Name: Analiza funkcji komórek tucznych in vivo przy użyciu myszy typu mastucyjnego knock-in (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę analizy funkcji komórek tucznych in vivo poprzez przeszczepienie komórek szpikowych do myszy pozbawionych komórek tucznych. Technika ta umożliwia ocenę fenotypu i dystrybucji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.G. jest laureatem stypendiów francuskiej "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" i Fundacji Philipp; R.S. jest wspierany przez Lucile Packard Foundation for Children's Health oraz Stanford NIH/NCRR CTSA award numer UL1 RR025744; P.S. jest wspierany przez stypendium Maxa Kade'a Fundacji Maxa Kade'a i Austriackiej Akademii Nauk oraz stypendium Schroedingera Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF): J3399-B21; S.J.G. dziękuje za wsparcie ze strony grantów National Institutes of Health U19 AI104209, NS 080062 oraz z Programu Badań nad Chorobami Związanymi z Tytoniem na Uniwersytecie Kalifornijskim; L.L.R. dziękuje za wsparcie ze strony Arthritis National Research Foundation (ANRF) i grantu National Institutes of Health K99AI110645.

Wszystkie eksperymenty i opieka nad zwierzętami były prowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Stanforda.
1. Wytwarzanie i charakterystyka hodowanych komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMCMC).
Uwaga: BMCMC dawcy powinny być generowane z komórek szpiku kostnego o tym samym tle genetycznym, co myszy z niedoborem MC biorcy. BMCMC dawcy pochodzącego od samców nie nadają się do wszczepiania samic myszy. BMCMC dawcy pochodzenia żeńskiego będą z powodzeniem wszczepiane zarówno do biorców płci męskiej, jak i żeńskiej.
<ol>
	<li>Ekstrakcja szpiku kostnego.
	<ol>
		<li>Wlać sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 6-dołkowej płytki hodowlanej (1 dołek na mysz) i umieścić na lodzie.</li>
		<li>Namocz narzędzia preparacyjne w 70% etanolu do sterylizacji.</li>
		<li>Poddaj myszy dawcy eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2), a następnie zwichnięcie szyjki macicy, a następnie spryskaj myszy 70% etanolem w miejscach manipulacji.</li>
		<li>Użyj sterylnych narzędzi preparacyjnych, aby wydobyć kości udowe, piszczelowe i strzałkowe bez przecinania nasad kostnych.</li>
		<li>Zabezpieczając kości kleszczami, zeskrob całą tkankę z kości (i wyrzuć kość strzałkową) za pomocą sterylnych nożyczek (lub ostrzy skalpela). Umieść kości w PBS na lodzie, aż wszystkie kości zostaną zebrane.</li>
		<li>Wykonaj wszystkie pozostałe kroki w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych. Za pomocą sterylnych narzędzi zabezpiecz kości kleszczami i odetnij obie nasady, aby odsłonić jamę szpikową.</li>
		<li>Używając strzykawek o pojemności 3 ml i igieł 30 G oraz pożywki do płukania na zimno (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą [FCS, inaktywowaną termicznie], 2 mM L-glutaminy, 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, 50 μM β-merkaptoetanolu), przepłucz czerwony szpik kostny na szalkę Petriego.</li>
		<li>Użyj tej samej strzykawki do dysocjacji przepłukanych skupisk komórek szpiku kostnego poprzez wielokrotne delikatne zasysanie i wyrzucanie.</li>
		<li>Zebrać szpik kości udowej i piszczelowej od każdej myszy w jednej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Napełnić probówkę zimnym środkiem do płukania w celu przepłukania komórek szpiku kostnego i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultura BMCMC.
	<ol>
		<li>Usunąć supernatant i odzyskać granulowane komórki szpiku kostnego w 10 ml pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą cielęcą [FCS, inaktywowaną termicznie], 2 mM L-glutaminy, 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, 50 μM β-merkaptoetanolem i 20% pożywką kondycjonowaną komórkami WEHI-3 [jako źródło IL-3; alternatywnie należy użyć rekombinowanej mysiej IL-3 w stężeniu 10 ng / ml]).</li>
		<li>Umieścić komórki w kolbie do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości (np. T25 dla 1 myszy, T75 dla 2 myszy itp.).</li>
		<li>1-2 dni po posianiu komórek, przenieść pożywkę i komórki zawiesiny (pozostawiając resztki i przylegające komórki przyklejające się do dna kolby) do nowej kolby i dodać świeżą pożywkę hodowlaną (10 ml/mysz).</li>
		<li>W ciągu kolejnych tygodni karmić komórki co 3-4 dni (dodawać 10 ml pożywki na mysz). Utrzymuj gęstość komórek w zakresie 2,5 x 105-1 x 106 komórek/ml. Nieprzylegające komórki przenosić do nowej kolby raz w tygodniu, aż do momentu, gdy w kolbie hodowlanej nie będzie żadnych przylegających komórek. Badanie dojrzałości komórek (patrz poniżej) przed użyciem do testów in vitro lub wszczepienia myszom z niedoborem MC. 
		UWAGA: Całkowite zróżnicowanie BMCMC zajmie 4-6 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena dojrzałości BMCMC.
	<ol>
		<li>Korzystanie z cytometrii przepływowej.
		<ol>
			<li>Umyj komórki (5 x 104-5 x 105 komórek/warunek) lodowatym buforem FACS (PBS, 0,5% FCS) w 5 ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odsysać supernatant.</li>
			<li>Rozcieńczyć przeciwciała monoklonalne anty-mysie CD16/32 (klon 93 lub 2,4G2) w stosunku 1:200 (2,5 μg/ml) w buforze FACS. Dodać 10 μl do każdej granulki i ponownie zawiesić przez krótkie wirowanie. Inkubować 5 minut na lodzie, aby zablokować wiązanie Fc. 
			UWAGA: Chroń próbki przed bezpośrednim światłem na wszystkich pozostałych etapach.</li>
			<li>Rozcieńczony fikoerytryną (PE) sprzężony z mysią przeciw-myszą Fc εRI α (klon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) i sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) anty-mysi zestaw (CD117; klon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("roztwór barwiący") lub odpowiednie znakowane przeciwciała kontrolne izotypu w buforze FACS ("roztwór kontrolny izotypu").</li>
			<li>Podzielić połowę zablokowanych komórek z kroku 1.3.1.2) na dodatkową probówkę z okrągłym dnem z polistyrenu i dodać 20 μl "roztworu barwiącego" do jednej probówki i 20 μl "roztworu kontrolnego izotypu" do drugiej probówki. Inkubować 30 minut na lodzie.</li>
