Name: Funkcjonalne zachowanie i regeneracja wątroby człowieka za pomocą subnormotermicznej perfuzji maszynowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę subnormotermicznej perfuzji maszynowej wątroby ludzkiej w temperaturze 21 °C. Technika umożliwia zachowanie funkcji narządu, ocenę witalności oraz analizę metabolicznej regeneracji tkanki w warunkach pozaustrojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za finansowanie z Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych (granty R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 i F32 DK103500), projektu CIMIT nr 12-1732 oraz Shriners Hospitals for Children. Chcielibyśmy wyrazić wdzięczność New England Organ Bank za wsparcie tej pracy.

Użycie tkanek ludzkich musi być sprawdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) lub równoważną. Opisana tutaj praca została zatwierdzona i uznana za zwolnioną przez Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (nr 2011P001496).
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Asepcyjnie dodawać suplementy do pożywki Williamsa E bez czerwieni fenolowej, jak opisano w Tabeli 1. Roztwór należy przygotować na świeżo przed użyciem. Insulinę należy dodać tuż przed użyciem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wątroby przy tylnym stole
<ol>
	<li>Umieść wypełnioną lodem miskę organową na sterylnej, udrapowanej powierzchni. Wyjmij wątrobę z pudełka, pozostawiając ją w torbie z zimnym roztworem konserwującym. Utrzymuj wątrobę w większości zanurzoną.</li>
	<li>Zidentyfikuj tętnicę wątrobową (HA), która będzie zlokalizowana dystalnie do łaty aortalnej. Wypreparuj tętnicę, aby odsłonić różne przycięte gałęzie na całej długości za pomocą nożyczek Metzenbaum. Ostrożnie rozetnij całą długość tętnicy, aby zapobiec przecięciu naczynia zaopatrującego wątrobę. Nie przycinaj ani nie wiąż gałęzi, które nie mają widocznego końca.</li>
	<li>Zwiąż wszystkie gałęzie tętnic niezaopatrujące wątrobę za pomocą jedwabnego szwu w rozmiarach od 0 do 4–0, w zależności od wielkości naczynia. Zamknij gałęzie, które są zbyt krótkie, aby je związać lub w tętnicy, za pomocą ściegu 7–0 prolenu. Zawiąż i przetnij śledzionę i lewe tętnice żołądkowe w pobliżu ich początku na pniu trzewnym.</li>
	<li>Usuń plaster aortalny, przecinając pień trzewnej bezpośrednio pod plastrach. Kankalacja pnia trzewnej za pomocą kaniuli aortalnej.</li>
	<li>Zidentyfikuj żyłę wrotną (PV) i tępo ją wypreparuj. Zwiąż wszystkie gałęzie i kaniuluj PV przygotowanym segmentem rurki w rozmiarze 24.</li>
	<li>Usunąć odcinki przepony z żyły głównej nadwątrobowej, bez przecinania samej żyły. Odpływ z żyły głównej spływa bezpośrednio do komory narządowej.</li>
	<li>Wyciąć 2 próbki tkanek o pełnym obwodzie (o długości 2-3 mm) od końca wspólnego przewodu żółciowego; jedną zamrozić w ciekłym azocie (przechowywać w temperaturze -80 °C), a drugą przechowywać w 10% buforowanej formalinie, odpowiednio do analizy tkankowej i histologicznej. Kanulować wspólny przewód żółciowy za pomocą kaniuli naczynia i rurki drenacyjnej wykonanej z rurki natleniacza membranowego.</li>
	<li>Zidentyfikuj i podwiąż przewód torbielowaty za pomocą jedwabnego krawata 0. Przewód torbielowaty znajduje się między wspólnym przewodem żółciowym a pęcherzykiem żółciowym.</li>
	<li>Podłącz zestaw wężyków do płukania do lodowatych worków z roztworem Lactated Ringer (LR) i zalej przewód, usuwając całe powietrze.</li>
	<li>Ustaw regulator przepływu na rurce spłukującej na powolny strużek. Przed podłączeniem rurki płuczącej do kaniuli żyły wrotnej, należy zatkać żyłę wrotną palcami na wnęce i wypełnić kaniulę i żyłę płukaniem, aby usunąć powietrze z żyły wrotnej. Nie podnoś worka o więcej niż 20 cm ponad wysokość wątroby podczas zimnego uderzenia, aby uniknąć nadmiernego nacisku na żyłę.</li>
	<li>Podczas spłukiwania należy na krótko zakryć PV w najniższym punkcie. Sprawdź fotowoltaikę pod kątem wycieków. Odgałęzienia statków mogą być zamknięte w sposób opisany powyżej. Przepłukać wątrobę przez PV łącznie 2 litrami lodowatego LR.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.10, 2.11 dla HA z 1 l LR.</li>
</ol>
3. Przygotowanie systemu SNMP
<ol>
	<li>Zalać urządzenie perfuzyjne, dodając 2 litry perfuzatu (21°C) do miski narządowej i uruchamiając urządzenie w celu zalania rurki. Postępuj zgodnie z instrukcją urządzenia, aby przygotować się do perfuzji, ustawiając temperaturę na 21 °C. Zacznij od ciśnień odpowiednio 3 mmHg i 30 mmHg na PV i HA. Otwórz zbiornik gazu i ustaw przepływ na 3 l/min.</li>
	<li>Pobrać próbkę gazometrii krwi zarówno z dopływu HA, jak i PV, pobierając 0,3 ml próbki z portów próbki i uruchamiając ją w maszynie do analizy gazometrii krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Potwierdzić odpowiednie natlenienie (pO2 >700 mmHg) i pH (7,35-7,45).</li>
	<li>Przed podłączeniem wątroby należy pobrać 1,0 ml próbkę perfuzatu jako pomiar t=0 w probówce Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wyciąć dwie biopsje klinowe ± 250 mg z wątroby za pomocą jednosiecznego stalowego ostrza; jedną z nich zamrozić w ciekłym azocie (przechowywać w temperaturze –80 °C), a drugą przechowywać w 10% buforowanej formalinie. Zważ wątrobę przed perfuzją.</li>
</ol>
4. Perfuzja ludzkiej wątroby
<ol>
	<li>Przenieś wątrobę do urządzenia. Podłącz dopływ PV do kaniuli PV, po usunięciu powietrza z PV, jak w kroku 2.10. Podłącz HA w podobny sposób. Ustaw ciśnienie PV i HA na 3 i 30 mmHg. Wątroba powinna być prawie zanurzona w perfuzacie. Przykryj wszelkie suche powierzchnie, w tym naczynia dopływowe, mokrą sterylną gazą, aby zapobiec odwodnieniu</li>
	<li>Pozwól, aby rurka żółciowa spłynęła do pojemnika zbiorczego. Upewnij się, że otwór odpływu żółci znajduje się na poziomie wątroby lub niżej, aby żółć mogła swobodnie wypłynąć.</li>
	<li>Docelowe natężenia przepływu wynoszą 275–325 ml/min.kg i 50–100 ml/min.kg odpowiednio dla PV i HA po ogrzaniu wątroby do 21 °C. Ponieważ każda wątroba inaczej reaguje na perfuzję, należy uważnie monitorować przepływ w pierwszych minutach. Zwiększyć lub zmniejszyć ciśnienie na jednym ze zbiorników, jeśli docelowe natężenie przepływu nie zostanie osiągnięte. Nie przekraczać 50 mmHg na HA i 5 mmHg na PV.</li>
	<li>Próbki mogą być pobierane z tkanki wątroby, perfuzatu i żółci zgodnie z preferencjami badaczy. Zalecamy co najmniej następujący schemat pobierania próbek podczas perfuzji.
	<ol>
		<li>Biopsje tkanek, n = 2 x 250 mg, co godzinę. Przechowywanie: zamrozić jeden w ciekłym azocie i przechowywać przez długi czas w temperaturze –80 °C. Dodatkowo wykonaj kolejną biopsję przed i po perfuzji i utrwal w 10% buforowanej formalinie (n = 1)</li>
		<li>Próbki perfuzyjne, n = 2 x 1 ml, co 15 minut przez pierwszą godzinę, a następnie co 30 minut. Pobrać próbki z portu próbki dopływu energii fotowoltaicznej. Przechowywanie: –80 °C przez długi czas.</li>
		<li>Gazometria krwi pod kątem dopływu PV i HA oraz odpływu żyły głównej. n = 3 x 0,3 ml, co 30 min. Pobrać próbki zarówno z portu próbki PV, jak i HA. Pobrać 0,3 ml próbki z żyły głównej, wkładając strzykawkę do żyły i bezpośrednio wprowadzić do analizatora parametrów krytycznych krwi. Użyj wyjścia, aby zapewnić odpowiednie natlenienie i pH.</li>
		<li>Produkcja żółci, n = 1 x 1 ml, co godzinę. Wizualnie określić ilościowo produkcję żółci co godzinę i pobrać próbkę z pojemnika zbiorczego. Wymień pojemnik po pobraniu próbki. Przechowywanie: suchy lód i długotrwałe –80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj perfuzję przez 3 godziny. Monitorując ciśnienie, pH i natlenienie oraz pobierając próbki przez cały czas. Dostosuj pH, dodając wodorowęglan sodu do perfuzatu.</li>
	<li>Pod koniec perfuzji należy pobrać końcowe próbki, podczas gdy wątroba jest poddawana perfuzji. Odłącz wątrobę i usuń kaniulę dróg żółciowych. Pobrać 2 próbki tkanek przewodu żółciowego po perfuzji, jak opisano powyżej, do przechowywania w temperaturze –80 °C i w 10% buforowanej formalinie.</li>
	<li>Wyrzuć ludzką wątrobę zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi usuwania zagrożeń biologicznych.</li>
</ol>

