Hybrydowe obrazowanie μCT-FMT i analiza obrazu

Tomografia fluorescencyjna to wysoce czuła technika obrazowania służąca do ilościowej oceny rozkładu fluorescencji. W przypadku myszy w znieczuleniu dostępnych jest wiele celowanych sond fluorescencyjnych, które umożliwiają obrazowanie angiogenezy, apoptozy, stanu zapalnego i innych procesów. W tym filmie pokażemy, jak w naszym instytucie przeprowadza się hybrydowe obrazowanie z wykorzystaniem FMT i Micro CT.

W rozdziale pierwszym, poświęconym urządzeniom, przedstawiamy FMT – skrót ten oznacza fluorescencyjną tomografię molekularną. Tomografia polega na generowaniu obrazów 3D. FMT charakteryzuje się wysoką czułością w obrazowaniu wrodzonej fluorescencji u myszy.

Kolejnym krokiem jest otwarcie przedniego panelu, aby odsłonić wnętrze FMT. Na dole znajduje się laser zamontowany na serwonapędzie 2D. Laser emituje światło w kierunku myszy, która jest umieszczona w częściowo przezroczystym legowisku dla myszy.

Nad legowiskiem dla myszy znajduje się matryca diod LED służąca jako alternatywne źródło światła, co umożliwia pracę FMT jako standardowego urządzenia do obrazowania refleksyjnego. Koło filtrowe jest zamontowane pod soczewką, która przechwytuje światło dla detektora znajdującego się na górze urządzenia. Jest to nasz mikro-tomograf komputerowy.

Mikrotomograf komputerowy (micro CT) jest wyposażony w dwie lampy rentgenowskie i dwa detektory panelowe, co umożliwia przeprowadzenie skanowania dwuenergetycznego. Rozdział drugi, protokół skanowania FMT micro CT. Zarówno FMT, jak i micro CT są przeznaczone do obrazowania myszy; przed badaniem myszy są znieczulane izofluranem.

Do skanowania FMT konieczne jest usunięcie sierści myszy, co można skutecznie przeprowadzić przy użyciu kremu depilacyjnego. U niektórych szczepów myszy mogą wystąpić wysypki po zastosowaniu kremu depilacyjnego. Dlatego zaleca się monitorowanie zwierząt pod kątem zmian skórnych i kontakt z personelem weterynaryjnym w celu zapewnienia opieki w razie potrzeby.

Należy również rozpocząć od przetestowania tolerancji na małej grupie osobników każdego nowego szczepu myszy. Aby zapobiec hipotermii, mysz umieszcza się na podgrzewaczu. Ze względu na niewielki rozmiar, w celu wstrzyknięcia środka kontrastowego, w żyłę ogonową wprowadza się cewnik.

Jest to czynność dość trudna i wymaga pewnego doświadczenia. Jeśli krew cofnie się do cewnika, oznacza to, że został on prawidłowo umieszczony. Aby uniknąć przeciążenia objętościowego, można wstrzyknąć fluorescencyjne środki kontrastowe oraz środki kontrastowe do TK.

Maksymalna dawka do wstrzyknięcia powinna wynosić 5 ml na kilogram masy ciała, co w przypadku myszy o masie 30 g oznacza 150 µL. Do skanowania mysz umieszcza się w multimodalnym łożu dla myszy.

Na ogonie myszy mogą znajdować się symbole służące do identyfikacji. Należy unikać umieszczania ich na tułowiu, ponieważ może to wpłynąć na skanowanie optyczne. Łóżko dla myszy jest zamknięte, a jego głębokość dostosowana tak, aby ściśle utrzymać zwierzę w stałej pozycji.

Należy zachować ostrożność i monitorować oddychanie, ponieważ zbyt mocne zaciśnięcie podłoża może doprowadzić do uduszenia myszy. Myszy nago są powszechnie stosowane w badaniach onkologicznych ze względu na ich immunosupresję. Fakt, że są nago, jest korzystnym skutkiem ubocznym mutacji genetycznej.

Dzięki temu można pominąć żmudną procedurę usuwania sierści. Należy sprawdzić, czy mysz oddycha prawidłowo i w razie potrzeby odpowiednio skorygować ułożenie myszy w legowisku. Następnie legowisko z myszą umieszcza się wewnątrz mikro-CT.

Przełączono rurki transportujące gaz fluorowy ISO, aby utrzymać przepływ gazu wewnątrz urządzenia. Następnie zamknięto micro C, aby umożliwić osłonę przed promieniowaniem rentgenowskim. Skanowanie w micro C rozpocznie się tylko wtedy, gdy pokrywa będzie zamknięta.

