rurki, usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza i pozwolić, aby medium dostosowało się do składu gazu w inkubatorze przez co najmniej 1 godzinę. Utrzymywać inkubator w standardowych warunkach hodowli tkankowej (5 % CO2 i 37 °C). Upewnij się, że w rurkach nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
2. Izolacja serca myszy
<ol>
	<li>Wstrzyknij myszu 500 jednostek heparyny. Zapobiegnie to krzepnięciu krwi i umożliwi usunięcie krwi z serca. Po 10 minutach znieczulij mysz w komorze indukcyjnej z 4% izofluranem za pomocą precyzyjnego waporyzatora. Znieczulenie jest wystarczające, gdy mysz nie reaguje na szczypanie palców u stóp.</li>
	<li>Przenieś mysz na deskę separacyjną i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na twarz podłączonej do obwodu koncentrycznego. Zdezynfekuj sierść myszy 70% alkoholem. Za pomocą nożyczek otwórz jamę brzuszną, aby odsłonić żyłę główną i przeponę.</li>
	<li>Aby odsłonić serce, wykonaj boczne nacięcia, zaczynając od ostatniego do pierwszych żeber i odbij klatkę piersiową nad głową myszy. Przerwij znieczulenie, ponieważ mysz już nie oddycha. Obserwuj bicie serca.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 21G dołączoną do strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej jałowy bufor Tyrode'a do żyły głównej dolnej z jamy brzusznej do jamy klatki piersiowej (przez przeponę). Upewnij się, że krew może wydostać się z żyły głównej ogonowej po wprowadzeniu igły. Delikatnie i ze stałym naciskiem wtapiaj bufor Tyrode'a do żyły głównej, aż serce częściowo straci swój czerwony kolor. Uwaga: Serce nadal bije, co pozwala na usunięcie krwi z serca.</li>
	<li>Zastąp igłę igłą 21G dołączoną do strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej jałowy roztwór KCl. Delikatnie wlać roztwór KCl do żyły głównej, aż serce przestanie bić, a następnie usunąć igłę. Uwaga: Roztwór KCl zachowuje serce w zrelaksowanej fazie rozkurczowej, co umożliwi łatwiejsze wprowadzenie igieł perfuzyjnych i perfuzję układu wieńcowego.</li>
	<li>Lekko unieś serce za pomocą zakrzywionych kleszczy i nożyczek, wypreparuj serce z otaczających tkanek, ale pozostaw tętnice i żyły proksymalne sercu nienaruszone i przyczepione do serca. Przenieść serce do 15 ml probówki zawierającej lodowaty PBS uzupełniony antybiotykiem/antybiotykiem (A/A). Przechowuj serce w lodowatym PBS do 3 godzin.</li>
</ol>
3. Kaniulacja serc myszy w komorze perfuzyjnej
<ol>
	<li>Wszystkie procedury należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym. Przenieść wyizolowane serce z probówki o pojemności 15 ml na 10-centymetrową szalkę Petriego i dodać PBS uzupełniony A/A.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj mikronożyczek i kleszczy, aby usunąć całą tkankę niesercową, ale zachowaj aortę wstępującą co najmniej do rozwidlenia z tętnicą ramienno-głowową i żyłami płucnymi, 2 mm proksymalnie do serca. Odetnij czubek wierzchołka serca, aby uzyskać dostęp do światła lewej komory (zwykle 2 mm). Umieść komorę perfuzyjną w okapie przepływowym pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Przymocować strzykawkę o pojemności 5 ml z podłożem do igły za pomocą silikonowej rurki. Napełnij komorę perfuzyjną 20 ml pożywki i umieść serce na etapie rotacji pomiędzy 2 igłami w komorze perfuzyjnej (ryc. 1). Dostosuj wysokość etapu rotacji tak, aby serce znajdowało się przed igłami.</li>
</ol>
4. Podwiązanie do hodowli zastawki mitralnej (patrz rysunek 1)
<ol>
	<li>Podwiązać aortę za pomocą szwu (jedwab 7,0). Podwiązać uszek lewego przedsionka za pomocą szwu. Wbić igłę (nr 1 na rysunku 1) przez żyłę płucną do lewego przedsionka i podwiązać szwem proksymalnie do jego wejścia do lewego przedsionka. Upewnij się, że igła nie znajduje się zbyt głęboko w lewym przedsionku, ponieważ mogłoby to uszkodzić zastawkę mitralną.</li>
	<li>Wprowadzić igłę (nr 2 na rysunku 1) ruchem liniowym do lewej komory. Przenieść pożywkę z komory perfuzyjnej do probówki o pojemności 50 ml. Uszczelnij igłę do mięśnia sercowego za pomocą biokompatybilnego kleju.</li>
	<li>Po wyschnięciu kleju ostrożnie wstrzyknąć pożywkę do serca, podłączając strzykawkę wypełnioną pożywką do igły nr 1 i sprawdzić, czy nie ma wycieków. Upewnić się, że podłoże wydostaje się z igły nr 2, a ostatnia pozostała krew jest perfundowana z serca.</li>
</ol>
5. Podwiązanie do hodowli zastawki aortalnej (patrz rysunek 1)
<ol>
