Name: Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj metodę nieinwazyjnego obrazowania odpowiedzi immunologicznej u larw danio pręgowanego zakażonych Streptococcus iniae. Technika mikroinjekcji do pęcherzyka usznego umożliwia wizualizację interakcji patogen-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium za opiekę i utrzymanie danio pręgowanego. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 E. A. Harvie i NIH R01GM074827 dla Anny Huttenlocher.

<ol><li>Agnew, W., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+iniae%3A+An+aquatic+pathogen+of+global+veterinary+significance+and+a+challenging+candidate+for+reliable+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination.</a> Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).</li>
<li>Danilova, N., Steiner, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+develop+in+the+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">B cells develop in the zebrafish pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).</li>
<li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+a+gene+expression+profiling%2C+in+situ+hybridization+and+immunological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li>
<li>Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hematopoiesis+and+Developing+Lymphoid+Organs+in+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish.</a> Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).</li>
<li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).</li>
<li>Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus-Zebrafish+Model+of+Bacterial+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis.</a> Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).</li>
<li>Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+gene+family+and+TIR-domain+adapters+in+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio.</a> Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).</li>
<li>Meijer, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+Toll-like+receptor+and+TIR+domain+adaptor+families+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+immunol%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish.</a> Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).</li>
<li>Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Complement+Factor+B-Like+cDNA+clone+from+the+Zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+immunol%22%5BJournal%5D)">A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio).</a> Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).</li>
<li>Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+respiratory+burst+assay+using+zebrafish+kidneys+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos.</a> J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).</li>
<li>Yoo, S. K., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+photolabeling+of+neutrophil+trafficking+during+inflammation+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).</li>
<li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Screen+for+Tuberculosis+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16779(2011).</li>
<li>Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Optimization+of+a+High+Throughput+Setup+to+Study+Staphylococcus+epidermidis+and+Mycobacterium+marinum+Infection+as+a+Model+for+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signaling+mechanisms+mediate+neutrophil+attraction+to+bacterial+infection+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury.</a> Cell. Microbiol. , (2012).</li>
<li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+Inhibits+Neutrophil+Recruitment+during+the+Early+Stages+of+Streptococcus+pyogenes+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVolhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate%2C+migrate%2C+produce+melanin%2C+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).</li>
<li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li>
<li>Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Zebrafish+to+Probe+the+Divergent+Virulence+Potentials+and+Toxin+Requirements+of+Extraintestinal+Pathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathog. 5 (12), e1000697(2009).</li>
<li>Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immune+Response+to+Streptococcus+iniae+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae.</a> Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).</li>
<li>Haddon, C., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Ear+Development+in+the+Embryo+of+the+Zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio.</a> J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).</li>
<li>Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish inner ear.</a> Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), (2009).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zastosowana tutaj metoda infekcji jest przydatna do badania odpowiedzi immunologicznej gospodarza na początkowo zlokalizowaną infekcję w zarodkach i larwach 2-3 dpf. Ognisko bodźca zapalnego, takiego jak infekcja, w zamkniętej jamie, takiej jak pęcherzyk uszny, pozwala na badanie chemotaksji neutrofili i makrofagów oraz fagocytozy. Jednym z zastrzeżeń związanych z wstrzykiwaniem bakterii do pęcherzyka usznego jest to, że zdolność neutrofili do skutecznego fagocytozy bakterii w jamach wypełnionych płynem może zależeć od k...