Za pomocą przycisków w mikro-tomografie można wprowadzić mysz do wnętrza urządzenia. Na komputerze sterującym mikro-TK pozyskuje się i wyświetla topogram, a następnie dostosowuje ustawienia okna, aby lepiej widzieć mysz. Można wyznaczyć jeden lub więcej zakresów skanowania ZUP. Ich położenie jest wskazane przez jasnoniebieskie obszary.

Zazwyczaj wystarczające są od jednego do trzech skanów ZUP. Po rozpoczęciu skanowania postęp jest wyświetlany za pomocą ciemnoniebieskich pasków postępu. Nasz mikro-CT z panelem płaskim wykonuje skany ZUP sekwencyjnie, co różni się od klinicznego CT spiralnego.

Za pomocą przycisków platforma dla myszy zostaje przesunięta do przodu. Ponownie otwiera się pokrywę osłonową i wymienia rurki do znieczulenia. Uchwyt zostaje ostrożnie zdjęty z platformy, a rurka do znieczulenia zostaje wyciągnięta.

Jest to konieczne, ponieważ AN oraz FMT nie zależą od tej małej rurki. Zamiast tego, mała komora wewnątrz FMT zostaje wypełniona gazem anestetycznym. Następnie legowisko z myszą zostaje przeniesione do FMT i umieszczone zgodnie z instrukcjami komputera sterującego FMT.

Dostosowuje się pole widzenia skanowania oraz gęstość próbkowania. Zazwyczaj wykorzystuje się około 120 punktów. Skanowanie rozpoczyna się po naciśnięciu przycisku.

W pierwszym przebiegu FMT pozyskiwany jest obraz prześwietlenia lub wzbudzenia dla każdego punktu źródła laserowego. W tym filmie proces ten przedstawiono w trybie przyspieszonym. Zazwyczaj zajmuje on około pięciu minut.

Można zauważyć, że przez górną część ciała przenika znacznie mniej światła w porównaniu do dolnej części ciała. Wynika to z faktu, że organy o większej względnej objętości krwi, takie jak serce, wątroba i nerki, znajdują się głównie w górnej części ciała. Krew jest głównym absorbentem dla światła bliskiej podczerwieni.

Drugi przebieg polega na ponownym skanowaniu tych samych punktów źródłowych z zastosowaniem innego filtra, który przepuszcza jedynie światło fluorescencyjne Rozdział trzeci, interaktywny olej i segmentacja. Aby połączyć dane z obu urządzeń, wykorzystuje się markery wbudowane w podkładkę dla myszy.

Markery są również widoczne na obrazie refleksyjnym pozyskanym przez FMT. Markery stanowią w rzeczywistości proste otwory i nie muszą być wypełnione żadnym środkiem fluorescencyjnym ani kontrastem do TK. W naszym instytucie opracowaliśmy program komputerowy, który automatycznie przeprowadza detekcję i fuzję markerów.

Kształt myszy, a także heterogeniczne mapy absorpcji i rozproszenia są automatycznie szacowane z wykorzystaniem danych mikro-CT, zgodnie z opisem w naszej niedawnej publikacji w czasopiśmie Theranostics. Parametry te są istotne dla ilościowej rekonstrukcji fluorescencji. Aby zmierzyć biodystrybucję fluorescencji, konieczna jest segmentacja organów.

Poniżej przedstawiamy sposób interaktywnego generowania takiej segmentacji przy użyciu oprogramowania imulitic preclinical, opracowanego w naszym instytucie. Proces segmentacji został pokazany w przyspieszonym tempie; doświadczona osoba może go przeprowadzić w ciągu około 10 do 20 minut. W pierwszej kolejności wczytywany jest zestaw danych CT.

Można go poddać inspekcji w 3D, wykorzystując renderowanie powierzchniy izo. Poprzez zmianę ustawień okna można zmodyfikować wartość ISO. Na przykład, aby zwizualizować kości całego ciała myszy wraz z podłożem, należy załadować nakładkę.

Sygnał w tym przykładzie pojawia się w pęcherzu moczowym. Teraz wyłączono wizualizację nakładki, aby skupić się na segmentacji anatomicznej.

W natywnych skanach mikro-tomografii komputerowej płuca są łatwo identyfikowalne dzięki silnemu kontrastowi negatywnemu w stosunku do innych tkanek miękkich. Dużą strukturą wewnątrz płuc jest serce. W pierwszej kolejności dokonajmy segmentacji płuc.

Wszystkie woksele poniżej określonej wartości są segmentowane za pomocą progowania. Są one wyświetlane w kolorze zielonym. Płuco stanowi spójny obszar, który można wyodrębnić za pomocą operacji wypełniania.

Podobnie jak w przypadku narzędzia wypełniania (wiadro z farbą). W programie graficznym można oddzielić naczynie od płuca poprzez wycinanie i wypełnianie. Organy wypukłe, takie jak pęcherz moczowy, można segmentować, rysując szkice w celu wyznaczenia granic organu.