			<li>Dodać 3 ml lodowatego buforu FACS i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl buforu FACS zawierającego 1 μg/ml jodku propidyny (PI, do identyfikacji martwych komórek). Przejdź do analizy cytometrii przepływowej (patrz rysunek 2A).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Za pomocą barwienia błękitem toluidyny.
		<ol>
			<li>Przemyć 1 x 105 komórek raz PBS przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać i ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS.</li>
			<li>Przenieść zawiesinę komórek do przygotowanego cytolejka przymocowanego do szkiełka mikroskopowego i przystąpić do cytowirowania przy użyciu cytowirówki (40 x g przez 5 min).</li>
			<li>Susz szkiełka na powietrzu przez 10 minut i narysuj woskowy okrąg wokół komórek za pomocą pisaka PAP. Dodaj 0,1% roztworu błękitu toluidynowego, aby pokryć komórki. Inkubować przez 1 minutę. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę, a następnie susz je na powietrzu przez 10 minut.</li>
			<li>Komórki szkiełka nakrywkowego za pomocą podłoża montażowego. Przejdź do analizy pod mikroskopem świetlnym (patrz rysunek 2B)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wszczepienie myszy z niedoborem komórek tucznych za pomocą BMCMC.
<ol>
	<li>Wszczepienie ucha przez wstrzyknięcie śródskórne (i.d.). 
	UWAGA: W celu adoptywnego przeniesienia BMCMC do małżowiny usznej uszu myszy z niedoborem MC zalecamy wykonanie dwóch wstrzyknięć po 1 x 106 komórek każda (w sumie 2 x 106 komórek) na małżowinę uszną. Śródskórne wszczepienie BMCMC do małżowin usznych uszu myszy z niedoborem MC było stosowane przez wielu badaczy w kilku modelach, w tym w modelach biernej anafilaksji skórnej (PCA)24,27, obronie gospodarza przed jadami28 i przewlekłych reakcjach nadwrażliwości (CHS)29,30.
	<ol>
		<li>Policz i ponownie zawieś komórki w 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/25 μl) w zimnym DMEM. Przenieść roztwór BMCMC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30 G. Przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.</li>
		<li>Znieczulenie 4-6 tygodniowych myszy z niedoborem MC za pomocą izofluranu (2,5% v/v). Sprawdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, dostosuj izofluran, jeśli jest to wskazane i kontynuuj monitorowanie oddechu i reakcji na uszczypnięcie palca u nogi przez cały zabieg. Nałóż maść okulistyczną z patyczkiem higienicznym, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
		<li>Palcem wskazującym wytwórz pionowy nacisk na grzbietową powierzchnię małżowiny usznej, aby odsłonić i rozciągnąć twarz brzuszną.</li>
		<li>Wykonać dwa wstrzyknięcia roztworu BMCMC o średnicy wewnętrznej 25 μl w dwa różne miejsca brzusznej powierzchni małżowiny usznej, pierwsze wstrzyknięcie w środek ucha, a drugie wstrzyknięcie w kierunku czubka małżowiny usznej. Odczekaj 4-6 tygodni po wszczepieniu i.d. przed wykonaniem eksperymentów in vivo. 
		Uwaga: Z naszego doświadczenia wynika, że do tego czasu liczba MCs/mm2 skóry właściwej w centralnej części małżowiny usznej jest na ogół podobna do tej w odpowiedniej lokalizacji u myszy typu dzikiego, podczas gdy liczba MCs/mm2 na obrzeżach małżowin usznych ucha jest zwykle znacznie niższa niż u odpowiednich myszy typu dzikiego27,28. Należy o tym pamiętać przy projektowaniu eksperymentów z takimi myszami z implantami MC (np. środki o możliwym wpływie na funkcję MC powinny być wstrzykiwane w centralną część małżowiny usznej, a analiza efektów takich zabiegów powinna również koncentrować się na tym obszarze).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszczepienie jamy otrzewnej przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.). 
	UWAGA: Adoptywne przeniesienie BMCMC do jamy otrzewnej myszy z niedoborem MC będzie wymagało jednego wstrzyknięcia 2 x 106 komórek na mysz. Takie wstrzyknięcia BMCMC i.p. myszom z niedoborem MC były wykorzystywane przez wiele grup do badania roli MC otrzewnej w różnych modelach, w tym w modelach obrony gospodarza przed jadami31 lub posocznicą bakteryjną32,33.
	<ol>
		<li>Policz odpowiednią liczbę komórek i ponownie zawiesić przy 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/200 μl) w zimnym DMEM. Przenieść roztwór BMCMC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o pojemności 25 g. Przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.</li>
		<li>Wykonaj 1 wstrzyknięcie 200 μl roztworu BMCMCs do jamy otrzewnej 4-6 tygodniowych myszy z niedoborem MC. Odczekaj 4-6 tygodni po wszczepieniu i.p. przed wykonaniem eksperymentów in vivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszczepienie we wstrzyknięciu dożylnym (dożylnym). 
	UWAGA: Adoptywny transfer BMCMC przez wstrzyknięcie dożylne myszom z niedoborem MC będzie wymagał jednego wstrzyknięcia 5 x 106 komórek na mysz. Dożylne (dożylne) wstrzyknięcia BMCMC myszom z niedoborem MC były stosowane przez wiele grup do badania roli MC w różnych modelach choroby, w tym w modelach infekcji pęcherza moczowego34, astmy35, zwłóknienia płuc36 i zapalenia stawów za pośrednictwem przeciwciał37.
	<ol>
		<li>Policz odpowiednią liczbę komórek i ponownie zawieś przy 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) w zimnym DMEM. Przenieść roztwór BMCMC do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30 G. Przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.</li>
		<li>Znieczulenie 4-6 tygodniowych myszy z niedoborem MC za pomocą izofluranu (2,5% v/v). Sprawdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, dostosuj izofluran, jeśli jest to wskazane i kontynuuj monitorowanie oddechu i reakcji na uszczypnięcie palca u nogi przez cały zabieg. Nałóż maść okulistyczną z patyczkiem higienicznym, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
		<li>Wykonać jedno wstrzyknięcie 200 μl roztworu BMCMC do żyły ogonowej (lub, alternatywnie, żyły zaoczodołowej) myszy z niedoborem MC. Odczekaj 12 tygodni po wszczepieniu dożylnym przed wykonaniem eksperymentów in vivo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza myszy z niedoborem komórek tucznych po szczepieniu.
<ol>
	<li>Analiza wszczepienia ucha.
	<ol>