Streptococcus iniae jest głównym patogenem wodnym, który jest zdolny do wywoływania chorób ogólnoustrojowych zarówno u ryb, jak i u ludzi1. Chociaż S. iniae jest odpowiedzialny za duże straty w przemyśle akwakultury, jest również potencjalnym patogenem odzwierzęcym, zdolnym do wywoływania chorób u gospodarzy z obniżoną odpornością z patologiami klinicznymi podobnymi do tych wywoływanych przez inne paciorkowcowe patogeny ludzkie. Biorąc pod uwagę podobieństwa do patogenów ludzkich, ważne jest badanie patogenezy choroby S. iniae w kontekście naturalnego gospodarza. Model zakażenia S. iniae u dorosłego ryba danio pręgowanego wykazał silną infiltrację leukocytów gospodarza do zlokalizowanego miejsca infekcji, a także szybki czas do śmierci gospodarza, czas zbyt krótki, aby zaangażować adaptacyjny układ odpornościowy7. Aby uzyskać dogłębne spojrzenie na wrodzoną odpowiedź immunologiczną na zakażenie S. iniae in vivo, konieczne jest użycie modelu, który jest bardziej podatny na nieinwazyjne obrazowanie na żywo.
Larwa danio pręgowanego ma szereg zalet, które czynią go coraz bardziej atrakcyjnym modelem kręgowców do badania interakcji gospodarz-patogen. Danio pręgowany jest stosunkowo niedrogi i łatwy w użyciu i utrzymaniu w porównaniu z modelami ssaków. Odporność adaptacyjna nie jest funkcjonalnie dojrzała do 4-6 tygodni po zapłodnieniu, ale larwy mają wysoce konserwatywny wrodzony układ odpornościowy kręgowców z dopełniaczem, receptorami Toll-podobnymi, cytokinami oraz neutrofilami i makrofagami o zdolnościach przeciwdrobnoustrojowych, w tym fagocytozie i wybuchu oddechowym2-6,8-11. Ponadto podatność genetyczna i przezroczystość optyczna embrionalnych i larwalnych etapów rozwoju pozwalają na generowanie stabilnych linii transgenicznych z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami odpornościowymi, co umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen w czasie rzeczywistym in vivo. Generowanie tych linii transgenicznych przy użyciu fotokonwertowalnego białka, takiego jak Dendra2, pozwala na śledzenie pochodzenia i losu poszczególnych komórek gospodarza w trakcie infekcji12.
Podczas opracowywania modelu infekcji larw danio pręgowanego, wybrane miejsce mikroiniekcji określi, czy infekcja jest początkowo zlokalizowana, czy ogólnoustrojowa. Ogólnoustrojowe zakażenia krwi do żyły ogonowej lub przewodu Cuviera są najczęściej stosowane do badania patogenów mikrobiologicznych u danio pręgowanego i są przydatne do badania interakcji między komórkami gospodarza i drobnoustrojów, odpowiedzi cytokin i różnic w zjadliwości między szczepami patogenów. W przypadku wolniej rosnących mikroorganizmów wczesne wstrzyknięcie do woreczka żółtkowego zarodka w stadium 16-1000 komórek może być wykorzystane do wywołania infekcji ogólnoustrojowej13,14, przy czym optymalnym etapem rozwoju mikroiniekcji wolno rosnącego mikroorganizmu jest stadium od 16 do128 komórek 15. Jednak wstrzyknięcia wielu drobnoustrojów do woreczka żółtkowego na późniejszych etapach rozwoju gospodarza wydają się być śmiertelne dla gospodarza ze względu na bogate w składniki odżywcze środowisko dla drobnoustroju i brak naciekających leukocytów16-18.
Zlokalizowana infekcja zazwyczaj powoduje ukierunkowaną migrację leukocytów w kierunku miejsca infekcji, którą można łatwo określić ilościowo za pomocą nieinwazyjnego obrazowania. Ten rodzaj infekcji może pozwolić na rozbiór mechanizmów pośredniczących w migracji leukocytów, a także na zbadanie różnych zdolności migracyjnych i fagocytarnych różnych populacji leukocytów. Miejscowe infekcje są również przydatne przy badaniu różnic w zjadliwości między szczepami bakteryjnymi, a także przy badaniu mechanizmów inwazji drobnoustrojów, ponieważ fizyczne bariery gospodarza muszą zostać przekroczone, aby miejscowa infekcja stała się ogólnoustrojowa. Danio pręgowany jest zazwyczaj hodowany w temperaturze 25–31 °C19, ale może być również utrzymywany w temperaturach nawet 34–35 °C w celu badań inwazyjności niektórych patogenów u ludzi przy ścisłych wymaganiach temperaturowych dotyczących zjadliwości20,21.
Wiele różnych miejsc zostało wykorzystanych do wygenerowania początkowo zlokalizowanej infekcji bakteryjnej, w tym komora tylnomózgowia22, mięsień grzbietowy ogona18, jama osierdziowa23 i pęcherzyk uszny (ucho)5,16,24. Stwierdzono jednak, że wstrzyknięcie bakterii do mięśnia ogonowego może powodować uszkodzenie tkanek i stan zapalny niezależnie od bakterii, co może zniekształcić wyniki podczas badania odpowiedzi leukocytów13. Chociaż mniejsze uszkodzenia są związane z wstrzyknięciem do tyłomózgowia i chociaż początkowo jest ono pozbawione leukocytów w młodych zarodkach, komora tylnomózgowia stopniowo zyskuje więcej komórek odpornościowych w miarę zadomowienia się mikrogleju. Komora tylnomózgowia jest również trudniejszym miejscem do zobrazowania. Pęcherzyk uszny jest zamkniętą, pustą jamą bez bezpośredniego dostępu do układu krwionośnego25,26. Zwykle jest pozbawiony leukocytów, ale leukocyty mogą być rekrutowane do pęcherzyka usznego w odpowiedzi na bodźce zapalne, takie jak infekcja. Jest to również preferowane miejsce mikroiniekcji bakterii u danio pręgowanego w wieku 2-3 dni po zapłodnieniu (dpf) ze względu na łatwość obrazowania i wizualizację iniekcji. Dlatego wybraliśmy pęcherzyk uszny jako miejsce miejscowej infekcji bakteryjnej.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml probówka Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &frac12; in. igła</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Czerwone</td><td>sondy molekularne CellTracker, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A Jednorazowe</td><td></td></tr><tr><td>pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Luneta sekcyjna</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Drobna pęseta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Grzebień żelowy</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>Szerokość 4,2 mm, grubość 1,5 mm</td></tr><tr>Naczynia <td></td><td></td> ze<td>szklanym dnem</td><td>Wykonane na zamówienie poprzez wywiercenie otworu 16 - 18 mm w środku dna naczynia do hodowli tkankowej 35 mm i umieszczenie w otworze okrągłego szkiełka nakrywkowego #1 o średnicy 22 mm i uszczelnienie cienką warstwą kleju optycznego Norland Optical Adhesive 68 utwardzonego światłem UV.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o wysokiej temperaturze topnienia</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>z systemem</td><td></td>FV-1000</tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>System mikroiniekcji</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofometr Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Pepton proteazy</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli małych komórek</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne szklane kapilarne igły iniekcyjne</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Trikaine (3-aminobenzoesan etylu)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fluka Biochemika</td><td>Numer katalogowy 92144</td><td></td></tr></tbody></table>

nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Patogen wodny, Streptococcus iniae, jest odpowiedzialny za ponad 100 milionów dolarów rocznych strat dla przemysłu akwakultury i jest w stanie powodować choroby ogólnoustrojowe zarówno u ryb, jak i u ludzi. Lepsze zrozumienie patogenezy choroby S. iniae wymaga odpowiedniego systemu modelowego. Podatność genetyczna i przezroczystość optyczna wczesnych stadiów rozwojowych danio pręgowanego pozwalają na generowanie i nieinwazyjne obrazowanie linii transgenicznych z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami odpornościowymi. Adaptacyjny układ odpornościowy nie jest w pełni funkcjonalny do kilku tygodni po zapłodnieniu, ale larwy danio pręgowanego mają konserwatywny wrodzony układ odpornościowy kręgowców zarówno z neutrofilami, jak i makrofagami. W ten sposób wygenerowanie modelu infekcji larwalnej pozwala na badanie specyficznego wkładu odporności wrodzonej w kontrolowanie infekcji S. iniae.
Miejsce mikroiniekcji określi, czy infekcja jest ogólnoustrojowa, czy początkowo zlokalizowana. W tym miejscu przedstawiamy nasze protokoły iniekcji pęcherzyków usznych u danio pręgowanego w wieku 2-3 dni po zapłodnieniu, a także nasze techniki fluorescencyjnego obrazowania konfokalnego infekcji. Zlokalizowane miejsce infekcji pozwala na obserwację początkowej inwazji drobnoustrojów, rekrutacji komórek gospodarza i rozprzestrzeniania się infekcji. Nasze odkrycia wykorzystujące model larwalny danio pręgowanego zakażenia S. iniae wskazują, że danio pręgowany może być wykorzystany do zbadania różnych udziałów neutrofili i makrofagów gospodarza w zlokalizowanych infekcjach bakteryjnych. Ponadto opisujemy, w jaki sposób fotoznakowanie komórek odpornościowych może być wykorzystywane do śledzenia losu poszczególnych komórek gospodarza w trakcie infekcji.

Mikroiniekcja S. iniae do pęcherzyka słuchowego (Rycina 1 oraz Rycina 2) skutkuje początkowo zlokalizowaną odpowiedzią gospodarza. W przypadku prawidłowej iniekcji bakterie powinny być widoczne wyłącznie w pęcherzyku słuchowym, a nie w otaczających tkankach lub krwi. Można to zwizualizować podczas mikroiniekcji za pomocą barwnika czerwieni fenolowej (Rycina 1A). Alternatywnie, w przypadku iniekcji bakterii znakowanych, szybkie skanowanie zainfekowanych larw bezp...

