Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek
10 maja 2015
Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja aktywności enzymów de ubikwitynowanych w komórkach. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek do wysokiej płynności koligacji i zbieranie ich w celu ułatwienia produkcji skoncentrowanego lizatu w drugim etapie. Delikatna liza mechaniczna służy do wytworzenia lizatu, który utrzymuje metaboliczny obraz cytoplazmy komórki.
Następnie enzymy są inkubowane z sondami pochodzącymi z hemaglutyniny w celu znakowania enzymów de ubikwityny poprzez reakcję z resztą cysteiny w miejscu aktywnym, wyniki pokazują profile aktywności wielu enzymów deubikwityny w oparciu o Western blotting i późniejsze wykrywanie chemiluminescencyjne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak regularne western blotting, jest to, że pozwala użytkownikowi na wizualizację aktywności wielu enzymów. W jednym eksperymencie przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych przez Ali, podając 30 mililitrów dobe docos, zmodyfikowanej pożywki orłów lub DMEM plus 10% płodowej surowicy bydlęcej do 50-mililitrowej stożkowej probówki do hodowli.
Komórki do eksperymentu przenoszą zamrożone komórki M 17 lub A z magazynu ciekłego azotu do małej zlewki z letnią wodą. Następnie przenieś komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 30 mililitrów pożywki. Następnie dodaj trochę pożywki do fiolki z komórkami i przenieś zawieszone komórki w ciągu pięciu sekund od rozmrożenia.
Odwirować zawiesinę komórkową o sile 450 g przez pięć minut, aby uzyskać osad komórkowy. Następnie dodać 20 mililitrów podłoża do kolby T 75. Usunąć pożywkę z komórek za pomocą odsysania.
Dodaj pięć mililitrów świeżej pożywki do osadu komórkowego i zreaktywuj Suspend. Przenieść pięć mililitrów zawiesiny komórkowej do 20 mililitrów pożywki w kolbie T 75 i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zmiana pożywki co trzy dni w celu zebrania komórek.
Usuń pożywkę przez odsysanie, uważając, aby nie dotknąć komórek. Umyj komórki pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS. Usuń PBS za pomocą odsysania.
Następnie dodaj trzy mililitry tripsin EDTA do kolby T 75 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Po inkubacji dodać sześć mililitrów świeżej pożywki do kolby i zrewanżować. Zawieś komórki.
Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować przy 290 G przez pięć minut, usunąć supernatant i dodać pięć mililitrów PBS. Delikatnie postukaj w spód probówki, aby rozbić osad przed centryfuzją w temperaturze 290 G przez pięć minut. Po trzykrotnym powtórzeniu płukania PBS, usuń stary PBS i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze świeżego PBS.
Następnie przenieś komórki do probówki einor i wiruj z prędkością 290 GS przez pięć minut. Aby przeprowadzić lizę komórek, zmierz przybliżoną objętość osadu za pomocą pipety i odważ szklane kulki oraz stosunek masy do objętości jeden do jednego. Dodaj bufor do lizy do osadu w podwójnej objętości osadu.
Następnie dodaj szklane koraliki do granulki i poddaj lizie. Buforuj komórki w probówce einor przy maksymalnym mieszaniu przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wirując w zimnym pomieszczeniu. Wirować krótko przy 200 GS przez 30 sekund.
Aby osadzić koraliki i zebrać supernatant. Dodać taką samą objętość szklanych kulek jak poprzednio do wiru sklarowanego nad osadem, ponownie przy maksymalnym mieszaniu przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po krótkiej centrfuzji w temperaturze 200 G przez 30 sekund. Aby osadzić szklane koraliki, zbierz supernatant.
Na koniec odwirować w temperaturze 5 030 GS przez pięć minut. Aby usunąć jądra, błony i nieuszkodzone komórki, należy zebrać supernatant, który jest lizatem komórkowym do pochodnej tkanki, wykonywanym za pomocą kwasu Cinco nimic lub analizy BCA. W 96-dołkowej płytce w celu określenia stężenia białka w lizacie za pomocą metrycznego czytnika płytek 96-dołkowych chole, zgodnie z protokołem zestawu do oznaczania białek BCA.