<ol><li>Merion, R. M., Pelletier, S. J., Goodrich, N., Englesbe, M. J., Delmonico, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donation+after+cardiac+death+as+a+strategy+to+increase+deceased+donor+liver+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Donation after cardiac death as a strategy to increase deceased donor liver availability.</a> Ann Surg. 244 (4), 555-562 (2006).</li>
<li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+facilitates+successful+transplantation+of+%27orphan%27+extended+criteria+donor+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation facilitates successful transplantation of 'orphan' extended criteria donor livers.</a> Am J Transplant. 15, 161-169 (2015).</li>
<li>Dutkowski, P., Schlegel, A., de Oliveira, M., Müllhaupt, B., Clavien, P. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOPE+for+human+liver+grafts+obtained+from+donors+after+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">HOPE for human liver grafts obtained from donors after cardiac death.</a> J Hepatol. 60 (4), 765-772 (2013).</li>
<li>Dutkowski, P., Clavien, P. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutions+to+Shortage+of+Liver+Grafts+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Solutions to Shortage of Liver Grafts for Transplantation.</a> Br J Surg. 101 (7), 739-774 (2014).</li>
<li>Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex-vivo+Normothermic+Liver+Perfusion%3A+An+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex-vivo Normothermic Liver Perfusion: An Update.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).</li>
<li>Monbaliu, D., Brassil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+Perfusion+of+the+Liver%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Machine Perfusion of the Liver: Past, Present, and Future.</a> Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 160-166 (2010).</li>
<li>Matsuno, M., Uchida, K., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Machine+Perfusion+Preservation+of+Liver+Grafts+From+Donation+After+Cardiac+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Impact of Machine Perfusion Preservation of Liver Grafts From Donation After Cardiac Death.</a> Transplant Proc. 46 (4), 1099-1103 (2014).</li>
<li>Schlegel, A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hypothermic+machine+perfusion+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Int%22%5BJournal%5D)">Role of hypothermic machine perfusion in liver transplantation.</a> Transplant Int. , (2014).</li>
<li>Op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am J Transplant. 13, 1327-1335 (2013).</li>
<li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+prophylaxis+in+%28sub%29normothermic+organ+preservation%3A+In+vitro+efficacy+and+toxicity+of+cephalosporins%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Antibiotic prophylaxis in (sub)normothermic organ preservation: In vitro efficacy and toxicity of cephalosporins.</a> Transplantation. 95 (8), 1064-1069 (2013).</li>
<li>Post, I. C., Dirkes, M. C., Heger, M., Bezemer, R., van't Leven, J., van Gulik, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+flow+and+pressure+management+in+machine+perfusion+systems+for+organ+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Optimal flow and pressure management in machine perfusion systems for organ preservation.</a> Ann Biomed Eng. 40 (12), 2698-2707 (2012).</li>
<li>Post, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+preservation+at+hypothermic+to+normothermic+conditions+using+clinical+and+experimental+organ+preservation+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell preservation at hypothermic to normothermic conditions using clinical and experimental organ preservation solutions.</a> Exp Cell Res. 319 (17), 2501-2513 (2013).</li>
<li>Klein, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+Donation+and+Utilization+in+the+United+States%2C+1999-2008%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Organ Donation and Utilization in the United States, 1999-2008.</a> Am J Transplant. 10 (4), 973-986 (2010).</li>
<li>Jay, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Increased+Costs+of+Donation+After+Cardiac+Death+Liver+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">The Increased Costs of Donation After Cardiac Death Liver Transplantation.</a> Ann Surg. 251 (4), 743-748 (2010).</li>
<li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+Complications+After+Liver+Transplantation%3A+Old+Problems+and+New+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Biliary Complications After Liver Transplantation: Old Problems and New Challenges.</a> Am J Transplant. 13, 253-265 (2013).</li>
<li>Morrissey, P., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donation+After+Circulatory+Death%3A+Current+Practices%2C+Ongoing+Challenges+and+Potential+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donation After Circulatory Death: Current Practices, Ongoing Challenges and Potential Improvement.</a> Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).</li>
<li>Verdonk, R., Buis, C., Porte, R., Haagsma, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+complications+after+liver+transplantation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Biliary complications after liver transplantation: A review.</a> Scand J Gastroenterol. 41, Suppl 243. 89-101 (2006).</li>
<li>Pine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Transplantation+Following+Donation+After+Cardiac+Death%3A+An+Analysis+Using+Matched+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Liver Transplantation Following Donation After Cardiac Death: An Analysis Using Matched Pairs.</a> Liver Transpl. 15 (9), 1072-1082 (2009).</li>
<li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS One. 11, e110642(2014).</li>
<li>Bruinsma, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnormothermic+Machine+Perfusion+for+Ex+Vivo+Preservation+and+Recovery+of+the+Human+Liver+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Subnormothermic Machine Perfusion for Ex Vivo Preservation and Recovery of the Human Liver for Transplantation.</a> Am J Transplant. 14, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Bruinsma, B. G., Yarmush, M. L., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organomatics+and+organometrics%3A+Novel+platforms+for+long-term+whole-organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Organomatics and organometrics: Novel platforms for long-term whole-organ culture.</a> Technology. 02 (1), 13-22 (2014).</li>
<li>Berendsen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+subnormothermic+machine+perfusion+system+restores+ischemically+damaged+liver+grafts+in+a+rat+model+of+orthotopic+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Res%22%5BJournal%5D)">A simplified subnormothermic machine perfusion system restores ischemically damaged liver grafts in a rat model of orthotopic liver transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 6(2012).</li>
</ol>