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest mikroiniekcja larw danio pręgowanego patogenem bakteryjnym streptococcus IEA w celu prowadzenia nieinwazyjnych badań obrazowych odpowiedzi immunologicznej gospodarza na żywo. Jest to realizowane poprzez uprzednie napełnienie igły do mikroiniekcji zawiesiną bakteryjną i ułożenie znieczulonych larw danio pręgowanego na agarozowej formie do iniekcji. Następnie zawiesina bakteryjna jest mikroiniekcyjna do pęcherzyka słuchowego larw.Następnie wstrzyknięte larwy unieruchamia się w agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Na koniec komórki odpornościowe gospodarza są znakowane fotochemicznie w celu łatwiejszego śledzenia, a zakażenie jest obrazowane przy użyciu mikroskopu konfokalnego. W rezultacie mikroiniekcja Streptococcus IEA do pęcherzyka słuchowego oraz następujące po niej znakowanie fotochemiczne i mikroskopia konfokalna są wykorzystywane do badania odpowiedzi immunologicznej larw danio pręgowanego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie do żyły ogonowej, jest to, że wstrzykiwanie do pęcherzyka słuchowego generuje zlokalizowaną infekcję bakteryjną, co umożliwia nieinwazyjne obrazowanie inter

non-invasive-imaging-innate-immune-response-zebrafish-larval-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Nieinwazyjne obrazowanie odpowiedzi odpornościowej wrodzonej w modelu larw rybki zebrafish z infekcją Streptococcus iniae

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Źródło: Zhang, X., et al. Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne zarodków danio pręgowanego, którym wstrzyknięto Staphylococcus aureus, umożliwiając ilościowe określenie progresji infekcji i rozmieszczenia bakterii w celu oceny wpływu mikrosfer biomateriału na interakcje gospodarz-patogen in vivo.

 Obrazowanie fluorescencyjne infekcji bakteryjnej związanej z biomateriałem w zarodkach danio pręgowanego

Źródło: Zhang, X. i wsp., Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia model zarodka danio pręgowanego do badania infekcji związanych z wszczepionymi biomateriałami. Wstrzykiwanie Staphylococcus aureus mikrosferom polistyrenowym zwiększa przeżywalność bakterii, potwierdzając rolę wszczepionych materiałów w promowaniu infekcji.

Analiza in vivo zakażeń bakteryjnych związanych z implantami przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Ten film demonstruje śledzenie rekrutacji leukocytów za pomocą transgenicznych larw danio pręgowanego wykazujących ekspresję fotokonwertowalnego białka zielonej fluorescencji. Wstępne wstrzyknięcie bakterii znakowanych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym do pęcherzyka usznego i wywołanie fotokonwersji umożliwia obserwację migracji leukocytów, fagocytozy i dyspersji w organizmie, dostarczając cennych informacji na temat dynamiki odpowiedzi immunologicznej.

Śledzenie leukocytów w oparciu o fotokonwersję u transgenicznego danio pręgowanego zakażonego bakteriami

Wideo demonstruje technikę urządzenia do ranienia i uwięzienia danio pręgowanego do obserwacji fluorescencyjnie znakowanej infekcji patogenami grzybiczymi u larw danio pręgowanego. Początkowa infekcja przyciąga makrofagi, a gdy infekcja się utrzymuje, rekrutacja neutrofili postępuje w miejscu wstrzyknięcia.

Technika zWEDGI do wizualizacji larw danio pręgowanego zakażonych patogenami grzybiczymi

Wrodzona odpowiedź immunologiczna chroni organizmy przed infekcją patogenem. Krytyczny składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, pęknięcie oddechowe fagocytów, generuje reaktywne formy tlenu, które zabijają atakujące mikroorganizmy. Opisujemy test wyrzutu oddechowego, który określa ilościowo reaktywne formy tlenu wytwarzane, gdy wrodzona odpowiedź immunologiczna jest indukowana chemicznie.

Kwantyfikacja reakcji na impuls oddechowy jako wskaźnik wrodzonego zdrowia immunologicznego u danio pręgowanego

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Poznaj metodę nieinwazyjnego obrazowania odpowiedzi immunologicznej u larw danio pręgowanego zakażonych Streptococcus iniae. Technika mikroinjekcji do pęcherzyka usznego umożliwia wizualizację interakcji patogen-gospodarz.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów