Name: Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj zrobotyzowaną metodę produkcji sferoid komórek rakowych z wykorzystaniem wodnego dwufazowego systemu do testowania leków przeciwnowotworowych w formacie 96-well.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie z National Institutes of Health R21CA182333.

1. Przygotowanie wodnego układu polimerowego dwufazowego (ATPS)
<ol>
	<li>Odważyć 0,5 g glikolu polietylenowego (PEG) (MW: 35 000) i dodać go do 9,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej w sterylnym stożkowym 15 ml, aby przygotować 10 ml 5% (w/v) wodnej fazy PEG. 
	Uwaga: Dodanie najpierw połowy pożywki do stożka, a następnie dodanie polimeru, a następnie pozostałej ilości pożywki minimalizuje przyleganie polimeru do stożkowych ścianek i pomaga polimerowi szybciej się rozpuścić.</li>
	<li>Odważyć 0,128 g dekstranu (DEX) (MW: 500 000) i dodać go do 0,872 ml kompletnej pożywki wzrostowej w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby przygotować 1 ml 12,8% (w/v) wodnej fazy DEX.</li>
	<li>Wirować oba roztwory przez około 1 minutę, aby rozpuścić polimery w pożywce.</li>
	<li>Przechowywać oba roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby zapewnić rozpuszczenie i uzyskanie jednorodnych mieszanin. Trzymaj korki powyżej poziomu wody, aby uniknąć możliwości zanieczyszczenia roztworów z wody do kąpieli.</li>
	<li>Załaduj roztwór fazy PEG do sterylnej, plastikowej strzykawki i przepuść go przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,2 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń. 
	Uwaga: Napełnij strzykawkę roztworem PEG, umieść ją we wkładce filtra na stożkowej rurce i używając siły, powoli przepchnij roztwór przez filtr. To normalne, że występuje opór przed ruchem tłoka strzykawki. Następuje niewielka utrata roztworu polimeru, ponieważ część roztworu pozostanie w filtrze, ale stężenie polimeru nie ulegnie zmianie.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl roztworu fazy DEX i rozcieńczyć go w 10 μl pożywki w osobnej probówce, aby otrzymać 6,4% (w/v) roztwór fazy DEX. Odessać 100 μl roztworu fazy PEG i przelać go na szalkę Petriego.
	<ol>
		<li>Dozować 0,5 μl 6,4% (w/v) roztworu fazy DEX do roztworu fazy PEG. Wizualnie potwierdź udane formowanie ATPS, obserwując spadek DEX pod mikroskopem. Granica kropli powinna pozostać widoczna, co wskazuje na obecność dwóch stabilnych, oddzielnych faz wodnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowuj podstawowe wodne roztwory fazy PEG i DEX w temperaturze 4 °C do czasu użycia. 
	Uwaga: Zaleca się, aby roztwory polimerów były przygotowywane świeże przed każdym eksperymentem i używane w ciągu 24 godzin od przechowywania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do drukowania sferoidów komórek rakowych
<ol>
	<li>Wyhoduj interesujące komórki rakowe (np. Komórki raka piersi MDA-MB-157) do 90%-100% zlewającej się monowarstwy. W przypadku komórek MDA-MB-157 użyj pożywki złożonej z DMEM zawierającej 10% FBS, 1% glutaminy i 1% antybiotyku.
	<ol>
		<li>Pobrać komórki za pomocą buforu dysocjacyjnego komórek (zgodnie z protokołem producenta) i załadować zawiesinę do stożkowego pojemnika o pojemności 15 ml. Odwirować przez 5 minut w stężeniu 173,3 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj komórki do hemocytometru i policz je, aby obliczyć wymaganą liczbę komórek dla pożądanej gęstości komórek sferoidalnych. Zlewająca się monowarstwa komórek MDA-MB-157 wyhodowanych w kolbie T75 zwykle daje ~7 x 106 komórek. 
	Uwaga: Wymagana gęstość komórek, aby objętość kropli mogła wygenerować pojedynczą sferoidę, będzie zależeć od typu komórki. 22 Na przykład dla komórek MDA-MB-157 zalecana jest gęstość 1,5 x 104 lub większa na 0,3 μl kropli fazy DEX, aby zapewnić utworzenie pojedynczej sferoidy.</li>
	<li>Odwirować komórki po raz drugi przez 5 minut przy 173,3 x g i ponownie zawiesić je w odpowiedniej objętości pożywki wzrostowej, aby stężyć zawiesinę do pożądanej gęstości komórek. 