Doktorzy BE Uygun, K Uygun i Yarmush są wynalazcami oczekującego patentu, który jest istotny dla tego badania (WO/2011/ 002926), a dr BE Uygun, K Uygun i Yarmush są wynalazcami oczekującego patentu, który jest istotny dla tego badania (WO/2011/35223). Doktorzy K. Uygun i Bruinsma złożyli tymczasowy wniosek patentowy związany z tą pracą. Dr K Uygun i BE Uygun mają udziały finansowe w Organ Solutions, firmie zajmującej się rozwojem technologii konserwacji narządów. Interesy Dr. K Uygun i BE Uygun są zarządzane przez MGH and Partners HealthCare zgodnie z ich polityką dotyczącą konfliktu interesów.

Próbując odzyskać wątrobę uszkodzoną podczas niedokrwienia, opracowaliśmy system SNMP, który może być stosowany po okresie przechowywania w chłodni. Perfuzja maszynowa subnormotermiczna stanowi realną alternatywę dla konwencjonalnych chłodni, a także metod perfuzji hipotermicznej i normotermicznej. Istnieją różne systemy; wszystkie oferują różne zalety i wady 3,9,20. SNMP pozwala na perfuzję bez nośnika tlenu, ponieważ metaboliczne zapotrzebowanie na tlen w temperaturze 21 °C jest zaspokajane przez aktywne natlenianie perfuzatu.
Chociaż metabolizm jest zmniejszony w warunkach subnormotermicznych, jest znaczny i wymaga wsparcia bogatego w składniki odżywcze roztworu perfuzyjnego. Tradycyjne roztwory perfuzyjne, takie jak roztwór perfuzyjny maszyny Belzer, mają na ogół minimalny skład i są przeznaczone do perfuzji na zimno. Pożywka E Williamsa jest stosowana jako pożywka do hodowli hepatocytów od wielu lat i zawiera składniki, które są uniwersalne do wspierania funkcji komórkowych, w szczególności w ciepłych warunkach ex vivo .
Pomiary wykonywane podczas perfuzji maszynowej odzwierciedlają funkcję narządu. Bezpośrednio obserwowalne parametry, takie jak produkcja żółci i pobór tlenu, są pomiarami w czasie rzeczywistym, które można wykorzystać do oceny wątroby przed przeszczepem. Podobnie, markery uszkodzenia komórek i niedokrwienia (K+, uwalnianie mleczanu) mogą być mierzone bezpośrednio w roztworze perfuzyjnym i mogą wskazywać na funkcję narządów 20. Wraz z dalszym rozwojem technologii perfuzji maszynowej i osiąganiem coraz szerszego zastosowania klinicznego, można uzyskać dokładne korelacje między funkcją ex vivo a wynikami klinicznymi, a parametry perfuzji będą przydatne przy podejmowaniu decyzji o przeszczepie lub odrzuceniu wątroby o niskiej jakości. Co więcej, wraz z rozwojem narzędzi analitycznych w miejscu opieki nad pacjentem, bardziej wyrafinowana analiza stanie się dostępna bezpośrednio podczas perfuzji maszynowej 21.
W tej pracy pokazujemy, że wątroba może być wspierana w systemie SNMP przy minimalnym uszkodzeniu wątroby, odzwierciedlonym przez histologię i uwalnianie ALT. Funkcjonalna regeneracja wątroby jest najlepiej odzwierciedlona przez ATP, które, jak wykazano, koreluje z żywotnością wątroby i silnie sugeruje sukces przeszczepu w modelach zwierzęcych 22. Odzyskanie ex vivo i przed przeszczepieniem przeszczepów wątroby pozwoliłoby na znaczne rozszerzenie puli wątroby dawców, korygując dysproporcję między podażą a popytem na wątroby dawców w transplantacji.