		<li>Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Odizolować małżowiny uszne ucha i utrwalić w 10% (obj./obj.) buforowanej formalinie przez noc w temperaturze 4 °C. Zanurzyć stałe małżowiny uszne w parafinie, wyciąć 4 μm odcinki małżowiny usznej i zamontować na szkiełkach podstawowych.</li>
		<li>Zabarwić szkiełka 0,1% roztworem błękitu toluidynowego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka w wodzie z kranu przez 1 minutę, a następnie susz na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Szkiełko nakrywkowe szkiełkuje za pomocą podłoża montażowego, a następnie policz liczbę wszczepionych MC na odcinki małżowin usznych za pomocą mikroskopu świetlnego. Oceń skuteczność wszczepienia, porównując procent i rozmieszczenie MC w skórze ucha wszczepionych myszy w porównaniu z myszami typu dzikiego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wszczepienia jamy otrzewnej.
	<ol>
		<li>Ocena liczby komórek tucznych w jamie otrzewnej.
		<ol>
			<li>Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Ostrożnie usuń brzuszną skórę myszy, nie przerywając jamy otrzewnej.</li>
			<li>Wstrzyknąć 5 ml zimnego lub pokojowego PBS do jamy otrzewnowej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę o pojemności 25 g. Stosuj zimny PBS, aby zmniejszyć ryzyko aktywacji komórek otrzewnej (jest to bardzo ważne przy ocenie degranulacji MC otrzewnej lub poziomu niektórych produktów pochodzących z MC w płynie z płukania otrzewnej). Wykonuj masaż brzucha przez 20 sekund, aby pobrać komórki otrzewnej.</li>
			<li>Powoli odessać płukanie otrzewnowej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę 22 G. Zapisz objętość zasysanego płukania (spodziewaj się odzyskania do 80% wstrzykniętej objętości).</li>
			<li>Przenieść płyn z płukania otrzewnowej do probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml polistyrenu i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant. Odzyskaj osad w 400 μl zimnego PBS.</li>
			<li>Policz całkowitą liczbę komórek otrzewnej za pomocą komory hemocytometru. Do analizy metodą cytometrii przepływowej (zgodnie z opisem w kroku 1.3.1) należy użyć połowy zawiesiny komórkowej w celu oceny procentowej i ekspresji markera wszczepionych MC w jamie otrzewnej. Pomnóż całkowitą liczbę komórek otrzewnej przez procent MC, aby uzyskać bezwzględną liczbę MC otrzewnej.</li>
			<li>Wykonaj cytowirowanie z pozostałymi komórkami, jak opisano w kroku 1.3.2.2. Suszyć szkiełka na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i narysować woskowy okrąg wokół komórek za pomocą pisaka PAP.</li>
			<li>Przykryj komórki nierozcieńczonym roztworem barwiącym May-Grünwald na 5 minut, a następnie umyj w PBS przez 5 minut, w obu przypadkach w temperaturze pokojowej. Przykryj komórki barwnikiem Giemsa rozcieńczonym w stosunku 1:20 wodą dejonizowaną i inkubuj 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka 2 razy w wodzie z kranu przez 1 minutę, a następnie wysusz je na powietrzu.</li>
			<li>Szkiełko nakrywkowe należy pobrać za pomocą podłoża montażowego i obliczyć procent wszczepionych MC za pomocą mikroskopu świetlnego (licząc co najmniej 400 komórek ogółem). Oceń skuteczność wszczepienia, porównując procent MC w płukaniu otrzewnowej myszy wszczepionych w porównaniu z myszami typu dzikiego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ocena komórek tucznych w oknach krezkowych.
		<ol>
			<li>Po płukaniu otrzewnej opisanym w kroku 3.2.1 należy rozciąć błonę otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy myszy. Ułóż od 4 do 5 okien krezkowych na jedną mysz na slajdzie.</li>
			<li>Utrwalić szkiełka na 1 godzinę w roztworze Carnoya (3:2:1 obj./obj./obj. etanolu, chloroformu i lodowatego kwasu octowego) w temperaturze pokojowej. Wysuszyć szkiełka na powietrzu i usunąć jelito (stałe okienka krezkowe pozostaną przymocowane do szkiełek).</li>
			<li>Preparaty barwić przez 20 minut w temperaturze pokojowej roztworem barwiącym Csaba (błękit alcyjski/Safranina O).
			<ol>
				<li>Aby uzyskać 500 ml barwienia Csaba, należy przygotować 500 ml buforu octanowego, mieszając 100 ml 1 M roztworu octanu sodu ze 120 ml 1 M HCl. Uzupełnić do 500 ml wodą dejonizowaną i dostosować pH do 1,42. Następnie rozpuścić 90 mg Safraniny [na czerwono oznaczone jako »dojrzałe MCs«], 1,8 g błękitu alcian [oznaczając »niedojrzałe MCs« na niebiesko] i 2,4 g siarczanu żelazowo-amonowego NH4Fe(SO4)2 w 500 ml buforu octanowego.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Szkiełko nakrywkowe szkiełkuje za pomocą podłoża montażowego, a następnie policz liczbę wszczepionych MC w oknie krezkowym za pomocą mikroskopu świetlnego. Oceń skuteczność wszczepienia, porównując procent i rozmieszczenie MC w oknach krezkowych wszczepionych myszy w porównaniu z myszami typu dzikiego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wszczepienia dożylnego.
	<ol>
		<li>Pod koniec eksperymentu należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy, a następnie pobrać tkankę będącą przedmiotem zainteresowania (np. płuca, skórę lub śledzionę) i utrwalić przez noc w 10% (obj. / obj.) buforze formaliny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Utrwalone chusteczki zatopić w parafinie, wyciąć odcinki 4 μm i zamontować na szkiełkach podstawowych. Zabarwić szkiełka 0,1% roztworem błękitu toluidynowego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka w wodzie z kranu przez 1 minutę, a następnie susz je na powietrzu przez 10 minut.</li>
		<li>Szkiełko nakrywkowe należy nakryć za pomocą podłoża montażowego i ocenić liczbę i rozmieszczenie wszczepionych MC na odcinki tkanki za pomocą mikroskopu świetlnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Prawie 30 lat po początkowym opisie38 metoda "mastucznego efektu knock-in" nadal dostarcza cennych informacji na temat tego, co MC mogą, a czego nie mogą robić in vivo. Przez długi czas uważano, że funkcje MC ograniczają się do ich roli w alergii. Dane uzyskane przy użyciu podejścia "knock-in komórek tucznych" zmieniły ten pogląd, dostarczając dowodów na to, że MC mogą, między innymi, odgrywać kluczową rolę w obronie gospodarza przed niektórymi patogenami4,39 lub jadami<su...

