Name: Test inwazji serca piskląt do badania inwazyjności komórek rakowych i aktywności potencjalnie przeciwinwazyjnych związków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę hodowli organowej do badania inwazji komórek nowotworowych w trzech wymiarach przy użyciu fragmentów serca piskląt. Technika ta umożliwia testowanie związków przeciwinwazyjnych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marleen De Meulemeester za zademonstrowanie techniki testowej w filmie wideo. B. I. R. jest doktorantem Fundacji Badawczej – Flandria (FWO – Vlaanderen). L.M.M. jest stypendystką Emmanuela van der Schuerena od Flamandzkiej Ligi Walki z Rakiem (Vlaamse Liga tegen Kanker).

<ol><li>Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMareel%2C+MM+%22Encyclopedia+of+Cancer%22">Encyclopedia of Cancer</a>. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).</li>
<li>Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+study+of+the+invasion+of+malignant+C3H+mouse+fibroblasts+into+embryonic+chick+heart+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch.+B.+Cell+Pathol.+Incl.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro.</a> Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%98chemoinvasion%E2%80%99+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
<li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+and+spheroid+collagen+type+I+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single cell and spheroid collagen type I invasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).</li>
<li>Wolff, E., Schneider, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+transplantation+prolong%C3%A9e+d%E2%80%99un+sarcome+de+souris+sur+des+organes+embryonnaires+de+poulet+cultiv%C3%A9s+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22C.R.+Seances+Soc.+Biol.+Fil%22%5BJournal%5D)">La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro.</a> C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).</li>
<li>Easty, G. C., Easty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organ+culture+system+for+the+examination+of+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An organ culture system for the examination of tumor invasion.</a> Nature. 199, 1104-1105 (1963).</li>
<li>Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+invasive+growth+in+vitro.+Human+decidua+graviditatis+confronted+with+established+human+cell+lines+and+primary+human+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants.</a> J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).</li>
<li>Sys, G. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+In+ovo+CAM-assay+as+a+Xenograftodel+for+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma.</a> J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+modulates+both+invasion+and+plasma+membrane+ruffling+of+MCF-7+human+mammary+carcinoma+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro.</a> Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).</li>
<li>Vermeulen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+the+noninvasive+to+the+invasive+phenotype+and+loss+of+alpha-catenin+in+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells.</a> Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).</li>
<li>Parmar, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-invasive+activity+of+3%2C7-dimethoxyflavone+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharma.+Sci%22%5BJournal%5D)">Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro.</a> J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).</li>
<li>Parmar, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-invasive+activity+of+alkaloids+and+polyphenolics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro.</a> Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).</li>
<li>Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaillard%2C+PJ+%22Methods+in+Medical+Research%22">Methods in Medical Research</a>. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).</li>
<li>Romeis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+mikrotom%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopische+Technik.+15+Verb.+Aufl.+Kapitel%22%5BJournal%5D)">Das mikrotom.</a> Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, München: Leibniz. 114-120 (1948).</li>
<li>Van Marck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-cadherin+promotes+cell-cell+adhesion+and+counteracts+invasion+in+human+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma.</a> Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).</li>
<li>Attia, M. A., Weiss, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+spontaneous+mammary+carcinomas+in+mice.+V.+Acquired+tumor+resistance+and+enhancement+in+strain+A+mice+infected+with+mammary+tumor+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus.</a> Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).</li>
<li>Katritzky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QSAR+modeling+of+anti-invasive+activity+of+organic+compounds+using+structural+descriptors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors.</a> Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).</li>
<li>McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+in+vitro+by+explants+of+Lucke+renal+carcinoma+cocultered+with+normal+tissue+is+temperature+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent.</a> Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).</li>
<li>Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+hyperplastic+nodule+cells+from+diethylnitrosamine+treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells.</a> Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).</li>
<li>Mareel, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+invasion+of+MO4+mouse+fibrosarcoma+cells+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture.</a> Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).</li>
<li>Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+culture+of+the+central+nervous+system%3A+recent+developments+and+current+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications.</a> Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).</li>
<li>Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+invasiveness+of+human+bladder+cancer+from+cell+lines+and+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens.</a> Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).</li>
<li>Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+study+of+embryonic+chick+heart+invaded+by+malignant+cells+in+three+dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invasion+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture.</a> Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).</li>
<li>Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+cell+interactions+with+fetal+rat+brain+aggregates+in+vitro+and+with+brain+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo.</a> Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).</li>
<li>Bracke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confrontation+of+an+invasive+%28MO4%29+and+a+non-invasive+%28MDCK%29+cell+line+with+embryonic+chick+heart+fragments+in+serum-free+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).</li>
<li>Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMareel%2C+MM+%22Cancer+Campaign.+9%3A+The+Cancer+Patient%22">Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient</a>. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).</li>
<li>De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+analysis+system+for+the+quantification+of+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metast%22%5BJournal%5D)">An image analysis system for the quantification of invasion in vitro.</a> Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).</li>
<li>Smolle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+melanoma+cell+invasion+in+three-dimensional+confrontation+cultures+in+vitro+using+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis.</a> J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).</li>
<li>Bracke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((flavonoid+effect+on+tumor+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Technol%22%5BJournal%5D)">flavonoid effect on tumor invasion and metastasis.</a> Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).</li>
<li>Bracke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+tangeretin+on+tamoxifen%E2%80%99s+therapeutic+benefit+in+mammary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podczas przygotowywania PHF fragmenty nie mogą pozostawać w zawiesinie, ale przylegać do ścianki naczynia; Można temu zaradzić, zwiększając objętość pożywki hodowlanej. Jeśli liczba PHF jest zbyt mała, a ich rozmiar jest zbyt duży, należy zmniejszyć objętość pożywki. Niepowodzenie agregacji komórek testowych może być spowodowane wahaniami temperatury lub infekcją mikrobiologiczną. Alternatywnie, niezdolność do agregacji może być nieodłączną cechą komórek. Podczas przyłączania agregatów do PHF, słaba przyczepność może zos...