Przeszczep wątroby jest jedynym sposobem leczenia dziesiątków tysięcy pacjentów, którzy cierpią na schyłkową niewydolność wątroby. Aby ułatwić pomyślne przeszczepienie, konieczne jest optymalne zachowanie wątroby od momentu jej pozyskania od dawcy do momentu wszczepienia jej biorcy, aby zapobiec szybkiemu pogorszeniu stanu przeszczepu. Obecny standard konserwacji wątroby jest określany jako "statyczne przechowywanie w niskiej temperaturze": wątroba jest schładzana w lodowatym roztworze konserwującym, zmniejszając w ten sposób metabolizm wątroby i spowalniając szkodliwe skutki niedokrwienia. Chociaż ta technika przechowywania w niskiej temperaturze pozwoliła na udany przeszczep, narządy o marginalnej jakości, takie jak narządy DCD uszkodzone przez ciepłe niedokrwienie lub stłuszczenie, wykazują gorsze wyniki leczenia pacjentów 1. Istnieje szybko rosnąca liczba dowodów na to, że perfuzja ex vivo przeszczepów wątroby jako alternatywna metoda konserwacji może potencjalnie poprawić wyniki dla tych narządów brzeżnych 2,3.
Przeszczep wątroby stał się ofiarą własnego sukcesu. Znacznie więcej pacjentów jest kierowanych do przeszczepu niż jest dostępnych wątrób, a tysiące umierają na liście oczekujących w Stanach Zjednoczonych każdego roku. Biorąc pod uwagę rzeczywistość niedoboru wątroby od dawców i rosnące wykorzystanie przeszczepów wątroby o nieoptymalnej jakości dla potrzebujących biorców, powszechnie uważa się, że perfuzja ex vivo przeszczepów wątroby przed implantacją niesie ze sobą obietnicę zmiany paradygmatu w transplantacji wątroby. W ostatnich latach nastąpił wyraźny wzrost zainteresowania badawczego tą tematyką 4-8. W różnych ośrodkach europejskich i północnoamerykańskich hipotermiczna perfuzja maszynowa została wprowadzona klinicznie 8, a normotermiczna perfuzja maszynowa w temperaturach fizjologicznych została ostatnio zastosowana do odrzuconych ludzkich wątrob i jest również przekładana do użytku klinicznego 9. Intensywny rozwój doprowadził do opracowania różnych protokołów, a ciągła optymalizacja identyfikuje optymalne parametry perfuzji 10-12. Stosowanie przeszczepów o niskiej jakości wzrosło ponad 10-krotnie w ciągu ostatniej dekady13. W porównaniu z obecnym standardem konserwacji wątroby (statyczne przechowywanie w chłodni), perfuzja maszynowa ex vivo zapewnia wiele potencjalnych korzyści, z których wszystkie skutkują bardzo potrzebnym rozszerzeniem puli narządów i potencjalnym zmniejszeniem częstości występowania powikłań po przeszczepie. W szczególności poważnym problemem pozostają powikłania żółciowe, które obecnie nękają nieoptymalnej jakości przeszczepy wątroby po przeszczepie.
Perfuzja maszynowa w warunkach subnormotermicznych daje czas na obiektywną ocenę funkcji przeszczepu pod kątem przydatności do przeszczepu 19. Podczas gdy wątroba jest perfundowana w obwodzie ex vivo, zarówno perfuzat, jak i żółć wytwarzana podczas perfuzji mogą być próbkowane w celu pomiaru markerów funkcji narządu. W ten sposób "poważnie uszkodzona" wątroba, która jest odrzucana do przeszczepu zgodnie z obecnymi kryteriami, może być obiektywnie oceniona pod kątem jej przydatności do przeszczepu. Ocena żywotności potencjalnie pozwala na wykorzystanie wielu z tych narządów do przeszczepu. Równie potężną zaletą perfuzji maszynowej jest naprawa i poprawa wątroby, która została uszkodzona przez niedokrwienie ciepłem/zimnem. ATP jest wyczerpywany bardzo szybko podczas ciepłego i następującego po nim zimnego niedokrwienia i może być uzupełniany w okresie perfuzji maszynowej przed implantacją wątroby 20. Wątroba, z zapasami energii i uzupełnionym stanem metabolicznym, jest wstępnie przygotowana i lepiej przygotowana na szkodliwe skutki uszkodzenia reperfuzyjnego po implantacji u biorcy.
Ta praca opisuje metodę perfuzji ex vivo ludzkich przeszczepów wątroby w laboratorium, która będzie przydatna dla badaczy, którzy chcą badać zarówno technikę, jak i korzystne efekty perfuzji maszynowej ex vivo. Wykorzystujemy ludzkie wątroby dawców, które zostały odrzucone do przeszczepu, a następnie są przydzielane do celów badawczych.
Standardowa technika pobierania wątroby polega na płukaniu tętniczym wątroby in situ po krzyżowym zaciśnięciu aorty u dawców w stanie śmierci mózgowej (DBD) lub po zatrzymaniu krążenia u dawców śmierci krążeniowej (DCD), opisanej bardziej szczegółowo w innym miejscu 20. Dodatkowo wątroba jest schładzana podczas pobierania poprzez wypełnienie jamy brzusznej dawcy lodem. Preferencje dotyczące roztworów do spłukiwania różnią się w zależności od regionu, przy czym większość zamówień wykorzystuje University of Wisconsin lub roztwór histydyny, tryptofanu i ketoglutaranu (HTK). Dodatkowe płukanie żyły wrotnej od tyłu poprawia wypłukiwanie zalegającej krwi. Wątroby są często pozyskiwane pozostawiając odcinek aorty otaczający pień trzewny. Pęcherzyk żółciowy jest nacinany, żółć jest zasysana, a przewód żółciowy jest przepłukiwany. Wątroby są pakowane w sterylne worki zawierające lodowaty roztwór konserwujący i transportowane w przeznaczonych do tego pojemnikach lub chłodziarkach. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, czas ciepłego i zimnego niedokrwienia powinien być ograniczony odpowiednio do 60 minut i 12 godzin. Pomimo rutynowych badań serologicznych pod kątem przenośnych czynników chorobotwórczych, należy podjąć standardowe środki ostrożności przy przekazywaniu narządów ludzkich, próbek pobranych z narządów ludzkich i wszelkich produktów przemiany materii.
Protokół tutaj opisuje subnormotermiczną perfuzję maszynową za pomocą dostępnego na rynku urządzenia do perfuzji wątroby. Zastosowanie takiego urządzenia pozwala na szybsze przełożenie na warunki kliniczne i krzyżową walidację różnych protokołów i ustawień urządzenia między grupami badawczymi i ośrodkami transplantacyjnymi.