Należy dodawać kolejne szkice, aż do osiągnięcia wystarczającej dokładności. Organy niewypukłe, takie jak jelita, można segmentować fragment po fragmencie. Wątroba jawi się jako obszar homogeniczny i posiada bardziej złożoną strukturę.

Z uwagi na to, że organ składa się z wielu płatów, segmentację można zapisać na dysku i wczytać do programu. Wykorzystując taką segmentację, sygnał fluorescencyjny można przypisać do poszczególnych organów. Program oblicza te wartości i zapisuje je w dodatkowym arkuszu; w przypadku skanów podłużnych segmentację należy powtórzyć dla każdego punktu czasowego, ponieważ odstępy są zazwyczaj zbyt długie, aby utrzymać mysz w znieczuleniu w stałej pozycji.

W związku z tym segmentacja jest czasochłonnym zadaniem, jeśli w badaniu bierze udział wiele myszy i wiele punktów czasowych. Aby ilościowo ocenić wyniki, należy załadować nałożenie (overlay) i segmentację. Kliknij przycisk „set Batch settings”, aby program zapamiętał aktualne ustawienia.

Teraz kliknij „batch statistics”, aby polecić programowi obliczenie wartości dla wszystkich obszarów we wszystkich skanach mikro CT FMT. Zajmie to kilka sekund. Następnie statystyki zostaną zapisane w jednym pliku arkusza kalkulacyjnego.

Jest to wygodne, ponieważ użytkownik nie musi samodzielnie łączyć kilkudziesięciu plików. Na podstawie tego pliku można obliczyć krzywe narządowe. Rozdział czwarty, reprezentatywne wyniki.

Aby sprawdzić, czy fuzja działa prawidłowo, wykorzystano fantom aros. W celu uzyskania rozproszenia dodano nieco proszku tytanu. Aby uzyskać nieregularny kształt, odcięto niektóre fragmenty.

W fantomie rozmieszczono kilka małych wtrąceń wypełnionych fluorescencyjnym i CT środkiem kontrastowym. Ponieważ FMT nie zna rzeczywistego kształtu obiektu i zakłada kształt uproszczony, rekonstrukcja nie jest dokładna w przypadku obiektów o nieregularnych kształtach. W związku z tym zaimplementowaliśmy inną rekonstrukcję, która wykorzystuje kształt wyprowadzony z danych mikro-CT.

Jak widać, lokalizacja sygnału w fantomie jest znacznie lepsza. Aby przeanalizować dane in vivo, przejrzyjmy kolejne punkty czasowe obrazowania. Jest to skan wstępny.

To, co widzimy, to w zasadzie jedynie szum i artefakty. Przechodząc do następnego punktu czasowego, czyli tego po iniekcji, obserwujemy znacznie silniejszy sygnał, jednak ustawienia okna są zbyt kontrastowe. Za pomocą okna dialogowego można dostosować ustawienia okna.

Większość sygnału obserwujemy w pęcherzu moczowym. Przechodząc do kolejnego punktu czasowego, 0,2 godziny po iniekcji, zauważamy sygnał poza organizmem myszy. Dzieje się tak, ponieważ mysz oddała mocz z fluorescencją na podłoże.

Dalsza regulacja okna obrazowania pozwala zauważyć sygnał w obrębie kręgosłupa i kolan. Przejdźmy teraz do punktu czasowego 0,4 h po iniekcji; sygnał z moczu już zniknął, a fluorescencja w kręgosłupie i kolanach jest widoczna w kolejnych punktach czasowych: 6 h oraz 24 h po iniekcji. Obserwujemy ten sam obraz.

Przejdźmy teraz do kolejnego przypadku. Skan wstępny nie wykazuje żadnych zmian przy zastosowaniu tych ustawień okna. Skan wykonany 15 minut po wstrzyknięciu wykazuje silny sygnał z pęcherza i tak dalej.

W niniejszym badaniu stwierdzono wysokie stężenia w pęcherzu moczowym krótko po wstrzyknięciu, co było konsekwencją szybkiej wydalania nerkowego tej sondy. Ponadto sygnał w kręgosłupie szybko rośnie i pozostaje stosunkowo stabilny w późniejszych punktach czasowych obrazowania. Rozdział piąty, podsumowanie.

Podsumowując, przedstawiamy multimodalny protokół obrazowania, który łączy zalety fluorescencji, tomografii molekularnej oraz mikrotomografii komputerowej. Anatomiczne dane mikro CT umożliwiają lepszą rekonstrukcję fluorescencji dzięki wykorzystaniu kształtu myszy. Ponadto są one przydatne do generowania segmentacji organów, które są niezbędne do wyodrębnienia pomiarów ilościowych z danych obrazowych.