Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wizualizacja aktywności enzymów deubikwitynujących w komórkach. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek do wysokiej konfluencji i ich zebranie, aby w drugim kroku umożliwić otrzymanie skoncentrowanego lizatu. Do przygotowania lizatu, który zachowuje obraz metaboliczny cytoplazmy komórkowej, stosowana jest łagodna liza mechaniczna.

Następnie enzymy inkubuje się z sondami pochodzącymi z hemaglutyniny w celu oznakowania enzymów deubikwitynujących poprzez reakcję z cysteiną w centrum aktywnym; wyniki ukazują profile aktywności wielu enzymów deubikwitynujących na podstawie Western blottingu i następnego wykrywania chemiluminescencyjnego. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak standardowy Western blotting, jest to, że pozwala ona użytkownikowi na wizualizację aktywności wielu enzymów. W jednym z doświadczeń przygotowano pożywkę do hodowli komórkowej, odlewając 30 ml zmodyfikowanego medium Eagle'a, DMEM, z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej do 50 ml probówki stożkowej w celu hodowli.

W celu przeniesienia komórek do eksperymentu, przenieś zamrożone komórki M 17 lub he A z przechowywania w ciekłym azocie do małego zlewka z letnią wodą. Następnie przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml medium. Następnie dodaj trochę medium do fiolki z komórkami i przenieś resuspensowane komórki w ciągu pięciu sekund od rozmrożenia.

Wirować zawiesinę komórkową przy 450 Gs przez pięć minut w celu uzyskania osadu komórkowego. Następnie do kolby T 75 dodać 20 mililitrów pożywki. Usunąć pożywkę z komórek za pomocą ssaka.

Do osadu komórkowego dodać 5 mL świeżej pożywki i resuspender. Przenieść 5 mL zawiesiny komórkowej do 20 mL pożywki w kolbie T 75 i inkubować w temperaturze 37 °C. Wymieniać pożywkę co trzy dni aż do momentu zbioru komórek.

Usuń pożywkę za pomocą odsysacza, uważając, aby nie dotknąć komórek. Przemyj komórki pięcioma mililitrami fosforanowego buforu solnego lub PBS. Usuń PBS za pomocą odsysacza.

Następnie do kolby T 75 należy dodać 3 mL trypsyny EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Po inkubacji do kolby należy dodać 6 mL świeżej pożywki i resuspenderować komórki.

Przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 290 Gs przez pięć minut, odlej nadsącz i dodaj pięć ml PBS. Delikatnie postukaj dno probówki, aby rozbić osad przed ponownym wirowaniem przy 290 Gs przez pięć minut. Po trzykrotnym powtórzeniu płukania w PBS, usuń zużyty PBS i resuspenduj komórki w jednym ml świeżego PBS.

Następnie przenieś komórki do probówki typu Eppendorf i wiruj przy 290 g przez pięć minut. Aby przeprowadzić lizę komórek, zmierz pipetą przybliżoną objętość osadu, a następnie odważ szklane kuleczki w stosunku masy do objętości wynoszącym 1:1. Do osadu dodaj bufor do lizy w objętości dwukrotnie większej niż objętość osadu.

Następnie dodać szklane kuleczki do osadu i buforu do lizy. Lizować komórki w probówce typu Eppendorf przy maksymalnym wytrząsaniu przez 30 minut w temperaturze 4 °C, stosując wortex w pomieszczeniu chłodniczym. Krótko odwirować przy 200 ×g przez 30 sekund.

Aby osadzić kuleczki i zebrać nadsącz. Do nadsączu dodać taką samą objętość kuleczek szklanych jak poprzednio, wymieszać w wirówce Vortex ponownie przy maksymalnym wytrząsaniu przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsius, a następnie krótko odwirować przy 200 Gs przez 30 sekund. Aby osadzić kuleczki szklane, zebrać nadsącz.

Na koniec odwiruj próbki przy 5 030 GS przez pięć minut. Aby usunąć jądra komórkowe, błony oraz nieuszkodzone komórki, zbierz nadsącz, który stanowi lizat komórkowy do derywatyzacji tkanek, przeprowadzonej za pomocą kwasu nimikowego, lub do analizy BCA. Przenieś go na płytkę 96-dołkową, aby określić stężenie białka w lizacie za pomocą kolorymetrycznego czytnika płytek 96-dołkowych, zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu do oznaczania białka metodą BCA.