	<li>Włóż igłę (nr 1 na rysunku 1) do aorty i podwiązaj za pomocą szwu. Upewnij się, że igła nie jest zbyt głęboko w aorcie, ponieważ mogłoby to uszkodzić zastawkę aortalną. Wprowadzić igłę (nr 2 na rysunku 1) ruchem liniowym do lewej komory. Przenieść pożywkę z komory perfuzyjnej do probówki o pojemności 50 ml. Uszczelnij igłę do mięśnia sercowego za pomocą biokompatybilnego kleju.</li>
	<li>Po wyschnięciu kleju ostrożnie wstrzyknąć pożywkę do serca, podłączając strzykawkę wypełnioną pożywką do igły nr 2 i sprawdzić, czy nie ma wycieków. Upewnić się, że podłoże wydostaje się z igły nr 1, a ostatnia pozostała krew jest perfundowana z serca.</li>
</ol>
6. Umieść komorę perfuzyjną na stojaku
<ol>
	<li>Napełnić komorę perfuzyjną 20 ml przeniesionego podłoża. Umieść uszczelkę i pokrywę na komorze i dokręć podkładką i.</li>
	<li>Wyjąć zmontowany MTCS z inkubatora. Zamocuj komorę perfuzyjną na stojaku. Podłącz rurkę (patrz rysunek 1D). Umieścić stanowisko w inkubatorze (5%CO2 i 37 °C). Podłącz rurkę do pompy. Włączyć pompę przy prędkości przepływu około 600 μl/min.</li>
	<li>Upewnij się, że w zbiorniku i/lub pułapce bąbelkowej poziom pożywki pozwala na wizualizację obecności przepływu przez opadanie kropli napływającego medium. Po posiewie serce jest usuwane z systemu, utrwalane i przetwarzane do badania histologicznego.</li>
</ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2014+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 129, e28-e292 (2013).</li>
<li>Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+and+Cellular+Response+Feedback+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).</li>
<li>Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrioventricular+valve+development+during+late+embryonic+and+postnatal+stages+involves+condensation+and+extracellular+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling.</a> Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).</li>
<li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+valves+and+valvular+pathology%3A+update+on+function%2C+disease%2C+repair%2C+and+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+pathology%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement.</a> Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).</li>
<li>Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+and+mechanobiology+of+aortic+valve+inflammation+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+inflammation%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification.</a> International journal of inflammation. , 263870(2011).</li>
<li>Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+the+Aortic+Heart+Valve%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+heart+valve+disease%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of the Aortic Heart Valve.</a> The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).</li>
<li>Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+study+of+the+biological+properties+of+porcine+aortic+valves+in+response+to+circumferential+cyclic+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch.</a> Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).</li>
<li>Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+analysis+of+dynamic+deformation+characteristics+of+native+aortic+valve+leaflets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets.</a> Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).</li>
<li>Combs, M. D., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+development%3A+Regulatory+networks+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Heart valve development: Regulatory networks in development and disease.</a> Circulation Research. 105, 408-421 (2009).</li>
<li>Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2+and+BMP+signaling+in+cardiac+cushion+formation%3A+lessons+from+mice+and+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).</li>
<li>Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+miniature+tissue+culture+system+to+culture+mouse+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves.</a> Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Kluczowe kroki w hodowli zastawek serca myszy obejmują jak najkrótszy czas między wycięciem serca myszy a podwiązaniem w komorze perfuzyjnej, aby zapewnić żywotność i podwiązanie igieł prostopadłych do zastawek, aby zapewnić właściwy kierunek przepływu. Dodatkowo sprawdzenie przepływu po podwiązaniu w komorze perfuzyjnej bez medium zapewnia prawidłowe wprowadzenie i podwiązanie igieł. Bardzo ważne jest, aby utrzymać sterylną kulturę i zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w przewodach, które mogą potencjalnie zostać...