	Uwaga: Na przykład, jeśli pobrano 7 x 106 komórek rakowych, całkowita objętość zawiesiny komórkowej wymagana do wytworzenia sferoidy o gęstości komórek 1,5 x 104 w spadku fazy DEX o 0,3 μl wyniesie 140 μl. Jednak ze względu na rozcieńczenie roztworem fazy DEX w następnym kroku, do ponownego zawieszenia komórek należy użyć tylko 70 μl pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Do otrzymanej zawiesiny komórkowej dodać równą objętość 12,8% (m/v) wodnego roztworu fazy DEX przygotowanego w 1.2. Dla przykładu sferoidy o gęstości4 komórek 1,5 x 10, 70 μl roztworu fazy DEX dodaje się do 70 μl zawiesiny komórek.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek i wymieszanie roztworu DEX. Pipetowanie w górę i w dół powinno być wykonywane delikatnie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do drukowania sferoidów współkulturowych
<ol>
	<li>Hoduj komórki rakowe (np. Ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-157) i komórki podporowe (np. Ludzkie fibroblasty) do 90%-100% zlewającej się monowarstwy. Zbierz każdy typ komórki za pomocą buforu dysocjacji komórek (zgodnie z protokołem producenta).
	<ol>
		<li>Załadować każdą zawiesinę do stożkowego naczynia o pojemności 15 ml, odwirować je przez 5 minut przy stężeniu 173,3 x g i odessać supernatant z każdego stożka. Ponownie zawiesić komórki każdego stożka w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej. 
		Uwaga: Barwniki fluorescencyjne, takie jak Calcein AM (barwienie żywych komórek) i barwniki jądrowe (Hoechst) mogą być używane do rozróżnienia tych dwóch typów komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj każdy typ komórek osobno do hemocytometru i policz je, aby obliczyć wymaganą liczbę każdego typu komórek dla pożądanego stosunku komórek rakowych do komórek podporowych w sferoidach współhodowanych. Zlewające się monowarstwy komórek MDA-MB-157 i fibroblastów hodowanych w kolbach T75 zwykle dają odpowiednio ~7 x 106 i ~6 x 106 komórek.</li>
	<li>Dodaj odpowiednią objętość z zawiesiny komórek podporowych do zawiesiny komórek rakowych, aby uzyskać pożądany stosunek liczby dwóch typów komórek. Na przykład użyj stosunku 50 komórek rakowych do 1 komórki fibroblastów.</li>
	<li>Odwirować stożek zawierający zawiesinę mieszanych komórek przez 5 minut w temperaturze 173,3 x g i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości, aby uzyskać końcową gęstość składającą się z równych objętości pożywki wzrostowej i 12,8% (m/v) wodnego roztworu fazy DEX (przygotowanego w 1.2).</li>
	<li>Delikatnie odpipetować powstałą zawiesinę komórek w górę i w dół, aby zapewnić jednorodność zawiesiny.</li>
</ol>
4. Drukowanie sferoid nowotworowych na 96-dołkowej płytce
<ol>
	<li>Na dzień przed eksperymentami pokryj niepoddane obróbce, okrągłodenne 96-dołkowe płytki 1% (w/v) Pluronic w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Powłoka ta zapobiega przyczepianiu się komórek w okresie hodowli.</li>
	<li>Dozować 50 μl przefiltrowanej 5% (w/v) wodnej fazy PEG do każdego dołka płytki 96-dołkowej (płytki docelowej).</li>
	<li>Za pomocą pipety wymieszać zawiesinę komórek (przygotowaną w kroku 2 lub kroku 3 odpowiednio dla mono- i kohodowli) i dodać 20 μl zawiesiny do co drugiego dołka z jednej kolumny płytki 384-dołkowej (płytki źródłowej).</li>
	<li>Włącz obsługę cieczy i "zlokalizuj" głowicę pipetującą, aby zarejestrować współrzędne. Następnie skompiluj wcześniej zdefiniowany protokół (poniżej w 4.6), aby upewnić się, że oprogramowanie laboratoryjne i parametry są zdefiniowane poprawnie. Ten etap "bazowania" może być różny dla różnych osób zajmujących się obsługą cieczy. 