Po określeniu stężenia białka doprowadzić podwielokrotność odpowiadającą 20 mikrogramom białka całkowitego do 50 mikrolitrów za pomocą wody dejonizowanej. Następnie dodaj do roztworu dwa mikrolitry 1,35 mikromola winylowego telefonu komórkowego HAUB. Wynikiem jest 20 mikrogramów lizatu do 50 nanomolowców sondy w końcowej mieszaninie reakcyjnej.
To jest w dużym nadmiarze molowym. Aby zapewnić znakowanie funkcjonalnych enzymów lub dubów ubikwityny, pozostaw roztwór do inkubacji na godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodać do roztworu bufor do próbki laly.
W przypadku objętości reakcyjnej 52 mikrolitrów należy użyć 26 mikrolitrów dwóch x buforu próbki, 13 mikrolitrów czterech x buforu próbki lub 8,87 mikrolitrów sześciokrotnego buforu próbki. Inkubować próbkę przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Schłodzić na lodzie.
Przed załadowaniem żelu do wykonania western blot najpierw załaduj 12, dobrze od czterech do 20% żelu glicynowego tris z 40 mikrolitrami przygotowanej próbki. Uruchom żel pod napięciem 95 woltów, aż czoło jonowe dotrze do dna. Następnie przeprowadź nocny transfer żelu na membranę z polifluorku DI winorośli lub PVDF.
Transfer Najpierw inkubuj błonę w czarnym barwniku AMDO i zeskanuj membranę, aby uzyskać obraz pokazujący ilość białka w każdym pasie. Następnie zatrzymaj błonę i inkubuj w 5% mleku w PBS przez jedną godzinę do zablokowania. Następnie inkubuj błonę w pierwszorzędowym przeciwciałie anty HA o stężeniu od jednego do 10 000 w 5% mleku w PBS, przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez cztery godziny w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji wykonaj trzy prania przez pięć minut każde w PBS z 0,1% detergentem tween 20. Następnie inkubować błonę w peroksydazie chrzanowej myszy o stężeniu od 1 do 10 000 w 5% mleku w PBS przez co najmniej dwie godziny. Wykonaj trzy prania jak poprzednio, a następnie jedno pranie przez pięć minut w PBS.
Na koniec inkubować membranę w chemiluminescencyjnym odczynniku detekcyjnej przez 10 minut i wykrywać za pomocą detektora luminescencyjnego. Użyj ustawienia automatycznej ekspozycji w detektorze. Obciążenie białkami sprawdzono za pomocą AM mito black stain.
Ten etap kontroli zapewnia, że różnice w aktywności wynikają z rzeczywistych procesów komórkowych, a nie z nierównego obciążenia białkami. Pokazane tutaj pasy wskazują, że w pierwszym eksperymencie użyto równych ilości białka. W drugim eksperymencie załadowano nierówne ilości białka ze względu na oczekiwane różnice w profilach aktywności różnic w liniach komórkowych.
Miało to na celu zapewnienie wykrycia profilu aktywności dla komórki M 17. Lizaty inkubowane z maide etylowe, które jest inhibitorem cystyny i powinno prowadzić do zmniejszenia sygnału na Western blot. Błony inkubowano w pierwotnym przeciwciałie anty HA.
Peroksydaza chrzanowej myszy, a następnie wykryta za pomocą obrazowania chemiluminescencyjnego. Pomyślne znakowanie dubów za pomocą sond skutkuje profilem w każdym pasie membrany. Intensywność prążków o różnych masach cząsteczkowych odpowiada poziomowi aktywności enzymu dub.
Różnice w poziomach aktywności różnych dubów w różnych liniach komórkowych stają się widoczne, gdy podobne białka, takie jak U CHL one, są porównywane w komórkach he a i M 17. Po tej procedurze. Inne metody, takie jak frakcjonowanie subkomórkowe, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak: w jaki sposób procesy patologiczne wpływają na aktywność enzymu ubikwityny w organellach związanych z błoną?