<table><tbody><tr><td>Urządzenie do perfuzji Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist Liver Assist</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowy zestaw</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist jednorazowy</td><td></td></tr><tr><td>Williams' Średni E</td><td>Sigma</td><td>W1878&ndash; 6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Eli Lilly & Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 5,000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>MGH apteka</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik gazu Carbogen 95% O2/5% CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>Reduktor gazów specjalnych</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer' s roztwór</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>Ząbkowane kleszcze Adson</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Kleszczyki do tkanek, 7,75 ", 2,25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Metzenbaum 7" zakrzywione SureCut Wolfram</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Uchwyt na igłę 5.5&ndash; 7"</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 czarne plecione jedwabne szwy</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 nylonowy szew, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do analizy gazometrii Siemens</td><td></td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>wagi Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka wyświetlacza ciśnienia</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe zestawy wyświetlaczy ciśnienia</td><td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny termometr termoparowy i sonda</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 i EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula naczyniowa z żołędziową końcówką, 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do płukania zestawu do nawadniania</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>Miska do mieszania, 4 L</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

funkcjonalne zachowanie i regeneracja wątroby człowieka za pomocą subnormotermicznej perfuzji maszynowej

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Obecnie występuje poważny niedobór przeszczepów wątroby dostępnych do przeszczepów. Potrzebne są nowe techniki konserwacji narządów, aby poszerzyć pulę wątroby dawców. Perfuzja maszynowa przeszczepów wątroby dawcy jest alternatywą dla tradycyjnego przechowywania wątroby w chłodni i jest bardzo obiecująca jako metoda rozszerzania puli narządów dawcy. Niedawno opisaliśmy potencjalne korzyści płynące z subnormotermicznej perfuzji maszynowej ludzkiej wątroby. Wątroby perfundowane maszynowo wykazały poprawę funkcji i przywrócenie poziomu ATP w tkankach. Dodatkowo maszynowa perfuzja przeszczepów wątroby w temperaturach subnormotermicznych pozwala na obiektywną ocenę funkcjonalności i przydatności wątroby do przeszczepienia. W ten sposób wiele wątrób, które wcześniej zostały wyrzucone ze względu na ich nieoptymalną jakość, można uratować dzięki regenerującym efektom perfuzji maszynowej i wykorzystać do przeszczepu. Tutaj szczegółowo opisujemy tę technikę subnormotermicznej perfuzji maszynowej. Przeszczepy wątroby ludzkiej przeznaczone do badań są perfundowane przez tętnicę wątrobową i żyłę wrotną za pomocą bezkomórkowego natlenionego perfuzatu w temperaturze 21 °C.