	Uwaga: Przebieg protokołu, pokazany krok po kroku poniżej w 4.6, będzie podobny niezależnie od użytego robota do obsługi cieczy; Jednak interfejs programowania może wyglądać inaczej ze względu na użycie innego oprogramowania.</li>
	<li>Umieść płytkę źródłową, płytkę docelową i pudełka końcówek do pipet w określonych miejscach na stacji roboczej urządzenia do obsługi cieczy, jak pokazano na rysunku 1.</li>
	<li>Wykonaj protokół, który obejmuje następujące kroki:
	<ol>
		<li>Załadować jedną kolumnę beczek z głowicy pipetującej urządzenia do obsługi cieczy z końcówkami do pipet mieszających (8 końcówek) ze stacji roboczej (Rysunek 1).</li>
		<li>Wymieszać zawiesinę komórek w studzienkach płytki źródłowej (rysunek 1). Wybierz objętość mieszania mniejszą niż objętość zawiesiny komórek w studzienkach, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.</li>
		<li>Wysuń końcówki do pustego pojemnika na odpady (Rysunek 1).</li>
		<li>Załadować jedną kolumnę cylindrów z głowicy pipetującej końcówkami do pipet dozujących o pojemności 10 μl (Rysunek 1).</li>
		<li>Odessać 0,3 μl zawiesiny komórek z płytki źródłowej (rysunek 1) do każdej końcówki pipety.</li>
		<li>Dozować zawiesinę komórek do studzienek jednej kolumny płytki docelowej (rysunek 1). Stosować dozowanie o wysokości 0,5 mm i natężeniu przepływu mniejszym niż 1 μl/s.</li>
		<li>Powtarzaj kroki od 4.6.1 do 4.6.6, aż do zakończenia drukowania kolumna po kolumnie na całej płycie docelowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie zdjąć płytkę docelową z powierzchni stanowiska pracy i umieścić ją w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Podczas przenoszenia do inkubatora należy utrzymywać płytkę w pozycji poziomej, aby uniknąć zakłócenia działania kropli fazowych DEX zawierających komórki.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 24 godziny, aby umożliwić agregację komórek w sferoidę w kropli fazy DEX.</li>
</ol>
5. Leczenie farmakologiczne sferoid komórek rakowych
Zauważ, że poniższy protokół dotyczy 4-dniowej kuracji farmakologicznej i obejmuje odnowienie po 2 dniu na nowy lek. Można go modyfikować na inne okresy leczenia.
<ol>
	<li>Wizualnie potwierdzić tworzenie się sferoid w płytkach 96-dołkowych po 24 godzinach. W razie potrzeby przeprowadź badania w celu zmierzenia rozmiaru sferoidy, uśredniając najmniejsze i największe średnice każdej sferoidy.</li>
	<li>Przygotuj roztwór podstawowy pożądanego leku, rozpuszczając go w rozpuszczalniku zalecanym przez producenta w ustalonym stężeniu rozpuszczalności. Na przykład cisplatynę należy rozpuścić w wodzie w stężeniu 2 mg/ml. 
	Uwaga: Roztwór podstawowy leku należy chronić przed światłem, jeśli lek jest wrażliwy na światło.</li>
	<li>Stosując technikę rozcieńczania seryjnego, należy przygotować rozcieńczone stężenia leku z pożywką do hodowli komórkowych z roztworu podstawowego przygotowanego w poprzednim etapie. Każde rozcieńczenie powinno być dwukrotnie większe niż pożądane stężenie. Współczynniki rozcieńczenia będą się różnić w zależności od początkowego stężenia zapasu i pożądanych stężeń roboczych.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 50 μl roztworu leku przygotowanego w poprzednim kroku. Można to zrobić zrobotyzownie lub ręcznie pipetując. 
	Uwaga: Każde stężenie leku zostanie rozcieńczone w połowie do pożądanego stężenia przez 50 μl wodnej fazy PEG już w każdym studzience.
	<ol>
		<li>Dla każdego stężenia należy użyć sferoid z dwóch kolumn płytki 96-dołkowej (n=16).</li>
		<li>W studzienkach kontrolnych dodać tylko 50 μl świeżej pożywki hodowlanej do istniejących 50 μl wodnej fazy PEG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować sferoidy z lekiem przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Po 48 godzinach inkubacji przygotować świeże rozcieńczenia leku w żądanych stężeniach i odnowić lek, dodając 50 μl świeżego roztworu leku do każdej studzienki. 
	Uwaga: Studnie zawierają już pożądane stężenie leku z pierwszego leczenia farmakologicznego. Dlatego w tej fazie odnowy każde stężenie jest przygotowywane w pożądanym stężeniu, ponieważ nie nastąpi rozcieńczenie.</li>
	<li>Inkubować sferoidy z lekiem przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
6. Analiza żywotności komórek w sferoidach
<ol>
	<li>Po 48 godzinach inkubacji z odnowionym lekiem (tj. całkowity czas leczenia sferoidów lekiem wynosi 4 dni), zmierzyć całkowitą objętość pożywki w jednym dołku za pomocą ręcznego pipetowania. 
