Analiza funkcji komórek tucznych in vivo przy użyciu myszy typu "mastucyjnego knock-in"

Ogólnym celem poniższej metody jest analiza funkcji komórek tucznych in vivo przy użyciu myszy knockin z komórek tucznych. Osiąga się to poprzez pierwsze wygenerowanie hodowanych komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego lub BMC MC lub wszczepienie myszom z niedoborem komórek tucznych. W drugim etapie MC BMC są adoptywnie przenoszone do różnych miejsc anatomicznych u myszy z niedoborem komórek tucznych w celu wygenerowania myszy knockin z komórek tucznych.

Ostatecznie liczbę i rozmieszczenie anatomiczne adoptywnie przeniesionych komórek tucznych ocenia się za pomocą cytometrii przepływowej i analizy immunohistochemicznej, aby ocenić, w jakim stopniu przeszczepione populacje przypominają te występujące u myszy typu dzikiego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bezpośrednią ocenę funkcji wszczepionego typu ściany lub genetycznie zmodyfikowanych populacji komórek MA in vivo. Metoda ta może zatem pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek MA, takie jak to, w jakim stopniu komórki MA lub ich produkty mogą przyczyniać się do cechowania mysich modeli procesów fizjologicznych, immunologicznych lub patologicznych, w tym modeli chorób człowieka.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby uczące się tej metody mogą mieć trudności, ponieważ wszczepienie i niedobór komórek tucznych mogą się różnić w zależności od metody użytej do wytworzenia CMC BM, korzenia wstrzyknięcia, liczby wstrzykniętych MC BMC i liczby tygodni po wszczepieniu przed przeprowadzeniem eksperymentów in vivo. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ aspekty procedury wszczepienia są trudne do nauczenia, jeśli nie zobaczy się dokładnie, jak są wykonywane. Aby najpierw wyekstrahować szpik kostny, użyj sterylnych narzędzi do preparowania, aby zebrać kość udową, piszczelową i strzałkową od myszy typu dzikiego, nie przeklinając nasady kości.

Podczas preparowania każdej kości zabezpiecz ją kleszczami i zeskrob całą obcą tkankę. Następnie umieść kość w PBS na lodzie, gdy wszystkie kości zostaną zebrane, przenieś je do sterylnego kaptura do hodowli tkanek, a następnie pojedynczo zabezpiecz każdą kość kleszczami i odetnij obie nasady, aby odsłonić jamy szpikowe. Następnie, za pomocą trzech mililitrowych strzykawek, wyposażonych w igły o rozmiarze 30 i zimne medium do płukania, cały czerwony szpik z każdej kości do nowej szalki Petriego Gdy wszystkie kości zostaną przepłukane, użyj tej samej strzykawki do dysocjacji skupisk komórek szpiku kostnego poprzez wielokrotne delikatne aspiracje i wyrzucanie.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Napełnij probówkę zimnym środkiem płuczącym i odwiruj resztki komórek. Zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki hodowlanej.

Następnie przenieś komórki szpiku kostnego do kolby do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości. Po jednym do dwóch dni hodowli przenieś nieprzylegające komórki do nowej kolby wraz z 10 mililitrami świeżej kultury, pożywki na mysz przez następne tygodnie. Właśnie wykazano, że karmienie komórek co trzy do czterech dni jest demonstrowane.

Przenoszenie komórek nieprzylegających do zaleceń lekarskich do nowej kolby raz w tygodniu, aż nie pozostaną żadne komórki przylegające do śródskórnego wszczepienia do szpilki do uszu Resus. Zawieś BMC MC cztery razy od 10 do siedmiu komórek na mililitr w zimnym DMEM. Następnie odessać komórki do jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 i umieścić strzykawkę na lodzie.

Następnie potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia za pomocą górnej szczypty myszy biorcy w wieku od czterech do sześciu tygodni z niedoborem komórek tucznych i nałóż maść do oczu, aby wstrzyknąć komórki. Użyj palca wskazującego, aby odsłonić i rozciągnąć brzuszną powierzchnię pinnera do ucha, wywierając pionowy nacisk na grzbietową powierzchnię ucha. Następnie podaj 1 25 mikrolitrów śródskórnego wstrzyknięcia jeden razy 10 do sześciu BMC MC do środka ucha i drugie wstrzyknięcie 25 mikrolitrów tego samego w kierunku końcówki szpilki.

