Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest mikroiniekcja larw danio pręgowanego patogenem bakteryjnym streptococcus IEA w celu prowadzenia nieinwazyjnych badań obrazowych odpowiedzi immunologicznej gospodarza na żywo. Jest to realizowane poprzez uprzednie napełnienie igły do mikroiniekcji zawiesiną bakteryjną i ułożenie znieczulonych larw danio pręgowanego na agarozowej formie do iniekcji. Następnie zawiesina bakteryjna jest mikroiniekcyjna do pęcherzyka słuchowego larw.

Następnie wstrzyknięte larwy unieruchamia się w agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Na koniec komórki odpornościowe gospodarza są znakowane fotochemicznie w celu łatwiejszego śledzenia, a zakażenie jest obrazowane przy użyciu mikroskopu konfokalnego. W rezultacie mikroiniekcja Streptococcus IEA do pęcherzyka słuchowego oraz następujące po niej znakowanie fotochemiczne i mikroskopia konfokalna są wykorzystywane do badania odpowiedzi immunologicznej larw danio pręgowanego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie do żyły ogonowej, jest to, że wstrzykiwanie do pęcherzyka słuchowego generuje zlokalizowaną infekcję bakteryjną, co umożliwia nieinwazyjne obrazowanie interakcji między gospodarzem a patogenem w przezroczystej larwie danio pręgowanego. Aby rozpocząć, należy przygotować 1,5 do 2% roztwór agarozy o wysokiej temperaturze topnienia w medium E3 i podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż roztwór stanie się klarowny. Po ochłodzeniu wlać niewielką ilość agarozy do szalki Petriego, tak aby tylko zakryć dno naczynia, a następnie delikatnie zamieszać ruchem obrotowym.

Po zestaleniu się arosu, umieść na wierzchu wypłukany i wysuszony grzebień do żelu w taki sposób, aby jego lity koniec opierał się o krawędź szalki Petriego, a koniec z zębami dotykał arosu. Upewnij się, że grzebień jest ustawiony jak najbardziej poziomo, tworząc kąt 30 stopni względem dolnej warstwy arosu. Wlej dodatkową niewielką ilość arosu na styku grzebienia i dolnej warstwy arosu, tak aby świeża warstwa arosu zakryła zęby grzebienia.

Pozostaw do całkowitego ostygnięcia przed wyjęciem grzebienia. Następnie, używając końcówki pipety, usuń z dołków wszelkie wystające fragmenty agarozy. Wlej pożywkę E three na wierzch formy wtryskowej i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po przygotowaniu inokulum SNEA oraz larw zebrafish do iniekcji zgodnie z protokołem tekstowym, należy włączyć mikroinżektor i ustawić zakres czasu na milisekundy. Otwórz zawór zbiornika z dwutlenkiem węgla, aby dopuścić gaz do przewodu. Ciśnienie mikroinżektora powinno wynosić około 20 PSI. Wymieszaj wirówką przygotowaną kulturę SNEA w czerwieni fenolowej i PBS, a następnie za pomocą końcówki microlodera nabierz od 2 do 3 µL kultury do dociągniętej igły kapilarnej. Zamocuj napełnioną igłę w mikromanipulatorze połączonym z podstawą magnetyczną i ustaw ją pod mikroskopem stereoskopowym tak, aby igła znajdowała się pod kątem około 45 do 65 stopni względem podstawy mikroskopu.

Najpierw należy odłamać końcówkę igły za pomocą precyzyjnej pęsety, a następnie nacisnąć pedał mikroinkektora, aby wycisnąć kroplę inokulum na czubek igły. Należy użyć skali w okularze mikroskopu, aby zmierzyć średnicę kropli. Średnica kropli powinna wynosić około 0.10 millimeter, co odpowiada objętości około jednego nanoliter.