	Uwaga: Typowa objętość w jednej studzience wynosi ~140 μl (niewielki spadek następuje z powodu parowania).</li>
	<li>Obliczyć objętość odczynnika do żywotności komórek (np. PrestoBlue) jako 10% stężenia całkowitej objętości studzienki. Dodaj tę objętość odczynnika żywotności komórek do każdego dołka. 
	Uwaga: Przy istniejącej objętości pożywki wynoszącej 140 μl w studzince, wymagana jest objętość 15,6 μl, aby uzyskać 10% stężenie całej studzienki. Oblicza się to, dzieląc istniejącą objętość pożywki przez 9 (140 μl / 9 = 15,6 μl).</li>
	<li>Inkubować płytkę z odczynnikiem żywotności komórek dodanym do każdej studzienki przez 6 godzin w temperaturze 37 °C, chroniąc ją przed światłem.</li>
	<li>Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek i odczytać sygnał fluorescencji odpowiednio przy długościach fal wzbudzenia i emisji 560 nm i 590 nm.</li>
	<li>Obliczyć procentową żywotność komórek w sferoidach, normalizując sygnał fluorescencyjny z studzienek poddanych działaniu środka do sygnału studzienek kontrolnych po uśrednieniu wartości z tych samych warunków obróbki.</li>
</ol>

<ol><li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li>
<li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+new+drug+launches%3A+myth+or+reality%3F+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+the+other+face+of+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Rec.+Results+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li>
<li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li>
<li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation%2C+culture%2C+harvesting+and+flow+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114(2013).</li>
<li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250(2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures%3A+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li>
<li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tension-mediated%2C+concave-microwell+arrays+for+large-scale%2C+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li>
<li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+imaging%2C+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li>
<li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput%2C+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li>
<li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li>
<li>Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzym%22%5BJournal%5D)">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li>
<li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878(2014).</li>
<li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li>
<li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells%3A+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444(2010).</li>
<li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cance%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+tumours+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sferoidy stanowią realistyczny model, który pozwala lepiej zrozumieć fizjologię guza i skuteczność leków, a także stanowią użyteczne narzędzie do odkrywania leków przeciwnowotworowych. Takie zastosowania przyniosłyby ogromne korzyści dzięki prostym technikom generowania i konserwacji sferoidów, które wymagają jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego, narzędzi do obsługi cieczy i sprzętu do badań przesiewowych. Zastosowanie wodnego systemu dwufazowego do spontanicznej agregacji komórek nowotworowych w fazie kropli um...

Testy oparte na komórkach stanowią ważne narzędzie do rozwoju i odkrywania nowych leków przeciwnowotworowych. 1,2 Historycznie rzecz biorąc, jednowarstwowe hodowle komórek nowotworowych były wykorzystywane do badania skuteczności związków kandydujących przeciwko określonym typom komórek nowotworowych. Łatwość utrzymania kultur jednowarstwowych na standardowych płytkach hodowlanych, kompatybilność standardowych płytek z komercyjnymi narzędziami robotycznymi do dodawania odczynników oraz ze sprzętem przesiewowym do dalszej analizy odpowiedzi komórkowych na związki chemiczne to główne korzyści, które sprawiają, że kultury 2D są atrakcyjnym narzędziem do testowania leków. 3 Niestety, jednowarstwowe testy komórkowe często nie są w stanie przewidzieć skuteczności związków in vivo, co sprawia, że opracowywanie i odkrywanie leków jest niezwykle kosztownym procesem. Pomimo znacznych inwestycji i wysiłków firm farmaceutycznych i jednostek akademickich, tylko ~1% leków przeciwnowotworowych w badaniach klinicznych zostało zatwierdzonych przez FDA w ciągu ostatnich dwóch dekad. 6 Rozbieżność między hodowlami 2D a złożonym środowiskiem 3D komórek nowotworowych in vivo jest główną wadą systemów hodowli jednowarstwowych. 7 W związku z tym badania przesiewowe potencjalnych związków przeciwko komórkom nowotworowym w otoczeniu, które bardziej przypomina środowisko guza 3D, mogą przyspieszyć rozwój nowych leków stosowanych w chemioterapii. 8
Sferoidy komórek rakowych prezentują odpowiedni model 3D guza in vitro. 9,10 Sferoidy to zwarte klastry, które tworzą się w wyniku spontanicznego lub indukowanego składania się komórek rakowych na nieprzylegających powierzchniach lub w zawiesinie przy użyciu technik takich jak kolba przędzalnicza, nakładka cieczy, mikrofabrykowane układy mikrodołków, mikrofluidyka i wiszące krople. 11-16 Sferoidy naśladują kluczowe cechy guzów litych, w tym geometrię i ograniczony transport tlenu, składników odżywczych i związków leków do strefy centralnej; W związku z tym dokładniej regenerują odpowiedź lekową guzów litych w porównaniu z hodowlami jednowarstwowymi. 17-19 Pomimo tej wyraźnej korzyści, sferoidy nie są rutynowo stosowane do badań przesiewowych związków chemicznych przeciwko komórkom nowotworowym. Trudność w wyprodukowaniu sferoid o jednolitych rozmiarach w standardowym środowisku o wysokiej przepustowości, które jest kompatybilne z dostępnymi na rynku narzędziami do robotyki i badań przesiewowych/obrazowania, utrudnia włączenie hodowli sferoidów do procesu opracowywania leków. Chociaż niestandardowe materiały i płyty stały się ostatnio dostępne na rynku, aby zaspokoić tę potrzebę, względy kosztowe zniechęcają do ich powszechnego stosowania.
Dwie główne techniki umożliwiające wytwarzanie sferoid o stałej wielkości w wysokiej przepustowości wykorzystują nową platformę do zawieszania i mikro-studnie wykonane w mikrofabrykacji. Jednak oba podejścia wymagają specjalnych płytek i urządzeń, które są drogie w produkcji i niewygodne dla użytkowników punktów końcowych w głównych ośrodkach badawczych i przemyśle farmaceutycznym, gdzie podejmowane są największe wysiłki na rzecz odkrycia nowych leków przeciwnowotworowych. Pomimo pewnej poprawy stabilności kropli zawierających komórki dzięki niedawnej konstrukcji wiszących płytek kroplowych, tylko co drugi otwór płytki jest nadal używany podczas hodowli, aby uniknąć rozprzestrzeniania się/łączenia kropli. 16 To znacznie zmniejsza przepustowość eksperymentalną. Dodawanie i odnawianie leków jest trudne w przypadku pipetowania ręcznego lub zrobotyzowanego, a sferoidy muszą być przenoszone do standardowej płytki w celu analizy biochemicznej, ponieważ taka konfiguracja płytek nie jest łatwo kompatybilna z konwencjonalnymi urządzeniami do badań przesiewowych, takimi jak czytniki płytek. 21 Mikrostudzienki wykonane przy użyciu miękkiej litografii umożliwiają również produkcję sferoidów o kontrolowanych rozmiarach. 13,20 Jednak niekompatybilność tej platformy ze standardowymi narzędziami do pipetowania uniemożliwia traktowanie poszczególnych sferoid różnymi związkami/stężeniami leków, narażając wszystkie sferoidy na jeden warunek leczenia. W związku z tym metoda ta nie jest odpowiednia dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków, które wymagają jednoczesnego testowania wielu związków/stężeń.
Aby pokonać te przeszkody, opracowano nową technikę wysokoprzepustowej produkcji sferoid komórek rakowych o jednakowej wielkości na standardowych płytkach 96-dołkowych. 22,23 Podejście to opiera się na polimerycznym, wodnym układzie dwufazowym (ATPS) z glikolem polietylenowym (PEG) i dekstranem (DEX) jako polimerami tworzącymi fazy. 24 ATPS zostały ostatnio wykorzystane w wielu nowatorskich zastosowaniach biologicznych komórek, aby umożliwić mikrowzorcowanie komórek i miejscowe dostarczanie odczynników biologicznych do komórek w wysoce wodnych podłożach. 25-32 Aby utworzyć sferoidę, komórki rakowe miesza się z wodną fazą DEX, a submikrolitrową kroplę powstałej zawiesiny pipetuje się do studzienki zawierającej zanurzeniowy wodny roztwór fazy PEG. Kropla pozostaje niemieszająca się z fazą zanurzenia i ogranicza komórki, ułatwiając tworzenie sferoidy. Co ważne, wysoce wodna faza zanurzeniowa dostarcza składniki odżywcze do komórek sferoidy i minimalizuje dobrze znany problem parowania pożywki, powszechny w niektórych innych testach, który powoduje zmiany osmolalności pożywek i wahania stężeń leków. Technika ta umożliwia produkcję sferoidów i leczenie leków wyłącznie przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i narzędzi do pipetowania w standardowych płytkach 96-dołkowych. Co ważne, analiza odpowiedzi komórkowych sferoid jest wykonywana na tej samej płytce przy użyciu standardowych testów biochemicznych i czytników płytek. Łatwość pracy z ATPS i zdolność adaptacji podejścia do zrobotyzowanej obsługi cieczy sprawiają, że wysokowydajne generowanie sferoid monokulturowych i kokulturowych jest prostą techniką laboratoryjną. To nowe podejście będzie dużym krokiem naprzód w kierunku integracji sferoid komórek nowotworowych z procesami opracowywania i odkrywania leków, dzięki poprawie przepustowości testów i efektywności kosztowej (zwiększenie liczby badanych związków i zmniejszone zużycie odczynników) oraz wydajności (skrócenie czasu pracy).