Po oznaczeniu stężenia białka, doprowadzić alikwot odpowiadający 20 µg całkowitego białka do objętości 50 µL przy użyciu wody dejonizowanej. Następnie do roztworu dodać 2 µL 1,35 µM HAUB vinyl cell phone. W końcowej mieszaninie reakcyjnej uzyskuje się 20 µg lizatu na 50 nM sondy.

Jest to duży nadmiar molowy. Aby zapewnić znakowanie funkcjonalnych enzymów deubikwitynujących lub dubów, pozostawić roztwór do inkubacji przez jedną godzinę w temperaturze 37°C. Następnie do roztworu dodać bufor do próbek Laemmli.

Dla objętości reakcji wynoszącej 52 µL należy użyć 26 µL buforu do próbek 2x, 13 µL buforu do próbek 4x lub 8,87 µL buforu do próbek 6x. Inkubować próbkę przez pięć minut w temperaturze 95 °C. Schłodzić na lodzie.

Przed nałożeniem żelu do analizy western blot, najpierw nałóż 40 µL przygotowanej próbki na 12-dołkowy żel 4–20% tris-glicynowy. Prowadź elektroforezę przy napięciu 95 V, aż front jonowy dotrze do dolnej krawędzi. Następnie przeprowadź nocną transfer żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) zgodnie z poniższymi instrukcjami.

Najpierw inkubuj membranę w barwniku AMDO black, a następnie zeskanuj ją, aby uzyskać obraz pokazujący ilość białka w każdej ścieżce. Następnie odbarw membranę i inkubuj ją przez jedną godzinę w 5% mleku w PBS w celu blokowania. W dalszej kolejności inkubuj membranę z pierwotnym przeciwciałem anty-HA w rozcieńczeniu 1:10 000 w 5% mleku w PBS, albo przez noc w temperaturze 4 °C, albo przez cztery godziny w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji przeprowadź trzy płukania, każde po pięć minut, w PBS z 0,1% detergentem tween 20. Następnie inkubuj membranę w przeciwciałach mysich przeciw peroksydazie chrzanowej w rozcieńczeniu 1:10 000 w 5% mleku w PBS przez co najmniej dwie godziny. Przeprowadź trzy płukania w sposób opisany wcześniej, a następnie jedno płukanie przez pięć minut w PBS.

Na koniec inkubuj membranę w odczynniku do detekcji chemiluminescencyjnej przez 10 minut i wykryj sygnał za pomocą detektora luminescencyjnego. W detektorze zastosuj ustawienie automatycznej ekspozycji. Poziom załadunku białka sprawdzono przy użyciu barwienia AM mito black.

Ten krok kontrolny pozwala upewnić się, że różnice w aktywności wynikają z rzeczywistych procesów komórkowych, a nie z nierównego obciążenia białkiem. Ścieżki pokazane tutaj wskazują, że w pierwszym eksperymencie wykorzystano równe ilości białka. W drugim eksperymencie naniesiono nierówne ilości białka ze względu na oczekiwane różnice w profilach aktywności różnych linii komórkowych.

Przeprowadzono to w celu zapewnienia wykrycia profilu aktywności dla komórki M 17. Lizaty inkubowano z maide etylowym, który jest inhibitorem cysteiny i powinien prowadzić do osłabienia sygnału w analizie Western blot. Membrany inkubowano z przeciwciałem pierwotnym anty-HA.

Przeciwciało przeciwko peroksydazie chrzanowej mysiej, a następnie detekcja z wykorzystaniem obrazowania chemiluminescencyjnego. Prawidłowe znakowanie dubów za pomocą sond skutkuje powstaniem profilu w każdej ścieżce membrany. Intensywność prążków o różnych masach cząsteczkowych odpowiada poziomowi aktywności enzymu dub.

Różnice w poziomach aktywności różnych dub w różnych liniach komórkowych stają się widoczne, gdy porównuje się podobne białka, takie jak U CHL one, w komórkach he a i M 17. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak frakcjonowanie subkomórkowe, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, jak procesy patologiczne wpływają na aktywność enzymów ubikwitynacyjnych w organellach związanych z błoną.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru aktywności enzymu deubikwitynującego przy użyciu sond skierowanych na centrum aktywne.