Podczas perfuzji wątroby można przeprowadzić szereg obserwacji i analiz, w tym obserwacje bezpośrednie w czasie rzeczywistym, takie jak szybkość przepływu i produkcja żółci; pomiary w czasie rzeczywistym, takie jak analiza gazometryczna perfuzatu, oraz pomiary post hoc wykonywane po pobraniu próbek, obejmujące analizę biochemiczną perfuzatu i tkanki oraz analizę histologiczną. Wyniki przytoczone w tym miejscu pochodzą z 22 perfundowanych ludzkich wątrób. Wątroby zostały odrzucone do transplantacji z różnych przyczyn, w tym z powodu wieku dawcy, nadmiernego czasu ciepłego niedokrwienia, wyników biopsji (stłuszczenie, stan zapalny, włóknienie) oraz z powodów logistycznych. 18 wątrób pozyskano po śmierci krążeniowej, a 4 po śmierci mózgowej. W obu przypadkach dawcy zostali poddani wstępnemu leczeniu 30 000 jednostek heparyny i przepłukani in situ oraz na stole operacyjnym roztworem UW. Średni czas zimnego niedokrwienia wynosił 531 ± 237(SD) min, a średni czas ciepłego niedokrwienia wynosił 27 ± 10(SD) min, mierzony od momentu odłączenia od aparatury podtrzymującej życie do przepłukania zimnym roztworem. Obserwacje i pomiary w czasie rzeczywistym mogą służyć do oceny wątroby w trakcie perfuzji, natomiast pomiary post hoc są ujawniane po zakończeniu perfuzji.
Obserwacje w czasie rzeczywistym
Przepływ przez wątrobę rozpoczyna się na poziomie niższym niż docelowe wartości przepływu, co wynika z wyższego oporu w zimnej wątrobie. Przy zastosowaniu ciśnienia 3 mmHg w żyle wrotnej (PV) i 30 mmHg w tętnicy wątrobowej (HA) docelowe przepływy są zazwyczaj osiągalne po ogrzaniu wątroby do 21 °C po 60 min perfuzji (Rycina 1A). Przepływ żółci jest zazwyczaj obserwowany w ciągu 10 min perfuzji i jest on stabilny podczas całego procesu (Rycina 1B). Ilość żółci zależy od jakości wątroby i waha się od 0,3 ml/h/kg wątroby do 18 ml/min/kg. W przypadku wątrób z dłuższym czasem ciepłego niedokrwienia przepływ żółci ma tendencję do spadku, natomiast krótszy czas ciepłego niedokrwienia skutkuje bardziej stabilną lub nawet zwiększoną produkcją żółci.
Pomiary w czasie rzeczywistym
Bezpośredni i częsty pomiar perfuzatu za pomocą analizy gazometrycznej krwi jest niezbędny zarówno do celów eksperymentalnych, jak i do utrzymania odpowiednich warunków perfuzji, w szczególności natlenienia oraz pH. Częściowe ciśnienie tlenu rozpuszczonego powinno wynosić powyżej 700 mmHg na dopływie zarówno do żyły wrotnej (PV), jak i tętnicy wątrobowej (HA). Ciśnienie tlenu na odpływie, mierzone w żyłach głównych, zazwyczaj spada wraz z wydłużeniem czasu perfuzji, co odzwierciedla zwiększone pobieranie tlenu. Tempo pobierania tlenu można obliczyć zgodnie z wcześniejszym opisem 13 ; wartości te wynosiły od 0,5–2,2 ml O2/min/kg na początku perfuzji do 2,4-9,7 ml O2/min/kg w czasie t = 3 hr (Rysunek 1C). W ciągu pierwszych 30 min obserwuje się spadek pH (Rysunek 1D), wynikający przede wszystkim z uwalniania mleczanu do perfuzatu. Można temu przeciwdziałać poprzez suplementację 8,4% wodorowęglanem sodu, po czym po około 90 min pH powraca do normy. Zazwyczaj wymagane jest podanie 30-50 ml 8,4% wodorowęglanu sodu. Stężenie mleczanu szybko wzrasta w ciągu pierwszych 15-30 min, ale zaczyna spadać po pierwszej godzinie (Rysunek 1E).
Pomiary post-hoc
W perfuzacie można zmierzyć poziom aminotransferaz wątrobowych, takich jak ALT. W ciągu pierwszych 30 min zazwyczaj obserwuje się znaczny wzrost poziomu ALT, co odzwierciedla wypłukiwanie ALT uwolnionego podczas niedokrwienia (Rycina 1F). Wykazano, że poziom ALT dobrze koreluje z czasem ciepłego niedokrwienia 13. Perfuzja maszynowa zwiększyła zawartość ATP 2,8-krotnie, co odzwierciedla regenerację statusu energetycznego (Rycina 1G). Analiza histologiczna H&amp;E nie wykazuje dodatkowych uszkodzeń powstałych podczas perfuzji maszynowej (Rycina 1H, I). Należy zauważyć, że schemat biopsji zaproponowany w niniejszym protokole służy celom badawczym i może nie być możliwy do zastosowania w celach klinicznych.
<img alt="Wykresy z eksperymentu perfuzji wątroby (A-G) i obrazy histologiczne (H-I) przedstawiające parametry metaboliczne." src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ocena ludzkich wątrób podczas perfuzji maszynowej. Przepływ przez PV i HA podczas SNMP (A), produkcja żółci, ilościowo określona na godzinę perfuzji (B), tempo poboru tlenu (OUR), obliczone z różnicy między dopływem (PV+HA) a odpływem (żyła główna); linie przerywane przedstawiają ciśnienia parcjalne tlenu w dopływie i odpływie podczas perfuzji (C), pH oraz mleczan podczas perfuzji (D, E), uwalnianie ALT do perfuzatu (F), zawartość ATP zmierzona w tkance z biopsji wykonywanych co godzinę (G) oraz barwienia H&amp;E wątroby (54-letni dawca DCD, 19 min niedokrwienia ciepłego, 559 min niedokrwienia zimnego) przed (H) i po (I) perfuzji. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Opisujemy metodę perfuzji ex vivo ludzkich przeszczepów wątroby w temperaturze subnormotermicznej (21 °C).

Funkcjonalne zachowanie i regeneracja wątroby człowieka za pomocą subnormotermicznej perfuzji maszynowej