Szczegółowy protokół do robotycznej produkcji sferoid komórek rakowych na 96-dołkowych płytkach przy użyciu podejścia ATPS jest opisany poniżej. Ponadto przedstawiono szczegółowe informacje na temat leczenia farmakologicznego powstałych sferoidów oraz dalszej analizy odpowiedzi komórkowych przy użyciu komercyjnego testu biochemicznego.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki i materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowe</td><td>technologie życia</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatyna</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki jednorazowe (10 &mikro; l)</td> <td>Fluotyki</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowe końcówki (70 &mikro; l)</td> <td>Fluotyka</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłodenne 96-dołkowe płytki</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Sferoidy komórek rakowych prezentują istotny model in vitro guzów beznaczyniowych do zastosowań w testowaniu leków przeciwnowotworowych. W niniejszej pracy opisano szczegółowy protokół wytwarzania sferoid zarówno monokulturowych, jak i kokulturowych w formacie wysokoprzepustowej płytki 96-dołkowej. Podejście to wykorzystuje wodny system dwufazowy do uwięzienia komórek w kropli gęstszej fazy wodnej zanurzonej w drugiej fazie wodnej. Kropla spoczywa na powierzchni studzienki i utrzymuje komórki w bliskiej odległości, tworząc pojedynczą sferoidę. Technologia ta została zaadaptowana do zrobotyzowanej maszyny do obsługi cieczy w celu produkcji sferoid o kontrolowanej wielkości i przyspieszenia procesu produkcji sferoidów do zastosowań związanych z przesiewaniem związków. Sferoidy leczone klinicznie stosowanym lekiem wykazują zmniejszoną żywotność komórek wraz ze wzrostem dawki leku. Zastosowanie standardowej płytki mikrodołkowej do generowania sferoidów ułatwia analizę żywotności komórek nowotworowych sferoidów poddanych działaniu leków za pomocą czytnika mikropłytek. Technologia ta jest łatwa do wdrożenia zarówno przez roboty, jak i za pomocą innych narzędzi do obsługi cieczy, takich jak pipety ręczne.

Stanowisko pracy robotycznego systemu do dozowania cieczy przedstawiono na Rysunku 1. Oznaczono głowicę pipetującą oraz wszystkie stacje wykorzystywane do robotycznego drukowania sferoidów w sekcji 4.6. Obraz pokazuje zastosowanie dwóch różnych stacji dla pudełek z końcówkami (jeden zestaw końcówek do mieszania i drugi zestaw do aspiracji/dozowania mieszaniny zawiesiny komórkowej z wodną fazą DEX). Cały układ znajduje się w standardowej komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania sterylno...

Przedstawiono protokół do zrobotyzowanego drukowania sferoid komórek rakowych na wysokoprzepustowej 96-dołkowej płytce przy użyciu wodnego systemu dwufazowego.

Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest formowanie pH komórek nowotworowych w standardowym formacie wysokoprzepustowym w celu wykorzystania ich w testowaniu leków przeciwnowotworowych. Jest to osiągane poprzez uprzednie rozpuszczenie dwóch polimerów, glikolu polietylenowego i dekstranu, w pożywce do hodowli komórkowej w określonych stężeniach, aby utworzyć skuteczny wodny układ dwufazowy. Drugim krokiem jest przygotowanie interesujących komórek w dwukrotnie większym niż pożądane zagęszczeniu komórek i zmieszanie zawiesiny komórkowej z równą objętością wodnej fazy dekstranu.Następnie należy wypełnić płytkę 96-dołkową wodną fazą glikolu polietylenowego i za pomocą robota do manipulacji cieczami dozować do dołków submikrolitrowe krople fazy dekstranowej zawierającej komórki. Kolejnym krokiem jest potwierdzenie powstania sferoidów w płytkach 96-dołkowych po 24 godzinach inkubacji oraz bezpośrednie dodanie do dołków wybranych leków przeciwnowotworowych. Na koniec, w celu wykazania procentowej przeżywalności sferoidów traktowanych lekami w stosunku do nieleczonych sferoidów kontrolnych, stosuje się standardowy test żywotności kompatybilny z czytnikiem płytek.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda wiszącej kropli czy podejście z wykorzystaniem mikrofabrykowanych dołków, jest brak konieczności stosowania specjalistycznych płytek lub urządzeń, a także możliwość wysokoprzepustowego tworzenia sfer i testowania leków. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad nowotworami i przyspieszyć odkrywanie przeciwnowotworowych środków chemioterapeutycznych. Zastosowanie tej techniki ma istotne znaczenie dla terapii nowotworów, ponieważ umożliwia wysokoprzepustowy screening związków chemicznych z wykorzystaniem bardziej relewantnych modeli guzów w celu identyfikacji nowych leków przeciwnowotworowych.Osoby nowo zapoznające się z tą metodą w wygodny sposób stworzą steroidy komórek nowotworowych i płytki z mikrootworami oraz z łatwością przeprowadzą eksperymenty z leczeniem lekowym, wykorzystując standardowy sprzęt laboratoryjny i narzędzia robotyczne. Aby rozpocząć, odważ 0,5 g glikolu polietylenowego i dodaj go do 9,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Mieszaninę mieszaj w wirówce Vortex przez jedną minutę, aby przygotować 10 ml 5% w/v wodnej fazy glikolu polietylenowego. Następnie odważ 0,128 g dekstranu i dodaj go do 0,87.Do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wlać dwa mililitry pełnej pożywki wzrostowej. Mieszaninę tę mieszać w wirówce Vortex przez jedną minutę, aby przygotować jeden mililitr wodnej fazy dekstranu o stężeniu 12,8% w/v. Oba roztwory, glikolu polietylenowego oraz dekstranu, umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na jedną godzinę.Aby wspomóc całkowite rozpuszczenie. Należy upewnić się, że nakrętki pozostają powyżej poziomu wody, aby uniknąć ewentualnej kontaminacji po godzinie. Należy wyjąć roztwór do płukania twarzy z glikolem polietylenowym i pobrać go do sterylnej plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml.Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 0,2 mikrona, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Przechowuj roztwory fazy polietylenoglikolu i dekstranu w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 24 godzin przed użyciem. Hoduj wybrane komórki nowotworowe, takie jak linia komórkowa raka piersi M-D-A-M-B 1 57, aż osiągną 90 do 100% konfluencji.Następnie zebrać komórki, stosując standardowe techniki, i określić ich liczbę za pomocą cytometru hematologicznego; pellet zawiesić do stężenia 50 milionów komórek na mililitr w mieszaninie składającej się w połowie z pożywki wzrostowej i w połowie z roztworu strand. Zapewnia to gęstość wynoszącą około 15 000 komórek na kropelkę o objętości 0,3 µL. Do każdego dołka nieprzylgającej płytki 96-dołkowej, która została uprzednio zakodowana onikiem zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, nanieść 50 µL przefiltrowanej 5% wodnej fazy glikolu polietylenowego. Dodanie glikolu polietylenowego można przeprowadzić ręcznie za pomocą pipety wielokanałowej lub automatycznie przy użyciu robota do obsługi cieczy. Zawiesinę komórkową wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby ponownie ją zawiesić.Zresuspenduj komórki, które osiadły w czasie. Dodaj 20 µL zawiesiny do co drugiej studzienki z jednej kolumny płytki 384-dołkowej. Następnie włącz automat do dozowania cieczy i przeprowadź procedurę zerowania (homingu) głowicy pipetującej.Aby zarejestrować współrzędne, należy umieścić płytkę źródłową, płytkę docelową oraz pudełka z końcówkami pipet w określonych pozycjach na stanowisku roboczym automatycznego dozownika cieczy. Korzystając z automatycznego dozownika cieczy, należy wybrać