Choroba zastawek serca jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności w świecie zachodnim; jej częstość występowania wzrasta wraz z wiekiem i dotyka ponad 10% populacji w wieku 75 lat istarszych1. Najczęściej dotknięte są zastawki układowej części serca, zastawki aortalnej i mitralnej. Choroba zastawek serca charakteryzuje się utratą wysoce zorganizowanej struktury zastawek, co skutkuje zmianą właściwości mechanicznych2. Integralność strukturalna ma zatem kluczowe znaczenie dla funkcjonowania zaworu.
Listki zastawki składają się z komórek śródmiąższowych zastawek (VIC), komórek śródbłonka zastawkowego (VEC) i macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest wysoce zorganizowana w warstwowy wzór3,4. VIC są odpowiedzialne za syntezę, degradację i organizację ECM. Czynniki pochodzące z krwiobiegu, EC lub rezydujące w ECM działają na VIC, koordynując jego funkcję. Ponadto siły mechaniczne działają na płatek podczas cyklu pracy serca, powodując laminarne lub oscylacyjne naprężenia ścinające, naprężenia ściskające lub rozciągające wpływające na zachowanie VIC5.
Aby zrozumieć, jak regulowana jest struktura zastawki, najpierw należy zrozumieć, jak VIC reagują na różnorodny zestaw bodźców doświadczanych podczas cyklu pracy serca. Badania in vitro dostarczyły wielu informacji na temat charakterystyki i zdolności komórek zastawkowych. Odpowiedź tych komórek in vitro może jednak nie zawsze dokładnie naśladować odpowiedź in vivo 6; na przykład odpowiedź VIC na bodźce zależy od obecności EC i składu ECM5. Ponadto odpowiedź komórek zastawkowych na bodźce zależy od ich konkretnego umiejscowienia w ulotce7. Oprócz bodźców biochemicznych o zachowaniu komórek zastawkowych decydują siły mechaniczne działające na zastawkę8. Każdy obszar zaworu jest poddawany własnemu specyficznemu zestawowi naprężeń hemodynamicznych. Chociaż obecne modele ex vivo wykazały, że siły mechaniczne są ważnymi determinantami struktury zastawkowej5, związane z tym mechanizmy są nadal niejasne. Podczas gdy modele in vivo dostarczyły informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju zastawek9,10, wgląd w biologię zastawek u dorosłych jest nadal nieuchwytny.
Dlatego opracowano model przepływu ex vivo, w którym zastawki serca mogą być hodowane w ich naturalnej pozycji w sercu przez dłuższy okres czasu11. Ma to tę zaletę, że zastawki pozostają w swojej naturalnej konfiguracji, a VIC doświadczają tego samego środowiska, co in vivo, dzięki czemu reakcje VIC na bodźce są tak naturalne, jak to tylko możliwe. Ponadto hodowla zastawek w ich naturalnym położeniu w sercu ułatwia poddanie każdego obszaru zastawkowego odpowiednim obciążeniom hemodynamicznym. W tym modelu ex vivo, czyli Miniaturowym Systemie Hodowli Tkankowej (MTCS), zastawki mogą być poddawane różnym bodźcom biochemicznym i hemodynamicznym, co pozwala na zbadanie ich roli w przebudowie zastawki serca.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Technologie życia</td><td>w surowicy bydlęcej dla płodu</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Technologie życia</td><td>insuliny-transferyny-selenu</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicze</td><td>technologie życia</td><td>15240-06</td><td></td></tr><tr><td>Silk 7-0</td><td>Ethicon</td><td>768G</td><td></td></tr><tr><td>100 mm naczynie</td> <td>hodowlaneGreiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>5 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>21 G igła</td><td>BD</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki, ekonomiczne, Vannas typu</td><td>Tedpella</td><td>1346</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>8060-0020</td><td>ID x OD x Ścianka: 1,59 x 3,18 x 0,79 mm</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa do pompy</td><td>Masterflex</td><td>96400-13</td><td>ID x OD x Ścianka: 0,8 x1,59 x 0,40 mm</td></tr><tr><td>Biokompatybilny klej (Histoacryl)</td><td>B.</td> Waporyzator precyzyjny Braun <td>1050071</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dr&auml; ger</td><td>Vapor 200</td><td></td></tr><tr><td>perystaltyczna pompa rolkowa</td><td>Masterflex</td><td>7521-35</td><td></td></tr><tr><td>Łatwa do załadowania głowica pompy</td><td>Masterflex</td><td>7518-00</td><td></td></tr><tr><td>Komora przepływowa</td><td></td><td></td><td>patrz Lieber et al., 2010</td></tr><tr><td>Pułapka</td><td></td><td></td> bąbelkowa <td>patrz Lieber et al., 2010</td></tr></tbody></table>