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie podnormotermicznej perfuzji maszynowej ludzkiej wątroby w celu konserwacji, regeneracji i oceny narządu. W warunkach badań przedklinicznych realizuje się to poprzez przygotowanie wątroby do podłączenia do urządzenia w pierwszym etapie. W drugim kroku przygotowuje się system perfuzji maszynowej, a w ostatnim etapie podłącza się wątrobę i rozpoczyna perfuzję.Wątroba poddana perfuzji maszynowej stanie się funkcjonalnie aktywna w stanie subnormalnej temperatury i zacznie produkować żółć. Ostatecznie próbki pobrane z wątroby podczas perfuzji mogą zostać poddane analizie w celu zbadania regeneracji metabolicznej i funkcji narządu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami konserwacji, takimi jak perfuzja w niskiej temperaturze i perfuzja w temperaturze normalnej, jest to, że maszynowa perfuzja w temperaturze subnormalnej umożliwia regenerację funkcjonalną i ocenę żywotności wątroby, nie wymagając przy tym zaspokojenia wysokiego zapotrzebowania metabolicznego charakterystycznego dla perfuzji w temperaturze ciała.Wiele aspektów tej techniki wymaga doświadczenia lub demonstracji, aby została wykonana pomyślnie. Na przykład demonstracja sposobu przygotowania wątroby na stole operacyjnym (back table preparation), obejmująca preparację tętnicy, żyły i przewodu żółciowego, może być pomocna dla badaczy bez wcześniejszego przeszkolenia chirurgicznego. Po otrzymaniu wątroby należy postawić miskę do organów wypełnioną lodem na sterylnej powierzchni przykrytej obrusem, a następnie wyjąć wątrobę z pojemnika transportowego, pozostawiając ją w większości zanurzoną w worku z zimnym roztworem konserwującym. Następnie należy użyć nożyc Metzenbauma, aby odsłonić poszczególne odgałęzienia w obrębie unaczynienia tętniczego wątroby, od aorty do właściwej tętnicy wątrobowej.Następnie ostrożnie wyprewałuj pozostałą część tętnicy, aby zapobiec przerwaniu naczyń doprowadzających krew do wątroby, nie przecinając ani nie podwiązując odgałęzień, które nie mają widocznego końca. Po wyizolowaniu tętnicy użyj jedwabnych nici chirurgicznych o rozmiarze od 0 do 4-0, aby podwiązać wszystkie odgałęzienia tętnicze, które nie zaopatrują wątroby w krew. Podwiąż i przetnij tętnicę śledzionową oraz żołądkową blisko ich odejścia od pnia trzewnego.Wyciąć płat aorty wokół pnia trzewnego. Następnie użyć kaniuli do perfuzji tętniczej, aby zakaniulować pień trzewny. Teraz uwolnić żyłę wrotną poprzez preparację, podwiązując wszelkie odgałęzienia lub zszywając otwory w żyle, a następnie zakaniulować ją kaniulą do perfuzji żyły wrotnej.Odetnij fragmenty przepony od żyły głównej dolnej w odcinku nadwątrobowym, uważając, aby nie przeciąć samej żyły. Następnie pobierz dwa próbki tkanki o długości od dwóch do trzech milimetrów z pełnego obwodu końca wspólnego przewodu żółciowego. Próbki należy traktować delikatnie.Jedną próbkę zamroź gwałtownie w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze -80 °C, a drugą przechowuj w 10% buforowanym formalinie. Następnie kaniuluj wspólny przewód żółciowy za pomocą kaniuli naczyniowej i podłącz dren wykonany z rurki o małej średnicy. Następnie podwiąż przewód pęcherzykowy nicią jedwabną o rozmiarze 0.Podłącz zestaw drenów do lodowatych worków z roztworem Ringer-lakciatem i przepłucz dreny w celu usunięcia powietrza. Ustaw regulator przepływu na drenach na powolne kapanie i zaciśnij żyłę wrotną w obrębie wnęki, aby usunąć z naczynia wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie napełnij kaniulę w żyle roztworem płuczącym, aby usunąć powietrze z żyły wrotnej, dbając o to, by nie podnosić worka wyżej niż 20 cm ponad wysokość wątroby, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia w żyle.Następnie przepłucz wątrobę łącznie dwoma litrami schłodzonego do temperatury ICEC roztworu Ringera z mleczanem. Podczas płukania krótko zamknij żyłę wrotną w najniższym punkcie, aby sprawdzić szczelność, a następnie powtórz procedurę płukania tętnicy wątrobowej przy użyciu jednego litra roztworu, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Podczas płukania wątroby przygotuj system perfuzji, dodając dwa litry perfuzatu Profuse 8 w temperaturze pokojowej do misy z organem, a następnie uruchom urządzenie, aby zapowietrzyć przewody. Ustaw temperaturę na 21°C.Następnie ustaw ciśnienie 3 mm Hg w żyle wrotnej oraz 30 mm Hg w tętnicy wątrobowej. Otwórz zbiornik z karbogenem i ustaw przepływ na 3 l/min. Następnie pobierz próbki gazometrii krwi z portów pobierania dopływu z żyły wrotnej i tętnicy wątrobowej, a próbki poddaj analizie w analizatorze gazometrii krwi zgodnie z instrukcjami producenta, aby potwierdzić odpowiednie natlenienie i pH.W razie potrzeby użyj wodorowęglanu sodu lub chlorku wodoru, aby skorygować pH. Następnie, przed podłączeniem wątroby, pobierz próbkę 1 mL perfuzatu jako pomiar w punkcie zero i przechowuj ją w temperaturze -80 °C. W tym samym czasie za pomocą stalowego ostrza z jednym ostrzem pobierz z wątroby dwie biopsje klinowe o masie około 250 mg każda.Szybkie zamrażanie jednej próbki w ciekłym azocie w celu przechowywania w temperaturze -80 °C oraz utrwalenie drugiej w 10% buforowanym formalinie. Przed rozpoczęciem perfuzji należy zważyć wątrobę, a następnie przenieść organ do komory organowej urządzenia i usunąć powietrze z kaniul. Zostało to właśnie zademonstrowane.Po wprowadzeniu kaniul, podłącz dopływy żyły wrotnej i tętnicy wątrobowej do odpowiednich kaniul. Rozpocznij perfuzję, upewniając się, że wątroba jest zanurzona w płynie perfuzyjnym, zakrywając wszystkie suche powierzchnie, w tym naczynia dopływowe, moką sterylną gazą. Aby zapobiec odwodnieniu, pozwól, aby rurka żółciowa odprowadzała treść do pojemnika zbiorczego.Należy zadbać o to, aby otwór drenu żółciowego znajdował się na poziomie wątroby lub poniżej, aby umożliwić swobodny odpływ żółci. Po ogrzaniu wątroby do 21°C, należy ustalić prędkości przepływu odpowiednio od 275 do 325 ml/min/kg dla żyły wrotnej oraz od 50 do 100 ml/min/kg dla tętnicy wątrobowej. Podczas perfuzji należy pobierać próbki z perfundowanej tkanki wątroby oraz żółci, w zależności od potrzeb.Kontynuuj perfuzję przez trzy godziny, monitorując ciśnienie, pH oraz natlenienie i w razie potrzeby korygując pH za pomocą wodorowęglanu sodu. Po zakończeniu perfuzji pobierz końcowe próbki, odłącz wątrobę i usuń kaniulę z przewodu żółciowego. Na koniec pobierz dwie próbki tkanek przewodu żółciowego po perfuzji, tak jak właśnie pokazano, a następnie zutylizuj ludzką wątrobę.Postępując zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi utylizacji materiałów biologicznie niebezpiecznych. Przepływ rozpoczyna się od niskich wartości ze względu na wyższy opór w zimnej wątrobie, przy zastosowaniu ciśnienia 3 mmHg w żyłach wrotnych i 30 mmHg w tętnicy wątrobowej. Docelowe przepływy można zazwyczaj osiągnąć po ogrzaniu wątroby do 21 °C po 60 minutach perfuzji. Częsty pomiar perfuzatu za pomocą analizy gazometrii krwi jest niezbędny zarówno do celów eksperymentalnych, jak i do utrzymania odpowiednich warunków perfuzji.Na przykład ciśnienie parcjalne tlenu rozpuszczonego powinno być wyższe niż 700 mmHg na dopływie zarówno żyły wrotnej, jak i tętnicy wątrobowej. Natomiast ciśnienie tlenu na odpływie mierzone w żyle głównej powinno zazwyczaj spadać wraz z dłuższym czasem perfuzji, co odzwierciedla zwiększony pobór tlenu. W PERFU eight można również zmierzyć na przykład wątrobowe aminotransferazy.Zazwyczaj obserwuje się wzrost poziomu alaninaminotransferazy (ALT) w ciągu pierwszych 30 minut perfuzji, przy minimalnym dalszym wzroście w pozostałej części procesu. Dalsza ocena produkcji TP w wątrobach poddawanych perfuzji maszynowej wykazuje 2,8-krotny wzrost zawartości A TP w wątrobie, co odzwierciedla odzyskiwanie statusu energetycznego. Ponadto analiza histologiczna h&amp;e nie wykazuje żadnych dodatkowych uszkodzeń powstałych podczas procedury.Postępowanie zgodnie z tą procedurą umożliwia szczegółową analizę wyizolowanej wątroby, dostarczając unikalnych informacji na temat fizjologii i patologii wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu utrzymania ludzkiej wątroby podczas maszynowej perfuzji suberycznej, aby ułatwić ocenę jej funkcji poza organizmem.