Inwazja jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Aktywność ta nie tylko prowadzi do zniszczenia otaczających tkanek, ale jest również zaangażowana w tworzenie przerzutów. Ponieważ pacjenci z rakiem umierają z powodu inwazji i przerzutów, a skuteczne leczenie przeciwinwazyjne jest nadal rzadkie, opracowano testy laboratoryjne, które naśladują inwazję komórek nowotworowych. Celem testu na sercu piskląt jest zaoferowanie odpowiedniej metody hodowli narządów do badania inwazji guza w trzech wymiarach. Test pozwala na rozróżnienie komórek inwazyjnych i nieinwazyjnych oraz pozwala na badanie wpływu badanych związków na inwazję guza.
Uzasadnieniem dla użycia testu jest sama koncepcja, że nowotwory są ekosystemami, w których komórki nowotworowe nieustannie oddziałują ze swoim zrębem (komórki gospodarza i macierz zewnątrzkomórkowa), i że poprzez te interakcje molekularne inwazja jest precyzyjnie dostrojona1. Tak więc w teście komórki nowotworowe są konfrontowane z żywymi embrionalnymi fragmentami serca piskląt2, które służą nie tylko jako substraty do inwazji komórek nowotworowych, ale także jako źródło różnych typów komórek zrębu i elementów macierzy. Serce pisklęcia zawiera miocyty, fibroblasty i komórki śródbłonka, a macierz zewnątrzkomórkowa składa się z lamininy, fibronektyny i różnych rodzajów kolagenu. W ten sposób technika trójwymiarowej hodowli narządów obejmuje wiele interakcji komórkowych i molekularnych związanych z inwazją nowotworów pacjentów.
Główną zaletą testu na sercu piskląt jest implementacja efektów zrębu. Ten aspekt jest bardziej kompletny niż w innych testach inwazji in vitro, które opierają się na inwazji komórek nowotworowych do nieożywionych żeli składających się z cząsteczek błony podstawnej3 lub macierzy śródmiąższowej4. Koncepcja konfrontacji między komórkami nowotworowymi a normalną żywą tkanką gospodarza, jak stwierdzono w eksperymentach z hodowlą narządów, została wprowadzona przez kilku autorów, w tym Wolffa i Schneidera we Francji5, Easty i Easty w Wielkiej Brytanii6 oraz Schleicha w Niemczech7. Dwie techniczne zalety testu inwazji serca pisklęcia w porównaniu z cytowanymi metodami polegają na tym, że objętość fragmentów można łatwo znormalizować i że pozostają one kurczliwe, co umożliwia monitorowanie integralności funkcjonalnej podczas hodowli narządów. Ponadto preferowane są zarodki ptaków, ponieważ można je łatwo wyciąć ze sterylnej zawartości jaja. Test ma koncepcyjne podobieństwo do testu błonowego kosmówkowo-omoczniowegopiskląt 8, oferując złożone otoczenie zrębu komórek nowotworowych.
Test został z powodzeniem zastosowany do rozróżnienia między inwazyjnymi i nieinwazyjnymi wariantami komórek z tych samych ludzkich nowotworów, takich jak w rodzinach komórkowych MCF-7 (sutek)9 i HCT-8 (okrężnica)10. Technika ta jest również przydatna do testowania potencjalnie nieinwazyjnych związków11,12. Jak wyjaśniono dalej, można go wykorzystać do ustalenia relacji struktura-aktywność małych cząsteczek organicznych. Test nie uwzględnia jednak udziału komórek immunologicznych w inwazji raka. Należy podkreślić, że technika ta nie może być uważana za wysokoprzepustowy system analizy ze względu na dużą liczbę manipulacji, ograniczoną liczbę testów (maksymalnie 30 kultur) i długi czas realizacji (około 1 miesiąca).