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć aktywność enzymu ubikwitynowanego za pomocą sond skierowanych na miejsce aktywne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wizualizacji aktywności enzymów deubikwitynujących w komórkach za pomocą specjalistycznych sond. Technika ta pozwala na wykrywanie wielu aktywności enzymatycznych, dostarczając informacji na temat potencjalnych docelowych terapii.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biochemia
Tło
- Enzymy deubikwitynujące odgrywają kluczową rolę w procesach komórkowych.
- Rozumienie ich aktywności może prowadzić do nowych strategii terapeutycznych.
- Obecne metody mogą nie skutecznie wizualizować wielu aktywności enzymatycznych.
- Ten protokół ma na celu zajęcie się tymi ograniczeniami.
Cel badania
- Wizualizacja aktywności enzymów deubikwitynujących w hodowanych komórkach.
- Ulepszenie metod wykrywania profilu aktywności enzymów.
- Identyfikacja potencjalnych docelowych terapii poprzez analizę aktywności enzymatycznej.
Stosowane metody
- Komórki są hodowane do wysokiej konfluencji i zbierane.
- Przeprowadzana jest delikatna mechaniczna liza, aby uzyskać skoncentrowany lizat.
- Enzymy są inkubowane z sondami pochodnymi hemaglutynyny.
- Aktywność ocenia się za pomocą wykrywania Western blotting i chemiluminescencyjnego.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na wizualizacje wielu aktywności enzymów deubikwitynujących.
- Profil aktywności jest generowany na podstawie wyników Western blot.
- Wyniki pokazują skuteczność techniki w porównaniu do tradycyjnych metod.
- Poprzez to podejście można zidentyfikować potencjalne nowe docelowe terapie.
Konkluzje
- Ten protokół zapewnia solidną metodę badania enzymów deubikwitynujących.
- Ulepsza zdolność do wizualizacji aktywności enzymatycznej w kontekście komórkowym.
- Wyniki mogą przyczynić się do rozwoju nowych strategii terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Measuring deubiquitinating enzyme activity enables target validation in neurodegenerative and oncological pathways where ubiquitin-proteasome dysregulation is implicated. This assay provides a rapid, multiplexed readout of functional enzyme states, supporting early hypothesis testing and mechanistic de-risking. By capturing activity profiles across cell lines, it informs portfolio triage and lead identification efforts in target-rich disease areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking enzyme activity to disease-relevant phenotypes.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct visualization of active site engagement.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by distinguishing active from inactive enzyme pools in complex lysates.
- Operational Value: Accelerates target triage by profiling multiple deubiquitinating enzymes in a single assay format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized lysate systems for downstream compound screening against deubiquitinating enzyme activity.
- Operational Value: Generates quantitative, reproducible activity readouts compatible with Western blot detection platforms.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by using active site-directed probes that report functional enzyme states.
- Operational Value: Enables scalable evaluation of compound effects on enzyme activity across multiple targets simultaneously.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase activity measurements to preclinical validation through disease-relevant cell line comparisons.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying conserved activity patterns across models.
- Scientific Value: Aligns with translational biomarker strategies by monitoring enzyme activity as a functional readout of pathway modulation.
- Operational Value: Provides mechanistic de-risking data that informs target selection for IND-enabling studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, enabling activity-based screening and validation cascades.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing differential enzyme activity between disease and control models.
- Screening: Delivers assay-ready lysates with quantifiable activity outputs for compound library evaluation.
- Analytics: Generates chemiluminescent signal intensities that enable comparative analysis of enzyme activity states.
- Translational Research: Connects early activity profiles to preclinical continuity through cross-model validation in neuronal and cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling deubiquitinating enzyme activity across diverse therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in target mechanism of action.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized probe-based labeling and lysis procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on measurable activity changes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, lysis optimization, and Western blot detection.
- Depends on access to hemagglutinin-derived active site probes and chemiluminescent imaging systems.
- Necessitates standardization of lysis buffer composition and protease inhibitor use across teams.
- Involves adaptation considerations for tissue samples versus cultured cells in probe accessibility.
- Limited by probe specificity and potential off-target labeling under suboptimal incubation conditions.