Komórki tuczne (MCs) to komórki hematopoetyczne, które powstają z pluripotencjalnych komórek progenitorowych szpiku kostnego1-3. W wyniku wydostania się szpiku kostnego komórki progenitorowe MC migrują do różnych tkanek, gdzie pod wpływem lokalnych czynników wzrostu1-3 przekształcają się w dojrzałe MC. Rezydujące w tkankach MC są strategicznie zlokalizowane na styku gospodarz-środowisko, takie jak skóra, drogi oddechowe i przewód pokarmowy, gdzie zachowują się jako pierwsza linia obrony przed zewnętrznymi zniewagami3-6. MC są często klasyfikowane na podstawie ich "wyjściowych" cech fenotypowych i ich lokalizacji anatomicznych. U myszy opisano dwa typy MC: MC typu tkanki łącznej (CTMC) i MC błony śluzowej (MMC)1-3,7,8. CTMC są często zlokalizowane wokół żyłek i w pobliżu włókien nerwowych i znajdują się w jamach surowiczych, podczas gdy MMC zajmują śródnabłonkowe lokalizacje w błonie śluzowej jelit i dróg oddechowych1-3.
Liczne metodologie zostały zastosowane do badania funkcji biologicznych MCs9-13. Wiele grup skupiło się na podejściach in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych (takich jak ludzkie linie MC HMC114 lub LAD215,16), MC pochodzących z in vitro (takich jak MC 17 pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej17 lub MC pochodzących ze szpiku kostnego myszy [BMCMCs]18, MC pochodzących ze skóry płodu [FSCMCs]19 i MC pochodzących z komórek otrzewnej [PCMCs]20) lub ex vivo izolowane MC z różnych miejsc anatomicznych. Wszystkie te modele są szeroko stosowane do badania szczegółów molekularnych biologii MC, takich jak szlaki sygnałowe zaangażowane w aktywację MC. Jednak ważnym aspektem biologii MC jest to, że ich cechy fenotypowe i funkcjonalne (np. zawartość proteazy ziarnistej cytoplazmatycznej lub reakcja na różne bodźce) mogą być modulowane przez położenie anatomiczne i mikrośrodowisko2,7. Ponieważ dokładna mieszanina takich czynników, które występują in vivo, może być trudna do odtworzenia in vitro, opowiadamy się za stosowaniem podejść in vivo w celu uzyskania wglądu w funkcje MC9.
Istnieje kilka szczepów myszy z genetycznym niedoborem MC, takich jak szeroko stosowane myszy WBB6F 1-Kit W/W-v lub C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Myszy te nie mają ekspresji i/lub aktywności KIT (CD117), receptora dla głównego czynnika wzrostu MC czynnika macierzystego czynnika macierzystego (SCF)21,22. W rezultacie myszy te mają głęboki niedobór MC, ale mają również dodatkowe nieprawidłowości fenotypowe związane z ich mutacjami c-kit (u myszy WBB6F 1-Kit W / W-v) lub z efektami dużej inwersji chromosomów, która powoduje zmniejszoną ekspresję c-kit (u myszy C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh)9,10,12,23. Ostatnio zgłoszono kilka szczepów myszy z niezależnym od zestawu konstytutywnym niedoborem MC24-26. Wszystkie te myszy i kilka dodatkowych nowych typów myszy z indukowalnym niedoborem MC zostały ostatnio szczegółowo przeanalizowane9,10,13.
Tutaj opisujemy metody generowania MC pochodzących z mysiego szpiku kostnego (BMCMC), ich adoptywnego transferu do myszy z niedoborem MC oraz analizę liczby i rozmieszczenia adoptywnie przeniesionych MC w różnych miejscach anatomicznych. Ta tak zwana metoda "knock-in" komórek tucznych może być stosowana do oceny funkcji MC i produktów pochodnych MC in vivo. Omówiono zalety i ograniczenia tej metody w świetle alternatywnych podejść, które zostały opracowane w ostatnich latach.