<table><tbody><tr><td>Roztwór soli Ringera</td><td>Braun</td><td>CEO123</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroksymetylo)-aminometaan Analar</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>BSA : albumina z surowicy bydlęcej, frakt cohna V.</td><td>Sigma</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Rega 3</td><td>Technologie życia&nbsp;</td><td></td><td></td>19993013</tr><tr><td>Wytrząsarki żyroskopowe</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G10 i G33</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera 50 ml</td><td>Novolab</td><td>92717</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego</td><td>Novolab</td><td>68516</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irydektomii</td><td>Rumex</td><td>11-0625</td><td></td></tr><tr><td>Makroskop ze skalibrowaną siatką okularową</td><td>Dziki</td><td>157702</td><td></td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>Międzynarodowe produkty medyczne</td><td>8599956</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>230251-25g</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Harrisa</td><td>Sigma</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>Żywica krystaliczna (Tissue-Tek)</td><td>Sakura</td><td>4494</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do topienia parafiny</td><td>GFL</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom do sekcji parafiny</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stppery do kolb Erlemeyera z wlotem i wylotem gazu</td><td>Novolab</td><td>2602421 i 260243</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzydyna</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>Stół bujany REAX</td><td>Heidolph</td><td>54131</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynia na chusteczki</td><td>VWR</td><td>NUNC142475</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka do enukleacji okulistycznej</td><td>Rumex</td><td>16-060</td><td></td></tr><tr><td>Ostre kleszcze</td><td>Rumex</td><td>4-111T</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Nickel-Electro LTD</td><td>7112</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera 5 ml</td><td>Novolab</td><td>211901</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe umyte i odtłuszczone</td><td>Międzynarodowe produkty medyczne</td><td>8613908</td><td></td></tr></tbody></table>

test inwazji serca piskląt do badania inwazyjności komórek rakowych i aktywności potencjalnie przeciwinwazyjnych związków

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

Celem testu na sercu piskląt jest zaoferowanie odpowiedniej metody hodowli narządów do badania inwazji guza w trzech wymiarach. Test może rozróżniać komórki inwazyjne i nieinwazyjne oraz umożliwia badanie wpływu badanych związków na inwazję guza. Komórki nowotworowe - zarówno w postaci agregatów, jak i pojedynczych komórek - konfrontowane są z fragmentami embrionalnego serca pisklęcia. Po posiewie narządów w zawiesinie przez kilka dni lub tygodni, konfrontujące się kultury są utrwalane i zatopiane w parafinie w celu analizy histologicznej. Trójwymiarowa interakcja między komórkami rakowymi a normalną tkanką jest następnie rekonstruowana na podstawie seryjnych odcinków wybarwionych hematoksyliną-eozyną lub po barwieniu immunohistochemicznym w poszukiwaniu epitopów w tkance serca lub konfrontujących się komórkach rakowych. Test jest zgodny z najnowszą koncepcją, że inwazja raka jest wynikiem interakcji molekularnych między komórkami rakowymi a sąsiednimi elementami gospodarza zrębu (miofibroblastami, komórkami śródbłonka, składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej itp.). W tym przypadku to środowisko zrębu jest oferowane komórkom rakowym jako żywy fragment tkanki. Na korzyść znaczenia testu przemawia wiele aspektów. Inwazja w teście jest zgodna z kryteriami inwazji raka: postępujące zajęcie i zastąpienie w czasie i przestrzeni tkanki gospodarza oraz inwazyjność i nieinwazyjność in vivo konfrontujących się komórek na ogół koreluje z wynikiem testu. Ponadto wzorzec inwazji komórek in vivo, zdefiniowany przez patologów, znajduje odzwierciedlenie w obrazach histologicznych w teście. Ilościowa analiza zależności struktura-aktywność (QSAR) wyników uzyskanych z licznymi potencjalnie antyinwazyjnymi organicznymi związkami kongenerowymi pozwoliła na zbadanie zależności struktura-aktywność flawonoidów i chalkonów, a znane leki przeciwprzerzutowe stosowane w klinice (np. inhibitory mikrotubul) również hamują inwazję w teście. Jednak test nie uwzględnia wkładu immunologicznego w inwazję raka.