functional-human-liver-preservation-recovery-means-subnormothermic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przechowywanie i odzyskiwanie ludzkiego wątroby w funkcji za pomocą perfuzji maszynowej w temperaturze nieznacznie poniżej 37°C

Przeszczepy marginalne, takie jak stłuszczone wątroby, przeszczepy od starszych dawców lub wątroby pobrane po śmierci sercowej (DCD) źle znoszą tradycyjne, zimne przechowywanie statyczne. Opracowaliśmy nowatorski model subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo w celu zachowania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby przed przeszczepem.

Technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby

Tutaj prezentujemy protokół opisujący natlenioną perfuzję ex situ przeszczepów wątroby dawcy. Ten artykuł zawiera protokół krok po kroku dotyczący pozyskania i przygotowania przeszczepu wątroby do perfuzji maszynowej, przygotowania płynu perfuzyjnego, zalania maszyny perfuzyjnej i przeprowadzenia natlenionej normotermicznej perfuzji maszynowej przeszczepu wątroby.

Ex situ Perfuzja maszynowa Normothermiczna wątroby dawcy

Istnieje znaczny niedobór dawców wątroby, a kryteria dla dawców wątroby zostały rozszerzone. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) został opracowany w celu oceny i modyfikacji funkcji narządów. Badanie to demonstruje szczurzy model NEVLP i testuje zdolność pegylowanej katalazy do łagodzenia uszkodzeń wątroby.

Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Opisany tutaj świński model normotermicznej perfuzji maszynowej wątroby (NMP) może być z powodzeniem wykorzystany do badania NMP jako strategii zachowania, narzędzia do oceny żywotności i platformy do naprawy narządów. Ma wysoką wartość translacyjną, jednak jest trudny technicznie i pracochłonny.

Chorobowa normemmiczna izolowana perfuzja wątroby u świń

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Ten protokół przedstawia metodologię tworzenia modelu świń wykorzystującego zmienną perfuzję maszynową (MP) w celu zachowania wątroby dawcy, a następnie ortotopowego przeszczepu wątroby (OLTx). Ma on na celu zwiększenie wskaźnika powodzenia OLTx przy użyciu dawstwa wątroby po śmierci krążeniowej (DCD) i ustanowienie stabilnego modelu.

Zachowanie wątroby od dawców świń po śmierci krążeniowej (DCD) metodą perfuzji i ortotopowego przeszczepu wątroby

W tym miejscu przedstawiamy protokół dla otwartego, modyfikowalnego normotermicznego systemu perfuzji ex vivo , zaprojektowanego w celu przezwyciężenia wysokich kosztów i ograniczonej elastyczności istniejących platform, umożliwiając bardziej dostępne, opłacalne i iteracyjne wykorzystanie w przedklinicznych badaniach biomedycznych.

System perfuzji normamicznej o otwartym kodzie źródłowym przeznaczony dla naukowców

Mechanizmy prowadzące do rozwoju przerostu błony wewnętrznej (IH) i niewydolności przeszczepów żył są nadal słabo poznane. Badanie to opisuje system ex vivo do perfuzji ludzkich żył pod kontrolowanym przepływem i ciśnieniem. Ponadto oceniono skuteczność zbrojenia siatką zewnętrzną w celu ograniczenia rozwoju IH.

Procedura perfuzji żył odpiszczelowych człowieka ex vivo i wzmocnienia zewnętrznego

Tutaj przedstawiamy protokół jak przeprowadzić izolowaną perfuzję wątroby (IHP) za pomocą melfalanu, a także omawiamy IHP jako opcję leczenia przerzutów czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej do wątroby.

Izolowana perfuzja wątrobowa w leczeniu przerzutów czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej do wątroby

Poważny niedobór organów spowodował zwiększone wykorzystanie brzeżnych przeszczepów nerek do przeszczepów. Wywołało to zainteresowanie alternatywnymi metodami przechowywania, ponieważ szczególnie przeszczepy brzeżne słabo tolerują przechowywanie w niskiej temperaturze. Technika normotermicznej perfuzji nerek ex vivo (NEVKP) stanowi nowatorską metodę konserwacji przeszczepów nerek przed przeszczepem.

Normothermiczna perfuzja nerek ex vivo w celu zachowania przeszczepów nerek przed przeszczepem

Poznaj metodę subnormotermicznej perfuzji maszynowej wątroby ludzkiej w temperaturze 21 °C. Technika umożliwia zachowanie funkcji narządu, ocenę witalności oraz analizę metabolicznej regeneracji tkanki w warunkach pozaustrojowych.

Funkcjonalne zachowanie i regeneracja wątroby człowieka za pomocą subnormotermicznej perfuzji maszynowej

Przeglądaj więcej filmów