objętość mieszania, wynoszącą w przybliżeniu jedną trzecią objętości zawiesiny komórkowej, a następnie załadować jedną kolumnę kanałów głowicy pipetującej dozownika odpowiednimi końcówkami pipet ze stanowiska roboczego. Należy użyć dozownika cieczy do wymieszania zawiesiny komórkowej w 384-dołkowej płytce źródłowej.Następnie wyrzuć końcówki do pustego pudełka na odpady. Potem załaduj jedną kolumnę głowicy pipetującej końcówkami do dozowania o objętości 10 µL. Użyj automatycznego dozownika cieczy, aby pobrać 0,3 µL zawiesiny komórkowej z płytki źródłowej do każdej końcówki pipety.Następnie nanieś zawiesinę komórkową do dołków jednej kolumny płytki docelowej zawierającej 50 µL fazy polietylenoglikolu 5%. Ustaw wysokość dozowania na 0,5 mm i dozuj kroplę z prędkością przepływu 1 µL/s lub wolniej. Powtarzaj ten proces, aż we wszystkich kolumnach płytki docelowej znajdą się komórki. Po zakończeniu ostrożnie wyjmij płytkę docelową ze stacji roboczej i inkubuj komórki w warunkach zwiększonej wilgotności w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 24 godziny przed rozpoczęciem jakiejkolwiek obróbki lekami.Wizualne potwierdzenie powstawania steroidów w każdej studni płytki 96-dołkowej po 24 godzinach inkubacji. W celu przygotowania badanego leku, np. cisplatyny, należy zastosować rozcieńczenia seryjne. Rozcieńcz roztwór zapasowy leku w pożywce hodowlanej w taki sposób, aby każde rozcieńczenie miało dwukrotność pożądanej stężenia końcowego.Na jednej płytce 96-dołkowej można przetestować do pięciu różnych stężeń. Do fazy glikolu polietylenowego w każdym dołku należy dodać 50 µL roztworu leku. Dla każdej grupy badawczej, w tym dla grupy kontrolnej, do której dodaje się samo medium, należy wykorzystać dwie kolumny po osiem dołków.Inkubować steroidy z lekiem przez 48 godzin w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide, chroniąc przed światłem. Po 48 godzinach przygotować świeże rozcieńczenia leku i odnowić go, dodając dodatkowe 50 µL medium zawierającego świeży lek w pożądanym stężeniu. Inkubować PHE przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide, chroniąc przed światłem.Następnie do każdej studni należy dodać odczynnik do oceny żywotności komórek zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, a następnie inkubować płytkę przez sześć godzin w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, chroniąc ją przed światłem. Po zakończeniu analizy płytkę należy umieścić w czytniku mikropłytek i odczytać sygnał fluorescencyjny przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 560 i 590 nanometrów. Przesiewanie wysokoprzepustowe leków przeciwnowotworowych wymaga powtarzalnej metody formowania setek steroidów o jednolitym rozmiarze.Przedstawiony tutaj wykres podkreśla powtarzalność tej metody tworzenia sferoidów. W standardowej płytce 96-dołkowej średnica sferoidów wynosiła 332 µm przy odchyleniu standardowym mniejszym niż 10%. Stwierdzono, że zmienność średnic sferoidów odpowiada rozkładowi normalnemu. Po czterodniowej ekspozycji sferoidów na różne stężenia cisplatyny, klinicznego leku chemioterapeutycznego, zaobserwowano odpowiedź na leczenie zależną od dawki.Obliczona wartość połowicznej dawki letalnej (LD₅₀) stężenia leku wyniosła 4,67 µM. Leczenie lekiem w stężeniach letalnych doprowadziło do dezintegracji komórek nowotworowych. Po opanowaniu tej techniki, czas jej wykonania wynosi około dwóch godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o szybkiej weryfikacji powstania dwufazowego układu wodnego przed przejściem do eksperymentów z drukowaniem steroidów. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak kriosekcjonowanie, immunohistochemiczne barwienie próbek steroidowych oraz inne testy biologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące celów molekularnych leków w steroidach komórek nowotworowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wygodnego tworzenia trójwymiarowych (3D) kultur komórek nowotworowych oraz przeprowadzania wysokoprzepustowych testów lekowych z wykorzystaniem standardowych płytek i urządzeń.

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Produkcja sferoków komórek rakowych z użyciem dwufazowego układu wodnego do testowania leków

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Ten protokół jest przeznaczony do oceny immunoterapeutycznej cytotoksyczności przekierowanych komórek T (komórek CAR T) przeciwko komórkom rakowym (sferoidom) o strukturze 3D w czasie rzeczywistym.

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Poznaj zrobotyzowaną metodę produkcji sferoid komórek rakowych z wykorzystaniem wodnego dwufazowego systemu do testowania leków przeciwnowotworowych w formacie 96-well.

Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Przeglądaj więcej filmów