Aby dostosować rozmiar kropli, należy zmienić ustawienie czasu trwania w mikroinjektorze lub użyć precyzyjnej pęsety, aby odciąć większą część końcówki igły. Czas wstrzyknięcia powinien wynosić od 20 do 35 ms, aby uniknąć nadmiernego uszkodzenia tkanek. Następnie, używając plastikowej pipety transferowej, przenieś po jednej rybie do każdej z 12 studzienek formy do iniekcji.

Następnie za pomocą szklanej rurki, pętli z włosia lub plastikowej końcówki delikatnie ustaw larwy tak, aby ich głowy były skierowane w stronę tyłu mikroskopu, a pęcherzyki żółtkowe przylegały do lewej strony dołka. Skieruj lewe ucho larwy ku górze. Gdy larwy będą gotowe do iniekcji, użyj pokręteł mikromanipulatora, aby ustawić załadowaną igłę w linii z pęcherzykiem słuchowym, tak aby oba elementy znajdowały się w tym samym polu widzenia.

Końcówką igły przebij zewnętrzną warstwę nabłonkową pęcherzyka słuchowego tak, aby końcówka znajdowała się tuż wewnątrz pęcherzyka. Następnie, stosując dostatecznie niskie ciśnienie, aby nie przerwać jamistego wnętrza, naciśnij pedał, aby wstrzyknąć jeden nanolitr pożądanej dawki SNEA. Jeśli wtryskiwanie przebiegło pomyślnie, pęcherzyk słuchowy, a nie tkanka otaczająca, powinien wypełnić się inokulum z czerwieni fenolowej.

Ostrożnie wycofaj igłę z larwy, a następnie, przy pięciokrotnym powiększeniu, przesuń ręcznie płytkę do iniekcji tak, aby larwa była widoczna. W przypadku wstrzykiwania bakterii znakowanych fluorescencyjnie pod mikroskopem fluorescencyjnym, dokonaj wizualnej oceny wstrzykniętych larw i zachowaj tylko te, w których depozycja bakterii nastąpiła wyłącznie wewnątrz pęcherzyka słuchowego, aby zapewnić stałą objętość iniekcji w trakcie trwania eksperymentu. Po wstrzyknięciu każdego 48. embrionu, wstrzyknij kroplę zawiesiny bakteryjnej do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml zawierającej 100 µL sterylnego PBS.

Następnie 100 µL wysieje się na płytki THY z dodatkiem P auger i inkubuje przy 37 °C przez noc. Aby wyznaczyć liczbę CFU w objętości wstrzykniętej, po wstrzyknięciu preparatu do całej grupy 12 larw na rampie iniekcyjnej, należy ostrożnie przenieść larwy z dołków do nowej szalki Petriego za pomocą plastikowej pipety transferowej. Roztwór trica należy usunąć i zastąpić około 2 mL świeżego medium E3, aby umożliwić larwom regenerację.

Inkubować embriony zgodnie z protokołem tekstowym. Po przygotowaniu roztworu aro z trica, zgodnie z protokołem tekstowym na stole mikroskopu stereoskopowego, za pomocą pipety transferowej przenieść od czterech do pięciu znieczulonych larw do szalki z szklanym dnem. Wyjąć roztwór trica i aro z łaźni wodnej o temperaturze 55 °C i pozostawić do ochłodzenia w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch minut.

W międzyczasie należy usunąć z znieczulonych larw jak najwięcej cieczy. Następnie wlej schłodzony agar do szalki, aż zostanie pokryta w około połowie powierzchni. Po tym zakręć szalką, aby rozprowadzić agar.

Należy zebrać larwy, które wypłynęły do brzegów szalki, i za pomocą pipety przenieść je z powrotem na środek. Następnie, korzystając ze stereomikroskopu i długiego końcówki do pipety, należy delikatnie ułożyć larwy w pozycji pożądanej do obrazowania. W przypadku obrazowania pęcherzyka słuchowego należy ułożyć larwy tak, aby prawy pęcherzyk słuchowy był skierowany ku górze, a lewy pęcherzyk słuchowy przylegał płasko do dna szalki.

Pozostawć agar do ostygnięcia przez około 10 minut przed przeniesieniem szalki. Następnie delikatnie nanieś pipetą niewielką ilość roztworu TRIS i E3 na wierzch warstwy agaru, aby utrzymać jej wilgotność. W celu wizualizacji próbek należy użyć skanera Zeiss z laserami 488 nm i 543 nm.

Użyj ciągłego skanowania liniowego, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora. Upewnij się, że w oknie sterowania akwizycją obrazu nie występuje przypadkowa fotokonwersja fluorescencji czerwonej. W ustawieniach stymulacji (stimulus setting) zaznacz opcję use scanner tool, wybierz main, wybierz laser 405 nanometrów i ustaw jego moc na 70%.

Następnie, korzystając z opcji koła, zdefiniuj obszar zainteresowania (region of interest) w pęcherzyku odic; w ustawieniu startu stymulacji wybierz aktywację szeregową z preaktywacją trwającą jedną klatkę i czasem aktywacji wynoszącym 60 000 milisekund w oknie ustawień akwizycji. W sekcji skanowania czasowego wybierz dwa przedziały po jednej minucie każdy – jeden dla etapu przed konwersją fotochemiczną i jeden dla etapu po konwersji. Uruchom serię time-lapse, aby rozpocząć konwersję fotochemiczną zdefiniowanego obszaru zainteresowania.

Na koniec przeskanuj próbkę za pomocą urządzenia Zack, używając laserów o długości fali 488 i 543 nanometrów. Aby zwizualizować fotokonwertowaną fluorescencję czerwoną, a także wszelką pozostałą fluorescencję zieloną, wykonuje się mikroiniekcję SNEA w czerwieni fenolowej do pęcherzyka słuchowego; skutkuje to początkowo zlokalizowaną odpowiedzią gospodarza, która przy prawidłowym wstrzyknięciu powinna być widoczna wyłącznie w pęcherzyku słuchowym, a nie w otaczających tkankach lub krwi. Alternatywnie, w przypadku wstrzyknięcia znakowanych bakterii, szybkie skanowanie zainfekowanych larw bezpośrednio po iniekcji może potwierdzić, że bakterie znajdują się tylko w pęcherzyku słuchowym, a nie w otaczających tkankach.

Miejsca mikroiniekcji początkowo zlokalizowanej infekcji są przydatne do badania chemotaksji leukocytów, jak pokazano tutaj. Rekrutację leukocytów można ilościowo określić za pomocą barwienia ziarnistości neutrofili czernią Sudana lub poprzez utrwalenie formaldehydem fluorescencyjnych linii transgenicznych przy użyciu transgenicznych linii danio pręgowanego wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Dendra two, specyficznie w makrofagach lub neutrofilach, wykazało, że wstrzyknięcie NEA do pęcherzyka słuchowego wywołało rekrutację neutrofili i makrofagów oraz fagocytozę bakterii w ciągu 60 minut po infekcji.

Na tym rysunku dwa znakowane makrofagi DRA, które zostały zrekrutowane do pęcherzyka słuchowego w piątej godzinie po infekcji, poddano fotokonwersji, a następnie śledzono przez kolejne 24 godziny. Chociaż niektóre fotokonwertowane komórki pozostają w pęcherzyku słuchowym lub regionie głowy, część z nich została również znaleziona w rozproszeniu w całym ciele larw, co widać tutaj. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mikroiniekcyjnie wprowadzić streptococcus n EEA do pęcherzyka słuchowego Danio rerio w trzeciej dobie po zapłodnieniu.

Obejmuje to: po pierwsze, ustawienie znieczulonych larw na formie do iniekcji i nabranie do igły inokulum bakteryjnego; po drugie, mikroiniekcję bakterii do pęcherzyka słuchowego; po trzecie, osadzenie zainfekowanych larw w niskotopliwym agarozie; oraz po czwarte, wykorzystanie mikroskopu konfokalnego do znakowania leukocytów gospodarza i obrazowania interakcji leukocytów z patogenem in vivo.