<table><tbody><tr><td>1% Roztwór Antybiotykowo-Przeciwgrzybiczy</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Strzykawka</td><td>Falcon</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Naczynie</td><td>Corning cellgro</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistyren Rurka z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A35-500</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Rowley Biochemical Danver</td><td>33864-99-2</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra 6R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16/32 (klon 93) Oczyszczona</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml TB Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) Igły</td><td>BD Igła Precision Glide</td><td>205155</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G 5/8 Igły</td><td>BD Strzykawka</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Igły BD 30 G x 1/2 BD</td><td>Precision Glide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Blue MAX Jr, 15 ml Rurka stożkowa polipropylenowa</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Medium montażowe</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin3</td><td>Shandon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Długopis DakoCytomation</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>15-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E 7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca inaktywowana termicznie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135-500ml</td><td></td></tr><tr><td>FITC Sprzężony IgG2b K Kontrola izotypu</td><td>szczura eBioscience</td><td>14-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) Sprzężony zestaw przeciw myszom (CD117; klon 2B8)</td><td>eBioscience</td><td>11-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain Modyfikowany</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GS-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Zdrowie</td> <td>zwierząt29405</td><td></td></tr><tr><td>Maj-Grunwaldzki Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MG-1L</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6-dołkowe płytki</td><td>Falcon</td><td>35 3046</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX60</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus Medium do osadzania tkanek</td><td>Fisher Brand</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>PE Sprzężona IgG Kontrola izotypu chomika ormiańskiego</td><td>eBioscience</td><td>12-4888-81</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fikoerytryna (PE) Sprzężona anty-mysia FceRIa (klon MAR-1)</td><td>eBioscience</td><td>12-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia jodku propydu</td><td>eBioscience</td><td>00-6990-50</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Certyfikat Safranin-o</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych T25 25 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych T75 75 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy 1% Wodny</td><td>LabChem-Inc</td><td>LC26165-2</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysz SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza funkcji komórek tucznych in vivo przy użyciu myszy typu "mastucyjnego knock-in"