hodowla zastawek serca myszy w miniaturowym systemie hodowli tkankowej

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Choroba zastawek serca jest głównym obciążeniem w świecie zachodnim i nie ma skutecznego leczenia. Wynika to głównie z braku wiedzy na temat molekularnych, komórkowych i mechanicznych mechanizmów leżących u podstaw utrzymania i/lub utraty struktury zastawkowej. 
Obecne modele używane do badania biologii zastawek obejmują hodowle in vitro komórek śródbłonka zastawkowego i śródmiąższowego. Chociaż modele hodowli in vitro dostarczają zarówno mechanizmów komórkowych, jak i molekularnych, mechanizmy zaangażowane w organizację 3D zastawki pozostają niejasne. Podczas gdy modele in vivo dostarczyły informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju zastawek, wgląd w biologię zastawek u dorosłych jest nadal nieuchwytny. 
Aby móc badać regulację zastawkowej organizacji 3D na poziomie tkankowym, komórkowym i molekularnym, opracowaliśmy Miniaturowy System Hodowli Tkanek. W tym modelu przepływu ex vivo zastawka mitralna lub aortalna jest hodowana w swoim naturalnym położeniu w sercu. Naturalna konfiguracja i skład ulotki są zachowane, co pozwala na jak najbardziej naturalną reakcję komórek zastawkowych na bodźce. Zawory zachowują żywotność i reagują na zmieniające się warunki środowiskowe. Ten MTCS może przynieść korzyści w badaniu pytań, w tym między innymi, w jaki sposób organizacja 3D wpływa na biologię zastawek, jakie czynniki wpływają na organizację 3D zastawki i która sieć ścieżek sygnałowych reguluje organizację 3D zastawki.

Zastawkę aortalną (Rycina 2) lub zastawkę mitralną11 można hodować przez co najmniej 3 dni. Dzięki hodowli w pozycji otwartej (która odpowiada pozycji skurczowej dla zastawki aortalnej i pozycji rozkurczowej dla zastawki mitralnej), komórki zastawkowe pozostają żywotne. Nie obserwuje się śmierci komórek, co potwierdzono brakiem komórek wykazujących pozytywny wynik testu TUNEL (Rycina 2H,I) lub brakiem ekspresji rozszczepionej kaspazy-3 (nie pokazano, Lieber et al., 20...

Tutaj prezentujemy model przepływu ex vivo, w którym mysie zastawki mogą być hodowane, co pozwala na badanie biologii zastawki.