W przypadku dootrzewnowego, wszczepienie ponownie zawiesić BMC MCs raz 10 do siedmiu komórek na mililitr w zimnym DMEM. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby wstrzyknąć dwa razy 10 do sześciu CMC BM w 200 mikrolitrach pożywki do jamy otrzewnej biorców z niedoborem komórek tucznych w celu wszczepienia dożylnego. Ponownie zawiesić BM CMC w ilości 2,5 razy 10 do siedmiu komórek na mililitr w zimnym DMEM, a następnie wstrzyknąć pięć razy 10 do sześciu MC BMC w 200 mikrolitrach pożywki przez żyłę ogonową.

Cztery do sześciu tygodni po wszczepieniu dootrzewnowym użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby wstrzyknąć pięć mililitrów zimnego PBS do jamy otrzewnowej zwierzęcia biorcy. Masuj brzuch przez 20 sekund, aby zebrać komórki otrzewnej. Następnie użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 22, aby powoli zassać płukanie otrzewnej.

Procent komórek tucznych i całkowitą liczbę komórek w płynie z płukania otrzewnej można następnie ocenić za pomocą cytometrii przepływowej lub histochemii. Aby ocenić komórki tuczne w oknach krezkowych, należy rozciąć błonę otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy. Ułóż cztery do pięciu okien krezkowych na mysz na szkiełku, a następnie jednogodzinne utrwalenie w roztworze hałasu samochodu.

Pod koniec inkubacji dodać temperaturę pokojową, wysuszyć szkiełka na powietrzu i usunąć jelito. Stałe okna krezkowe pozostaną przymocowane do szkiełek. Na koniec barwić preparaty przez 20 minut w temperaturze pokojowej roztworem barwiącym chaba, reprezentując analizę cytometryczną przepływową i barwienie niebieskim odem CMC BM po jednym 15 i 45 dniach hodowli W DMEM, uzupełnionym IL trzy, pokazano BM CMC hodowane przez 45 dni i czyste w 95% oraz zawierające dużą liczbę granulek cytoplazmatycznych.

Dlatego komórki z tych kultur nadają się do eksperymentów wszczepienia, podczas gdy komórki hodowane przez 15 dni nie znajdują się na tych obrazach. Pomyślne wszczepienie grosza ucha cztery tygodnie po śródskórnym, okienka krezkowe wszczepienia, jama otrzewnej sześć tygodni po wszczepieniu dootrzewnowym i płuca 12 tygodni po wszczepieniu dożylnym są pokazane zgodnie z oczekiwaniami. Komórki tuczne są obecne w próbkach tkanek wyizolowanych od myszy typu dzikiego, podczas gdy u zwierząt z niedoborem komórek tucznych u myszy z komórkami tucznymi nie wykrywa się komórek tucznych.

Jednak adoptyjnie przeniesione MC BMC pojawiają się w podobnych lokalizacjach do tych obserwowanych u zwierząt typu dzikiego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że odstęp między wszczepieniem a badaniem eksperymentu będzie się różnić w zależności od miejsca wstrzyknięcia komórek tucznych. Bardzo ważne jest przestrzeganie takich odstępów czasu, aby dać wystarczająco dużo czasu na dojrzewanie przeszczepionych komórek i zajęcie ostatecznego miejsca vivo.

Podejście to dostarczyło i nadal dostarcza ważnych informacji na temat tego, co komórki masowe i ich produkt mogą lub nie mogą zrobić in vivo. Należy zawsze pamiętać, że praca z żywymi zwierzętami wymaga specjalnego szkolenia, odpowiedniego przeglądu i zatwierdzenia protokołów eksperymentalnych oraz ścisłego przestrzegania najwyższych standardów opieki nad zwierzętami, w tym dbałości o zmniejszenie bólu i stresu zwierzęcia podczas wykonywania tych procedur.