Przekroje histologiczne przedstawione na Ryc. 5 ukazują końcowy wynik szeregu udanych analiz. Prawidłowa histologia kultur wskazuje na żywotność komórek i pozwala na interpretację interakcji między komórkami nowotworowymi a tkanką prawidłową. Ponadto nie stwierdzono reakcji immunologicznej tkanki prawidłowej, co potwierdza odpowiedni wiek wykorzystanych embrionów kurcząt, np. przed wykształceniem się układu odrzutów immunologicznych. Nie widocznych jest bakterii, co wskazuje na brak (makroskopijnego) zanieczys...

Tutaj prezentujemy protokół do badania inwazji komórek nowotworowych na żywe normalne fragmenty tkanek w trzech wymiarach. Ta technika hodowli narządowej jest stosowana głównie do testowania potencjalnie przeciwinwazyjnych leków in vitro.

Test inwazji serca piskląt do badania inwazyjności komórek rakowych i aktywności potencjalnie przeciwinwazyjnych związków

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie odpowiedniej metody hodowli organów do badania inwazji nowotworowej w trzech wymiarach. Zostaje to osiągnięte poprzez przygotowanie w pierwszym kroku fragmentów tkanki prawidłowej pobranych z embrionalnych serc kurzych. W drugim kroku przygotowuje się agregaty komórek nowotworowych w zawiesinie.Następnie agregaty komórek nowotworowych są indywidualnie zestawiane z fragmentami prawidłowej tkanki na półstałym podłożu agarowym w celu inkubacji w kulturze zawiesinowej. W ostatnim kroku zestawione kultury są utrwalane do zatopienia w parafinie i wykonania przekrojów histologicznych. Ostatecznie inwazję komórek nowotworowych do fragmentów tkanki można zwizualizować poprzez seryjną analizę mikroskopową przekrojów tkankowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy inwazji z użyciem żeli, jest fakt, że w tej metodzie komórki nowotworowe konfrontowane są z trójwymiarowymi fragmentami żywej tkanki. Implikacje tej techniki obejmują terapię nowotworów, ponieważ istnieje niezaspokojona potrzeba opracowania leków przeciwinwazyjnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, co wynika z ignorowania znaczenia stosowania określonych wymiarów fragmentu tkanki oraz agregatów komórek nowotworowych.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat inwazji nowotworowej, można ją zastosować również do innych układów. Na przykład do badania inwazji tkanek obwodowych przez komórki zapalne lub integracji komórek macierzystych z tkanką serca. W celu uzyskania hodowli fragmentów serca kurczaka, proces rozpoczyna się od inkubacji zapłodnionego jaja w temperaturze 37 °C przez dziewięć dni.Dziewiątego dnia zdezynfekuj skorupkę 70% etanolem. Następnie w komorze do hodowli tkankowej użyj tępych pęsety, aby otworzyć skorupkę. Następnie umieść łyżeczkę do enukleacji wokół szyi embrionu i wyciągnij embrion ze skorupki.Umieść embrion w szklanej szalce Petriego o średnicy pięciu centymetrów zawierającej pięć mililitrów roztworu soli Ringera. Następnie, trzymając w każdej dłoni ostre pęsety, rozetnij skórę brzuszną klatki piersiowej, usuń mostek i za pomocą nożyczek do irydektomii wypreparuj serce, odcinając jego główne naczynia krwionośne.Przenieś serce do nowej szklanej szalki Petriego o średnicy 5 cm zawierającej 5 mL pożywki hodowlanej uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej. Pod mikroskopem z skalibrowaną siatką okularową, używając nożyczek do mikrodyssekcji, wyresektuj górną, czaszkową jedną trzecią serca, aby usunąć przedsionki i powiązane z nimi naczynia.Następnie za pomocą ostrych pęset odseparuj osierdzie od komór. Kolejnym krokiem jest wykonanie półprzecięcia strzałkowego