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Komórki tuczne (MCs) to komórki hematopoetyczne, które znajdują się w różnych tkankach, a szczególnie obfite są w miejscach narażonych na działanie środowiska zewnętrznego, takich jak skóra, drogi oddechowe i przewód pokarmowy. Najbardziej znane ze swojej szkodliwej roli w reakcjach alergicznych IgE-zależnych, MC stały się również ważnymi graczami w obronie gospodarza przed jadem oraz atakującymi bakteriami i pasożytami. Na fenotyp i funkcję MC mogą mieć wpływ czynniki mikrośrodowiskowe, które mogą się różnić w zależności od lokalizacji anatomicznej i/lub w zależności od rodzaju lub etapu rozwoju odpowiedzi immunologicznej. Z tego powodu my i inni faworyzowaliśmy podejścia in vivo nad metodami in vitro, aby uzyskać wgląd w funkcje MC. W tym miejscu opisujemy metody generowania MC pochodzących ze szpiku kostnego myszy (BMCMC), ich adoptywnego transferu do myszy z genetycznym niedoborem MC oraz analizę liczby i rozmieszczenia adoptywnie przeniesionych MC w różnych miejscach anatomicznych. Metoda ta, zwana podejściem "knock-in" z wykorzystaniem komórek tucznych, jest szeroko stosowana w ciągu ostatnich 30 lat do oceny funkcji MC i produktów pochodnych MC in vivo. Omówiono zalety i ograniczenia tej metody w świetle alternatywnych podejść, które zostały opracowane w ostatnich latach.