Hodowla zastawek serca myszy w miniaturowym systemie hodowli tkankowej

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla zastawek serca myszy z wykorzystaniem miniaturowego systemu hodowli tkanek (MTCS). Jest to realizowane poprzez wstępny montaż systemu MTCS bez komory perfuzyjnej oraz cyrkulację pożywki w celu przygotowania układu. W drugim kroku pobierane jest serce myszy i przygotowywane do kaniulacji.Następnie serce umieszcza się w komorze perfuzyjnej, gdzie przeprowadza się kanulację w celu hodowli zastawki mitralnej lub aortalnej. Komora perfuzyjna zostaje następnie umieszczona w systemie MTCS i uruchomiona zostaje pompa. W końcowym etapie stosuje się analizę histologiczną, aby ocenić żywotność, morfologię oraz rozkład macierzy zewnątrzkomórkowej zastawki.W pierwszej kolejności należy użyć odcinków rurek silikonowych do wykonania połączeń między zbiornikiem a pompą, pomiędzy pompą a pułapką pęcherzykową oraz pomiędzy pułapką pęcherzykową a zbiornikiem. Po podłączeniu wszystkich rurek należy napełnić zbiornik 70% etanolem.Włącz pompę, ustawiając prędkość przepływu na 1 ml/min, i pozwól etanolowi krążyć w celu sterylizacji cewki. Po 30 minutach opróżnij zbiornik i wypompuj etanol z układu. Następnie napełnij zbiornik sterylną wodą destylowaną i prz

culturing-mouse-cardiac-valves-in-the-miniature-tissue-culture-system

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kultywowanie zwierzęcych zastawek serca w miniaturowym systemie hodowli tkankowej

W tym filmie pokazujemy izolację komórek śródmiąższowych zastawki aortalnej z serca dorosłej myszy za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy i ich późniejszą hodowlę w małej ilości pożywki wzrostowej.

Izolacja komórek śródmiąższowych zastawki myszy: enzymatyczna metoda izolowania i hodowli VIC z mysiej zastawki aortalnej

Ten film demonstruje technikę oceny zwapnienia komórek śródmiąższowych zastawki aortalnej in vitro. Test pomaga określić ilościowo stężenie wapnia za pomocą odczynnika arsenazo III, barwnika wrażliwego na wapń, który reaguje z jonami wapnia, tworząc fioletowy kompleks wapniowo-arsenazowy.

Test zwapnienia do pomiaru stężenia wapnia w komórkach śródmiąższowych zastawki aortalnej

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Badania rozwojowe na myszach są utrudnione przez niedostępność zarodka podczas ciąży. Aby promować długoterminową hodowlę embrionalnego serca w późnych stadiach ciąży, opracowaliśmy protokół, w którym wycięte serce jest hodowane w półstałym, rozcieńczonym Matrigelu.

Nowatorska metoda hodowli ex vivo embrionalnego serca myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Aby zrozumieć komórkowe i molekularne mechanizmy leżące u podstaw powstawania nowotworów i rozwoju zwężeń w zastawkach serca z inżynierii tkankowej, opracowano mysi model heterotopowego przeszczepu zastawki serca. Zastawkę płucną serca przeszczepiono biorcy przy użyciu techniki heterotopowego przeszczepiania serca.

Przeszczepienie zastawki płucnej z wykorzystaniem mysiego modelu heterotopowego przeszczepienia serca

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Modele angiogenezy wieńcowej in vitro mogą być wykorzystane do odkrycia komórkowych i molekularnych mechanizmów angiogenezy wieńcowej. Hodowle eksplantatów in vitro tkanek zatok żylnych i wsierdzia wykazują silny wzrost w odpowiedzi na VEGF-A i wykazują podobny wzór ekspresji COUP-TFII jak in vivo.

Model angiogenezy wieńcowej in vitro

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Ten artykuł opisuje izolację komórek mysiej zastawki aortalnej za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy. Izolowane komórki zastawki myszy są ważne dla wykonywania różnych testów, takich jak test zwapnienia in vitro, oraz dla badania szlaków molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki aortalnej.

Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Poznaj metodę hodowli zastawek serca myszy w miniaturowym systemie hodowli tkankowej MTCS. Technika umożliwia analizę histologiczną żywotności, morfologii i rozkładu macierzy pozakomórkowej.

Hodowla zastawek serca myszy w miniaturowym systemie hodowli tkankowej

Przeglądaj więcej filmów