Przegląd podejścia „mast cell knock-in” przedstawiono na rycinie 1; obejmuje on generowanie BMCMC, liczbę komórek, które należy przeszczepić drogą i.p., i.d. lub i.v. do myszy z niedoborem mastocytów (liczbę tę można zmieniać w zależności od projektu eksperymentalnego) oraz odstęp czasu między przeszczepieniem a eksperymentem w zależności od miejsca iniekcji (odstęp ten również może być zmienny, jeśli jest to wskazane; np. zawartość zgromadzonych mediatorów w ziarnistościach cytoplazmat...

Opisujemy metodę generowania komórek tucznych pochodzących z in vitro, ich wszczepiania myszom z niedoborem komórek tucznych oraz analizy fenotypu, liczby i rozmieszczenia przeszczepionych komórek tucznych w różnych miejscach anatomicznych. Protokół ten można wykorzystać do oceny funkcji komórek tucznych in vivo.

Analiza funkcji komórek tucznych in vivo przy użyciu myszy typu "mastucyjnego knock-in"

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Ogólnym celem następującej metody jest analiza funkcji komórek tucznych in vivo z wykorzystaniem myszy z wprowadzonym genem (knockin) w komórkach tucznych. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie hodowlanych komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMC MCs) lub ich przeszczepienie do myszy z niedoborem komórek tucznych. W drugim kroku komórki BMC MCs są adoptywnie transferowane do różnych miejsc anatomicznych u myszy z niedoborem komórek tucznych w celu stworzenia myszy z knockin w komórkach tucznych.Ostatecznie liczbę i rozmieszczenie anatomiczne adoptywnie przeniesionych komórek tryptazy są oceniane za pomocą cytometrii przepływowej i analizy immunohistochemicznej, aby sprawdzić, w jakim stopniu populacje przeszczepione przypominają te występujące u myszy typu dzikiego. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośrednią ocenę funkcji przeszczepionych populacji komórek tryptazy typu dzikiego lub zmodyfikowanych genetycznie in vivo. Metoda ta może zatem pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek tryptazy, takie jak stopień, w jakim komórki tryptazy lub ich produkty mogą przyczyniać się do cech mysich modeli procesów fizjologicznych, immunologicznych lub patologicznych, w tym modeli chorób ludzkich.Zazwyczaj osoby uczące się tej metody mogą napotykać trudności, ponieważ stopień zaprawiania i niedobór komórek tuczawnych mogą się różnić w zależności od metody generowania BM CMC, miejsca wstrzyknięcia, liczby wstrzykniętych BMC MC oraz liczby tygodni oczekiwania na przyrost masy ciała po zaprawianiu przed przeprowadzeniem eksperymentów in vivo. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ niektóre aspekty procedury zaprawiania są trudne do opanowania, dopóki nie zobaczy się dokładnie, w jaki sposób są one wykonywane. Aby najpierw pobrać szpik kostny, należy użyć sterylnych narzędzi do sekcji, aby wyizolować kość udową, piszczelową i strzałkową od myszy typu dzikiego, uważając, aby nie uszkodzić nasad kości.Podczas preparowania każdej kości, należy unieruchomić ją pęsetą i zeskrobać całą zbędną tkankę. Następnie umieść kość w PBS w lodzie. Po zebraniu wszystkich kości, przenieś je do sterylnego dygestorium do hodowli tkankowych, a następnie, jedna po drugiej, unieruchom każdą kość pęsetą i odetnij obie nasady, aby odsłonić jamy szpikowe. Następnie, używając strzykawek o pojemności 3 ml wyposażonych w igły 30G i przepłukując zimnym medium, wypłucz cały czerwony szpik z każdej kości do nowej płytki Petriego. Po wypłukaniu wszystkich kości, użyj tej samej strzykawki, aby rozbić skupiska komórek szpiku kostnego poprzez wielokrotne delikatne zasysanie i wypychanie.Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Napełnij probówkę zimnym medium płuczącym i odwiruj zawiesinę komórek. Resuspender pellet komórkowy w 10 mililitrach medium hodowlanego.Następnie przenieś komórki szpiku kostnego do kolby do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości. Po jednym lub dwóch dniach hodowli przenieś komórki nieprzywierające do nowej kolby wraz z 10 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej na mysz w kolejnych tygodniach. Dokarmiaj komórki co trzy lub cztery dni, zgodnie z przedstawioną instrukcją.Przenoszenie komórek nieprzylegających do nowej kolby raz w tygodniu, aż do momentu, gdy nie pozostaną żadne komórki przylegające, w celu przeszczepienia śródskórnego do małżowiny usznej szczura. Resuspender komórki BMC MC w stężeniu 4 × 10⁷ komórek/ml w zimnym DMEM. Następnie pobrać komórki do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30G i umieścić strzykawkę w lodzie.Następnie potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, wykonując ucisk szczytowy u biorcy — myszy z niedoborem komórek tucznych w wieku od czterech do sześciu tygodni — i nałóż maść do oczu przed wstrzyknięciem komórek. Używając palca wskazującego, odsłoń i rozciągnij brzuszną stronę małżowiny usznej, wywierając nacisk pionowy na stronę grzbietową ucha. Następnie wykonaj pierwszą wstrzyknięcie śródskórne 25 µL zawiesiny 1 × 10⁶ BMC MCs w środkowej części ucha, a drugie wstrzyknięcie 25 µL tej samej zawiesiny w kierunku konika ucha.W celu przeszczepienia drogą dosytnieniową, resuspenduj BMC MCs w zimnym DMEM do stężenia 1 × 10⁷ komórek/ml. Następnie użyj strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 25G, aby wstrzyknąć 2 × 10⁶ BMC MCs w 200 µl medium do jamy otrzewnej biorców z niedoborem komórek mastocytarnych. W przypadku przeszczepienia drogą dożylną, resuspenduj BM CMCs w zimnym DMEM do stężenia 2,5 × 10⁷ komórek/ml, a następnie wstrzyknij 5 × 10⁶ BMC MCs w 200 µl medium do żyły ogonowej.Od czterech do sześciu tygodni po przeszczepieniu do jamy otrzewnowej, za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 G, wstrzyknij 5 ml zimnego PBS do jamy otrzewnowej zwierzęcia biorcy. Masuj brzuch przez 20 s, aby zebrać komórki otrzewnej. Następnie użyj strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 22 G, aby powoli aspirować płukaninę otrzewną.Procentową zawartość komórek tucznych oraz całkowitą liczbę komórek w płycie płucznej można następnie ocenić za pomocą cytometrii przepływowej lub histochemii. Aby ocenić komórki tuczne w oknach krezowych, należy rozciąć błonę otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy. Od czterech do pięciu okien krezowych od jednej myszy należy ułożyć na szkiełku, a następnie utrwalić przez jedną godzinę w roztworze karnawałowym.Po zakończeniu inkubacji w temperaturze pokojowej, osuszyć preparaty na powietrzu i usunąć jelito. Utrwalone okna krezkowe pozostaną przytwierdzone do szkiełek. Na koniec barwić preparaty przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą roztworu barwiącego chaba. Przedstawiono analizę cytometryczną oraz barwienie błękitem odine komórek CMC z rdzenia kostnego po 1, 15 i 45 dniach hodowli w DMEM uzupełnionym o IL-3. Komórki CMC z rdzenia kostnego hodowane przez 45 dni są w 95% czyste i zawierają liczne ziarnistości cytoplazmatyczne.W związku z tym komórki z tych kultur nadają się do eksperymentów z przeszczepem, podczas gdy komórki hodowane przez 15 dni nie nadają się do nich na tych obrazach. Zgodnie z oczekiwaniami, pokazano udane przeszczepy w małżowinie usznej cztery tygodnie po wszczepieniu do skóry właściwej, w oknach krezkowych, w jamie otrzewnej sześć tygodni po wszczepieniu do otrzewnej oraz w płucach 12 tygodni po wszczepieniu dożylnym. Mastocyty są obecne w próbkach tkanek wyizolowanych z myszy typu dzikiego, podczas gdy w zwierzętach z deficytem mastocytów oraz w myszach z knock-in mastocytów nie wykryto żadnych mastocytów.Niemniej jednak, adoptywnie przeniesione komórki mastocytarne BMC pojawiają się w lokalizacjach podobnych do tych obserwowanych u zwierząt typu dzikiego. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że odstęp czasu między przeszczepieniem a analizą eksperymentu będzie się różnić w zależności od miejsca wstrzyknięcia mastocytów. Bardzo ważne jest przestrzeganie tych odstępów, aby zapewnić wystarczający czas na dojrzewanie przeszczepionych komórek i zajęcie przez nie docelowej lokalizacji in vivo.Podejście to dostarczyło i nadal dostarcza istotnych informacji na temat tego, co komórki masowe i ich produkty mogą lub nie mogą zrobić in vivo. Należy pamiętać, że praca z żywymi zwierzętami wymaga specjalistycznego przeszkolenia, odpowiedniego przeglądu i zatwierdzenia protokołów eksperymentalnych oraz ścisłego przestrzegania najwyższych standardów opieki nad zwierzętami, w tym dbałości o ograniczenie bólu i stresu zwierząt podczas wykonywania tych procedur.

analyzing-functions-mast-cells-vivo-using-mast-cell-knock

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza funkcji komórek tucznych in vivo z wykorzystaniem myszy 'Mast Cell Knock-in'

Opisana tutaj technika polega na wstrzyknięciu lipopolisacharydu do gruczołu mlekowego laktującej myszy poprzez sutek w celu symulacji zapalenia wymienia, stanu najczęściej wywołanego przez infekcję bakteryjną. Wstrzyknięcie lipopolisacharydu prowadzi do zwiększenia sygnalizacji czynnika jądrowego kappa B (NF-κB), co jest wizualizowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u myszy reporterowej z lucyferazą NF-κB.

Wewnątrzprzewodowe wstrzyknięcie LPS jako mysi model zapalenia wymion: wizualizacja sygnalizacji za pomocą transgenicznego reportera NF-&kappa;B

Ten film demonstruje test kolorymetryczny do określenia aktywności degranulacyjnej komórek tucznych. Enzym uwalniany przez komórki tuczne hydrolizuje substrat i wytwarza kolorowy produkt. Aktywność degranulacyjną komórek tucznych mierzono jako procentowe uwalnianie enzymów na zewnątrz komórki znormalizowane całkowitą zawartością enzymów w komórce.

Test degranulacji komórek tucznych w celu zbadania wpływu docelowej substancji chemicznej

Ten film demonstruje metodę płukania otrzewnowej do izolowania dojrzałych komórek tucznych typu tkanki łącznej z jamy otrzewnowej dorosłych myszy. Po wyizolowaniu mieszaniny pierwotnych komórek odpornościowych z jamy otrzewnej przeprowadza się selektywną proliferację komórek tucznych w odpowiednich warunkach hodowli.

Technika izolowania pierwotnych komórek tucznych z mysiej jamy otrzewnowej

Reakcje alergiczne, charakteryzujące się aktywacją komórek tucznych i bazofilów, są napędzane przez sieciowanie IgE i uwalnianie mediatorów prozapalnych. Ilościową ocenę reakcji alergicznych można uzyskać, stosując barwnik Evans Blue do monitorowania zmian przepuszczalności naczyń krwionośnych po prowokacji alergenem.

Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Celem obecnego protokołu było opracowanie metody, która pozwoli na funkcjonalne analizy genomiczne wydzielania komórek tucznych. Protokół opiera się na ilościowej ocenie uwalniania fluorescencyjnego genu reporterowego skotransfekowanego z genem będącym przedmiotem zainteresowania oraz analizach morfologii granulki wydzielniczej w czasie rzeczywistym.

badanie granulek wydzielniczych komórek tucznych; od biosyntezy do egzocytozy

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek tucznych otrzewnej. Opisujemy również dwa protokoły ich funkcjonalnej charakterystyki: obrazowanie fluorescencyjne wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego Ca2 + oraz test degranulacji oparty na kolorymetrycznej ocenie ilościowej uwolnionej β-heksozaminidazy.

Izolacja komórek tucznych pochodzących z otrzewnej i ich charakterystyka funkcjonalna za pomocą Ca2+-obrazowania i testów degranulacji

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Poznaj metodę analizy funkcji komórek tucznych in vivo poprzez przeszczepienie komórek szpikowych do myszy pozbawionych komórek tucznych. Technika ta umożliwia ocenę fenotypu i dystrybucji komórek.

Analiza funkcji komórek tucznych in vivo przy użyciu myszy typu "mastucyjnego knock-in"

Przeglądaj więcej filmów