komór i usunięcie krwi. Następnie przenieś komory do innej szalki Petriego o średnicy pięciu centymetrów zawierającej 5 ml świeżej pożywki hodowlanej i płodowej surowicy bydlęcej, a tkankę potnij na fragmenty o średnicy 0,4 mm.Po wycięciu wszystkich komór, delikatnie obróć szalkę, aby przesunąć wszystkie fragmenty w stronę jej środka. Następnie za pomocą igły ze stali nierdzewnej przesuń wszystkie fragmenty Cora Eliana w stronę obrzeża szalki Petriego. Teraz użyj szklanej pipety Pasteura, aby przenieść fragmenty serca do kolby Erlenmeyera o pojemności 50 mililitrów pokrytej cienką warstwą pożywki.Wypełnij kolbę gazem zawierającym 5%carbon dioxide i inkubuj fragmenty na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 degrees Celsius przy 70 revolutions per minute przez 24 hours. Następnego dnia przenieś fragmenty do szalki Petriego i za pomocą igły usuń Corporal Eliana, ciemne fragmenty nekrotyczne oraz wszelkie konglomeraty tkankowe. Inkubuj fragmenty w 50 milliliter kolbie Erlenmeyera zawierającej sześć milliliters pożywki hodowlanej na wytrząsarce orbitalnej przez kolejne 60 hours; dwa i pół dnia później, przy użyciu mikroskopu i igieł, wybierz sterydalne fragmenty wykazujące cienką, jednorodną warstwę komórek fibroblastycznych i średnicę 0.4 millimeters.Następnie przenieść wstępnie hodowane fragmenty serca do innej szalki Petriego zawierającej świeżą pożywkę hodowlaną. Na trzy dni przed rozpoczęciem hodowli konfrontacyjnej zawiesić 100 000 komórek testowych na mililitr w sześciu mililitrach odpowiedniej pożywki hodowlanej w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 mililitrów. Następnie inkubować kolbę na inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy 70 obr./min i odpowiednim stężeniu dwutlenku węgla.Po 72 godzinach obejrzeć agregaty pod mikroskopem i wybrać steroidowe agregaty komórkowe o średnicy 0,2 mm. Następnie przenieść osiem wstępnie hodowanych fragmentów serca o wielkości 0,4 mm, zawieszonych w minimalnej ilości pożywki hodowlanej, na szkiełko zegarkowe do badań embriologicznych zawierające półstałą pożywkę agarową.Przenieś fragmenty do okręgu i użyj małego kawałka papieru filtracyjnego, aby odessać nadmiar pożywki. Umieść 10 steroidowych agregatów komórkowych o rozmiarze 0,2 mm w okręgu. Po usunięciu nadmiaru pożywki przesuń jeden agregat w stronę każdego z uprzednio hodowanych fragmentów serca, aż wejdą one ze sobą w kontakt.Następnie uszczelnić pokrywkę szalki zegarowej parafiną i inkubować kokulturę w temperaturze 37 °C przez okres od 4 do 24 godzin, w zależności od właściwości adhezyjnych komórek testowych do uprzednio hodowanych fragmentów serca. Po zakończeniu inkubacji zanurzyć konfrontujące pary w podgrzanym do 37 °C medium hodowlanym, a następnie za pomocą pipety Pasteura przenieść każdą parę do oddzielnych kolb Erlenmeyera o pojemności 5 ml, zawierających każda po 1,5 ml medium hodowlanego. Następnie inkubować kolby na wytrząsarce w temperaturze 37 °C i przy 120 obr./min, przepuszczając odpowiednie stężenie carbon dioxide. Przygotować dwie dodatkowe kolby Erlenmeyera o pojemności 5 ml wypełnione 2 ml roztworu soli Ringera do analizy histologicznej konfrontacji.Po zakończeniu okresu inkubacji przenieść kultury do roztworu soli Ringera na kilka sekund w celu usunięcia białek surowicy. Następnie przenieść gruszki do oddzielnych szalek Petriego o średnicy trzech centymetrów zawierających trzy mililitry roztworu Bowena-Hollanda. Po dwóch godzinach trzykrotnie wypłukać kultury w trzech mililitrach wody zdemineralizowanej, a następnie inkubować je w wodzie z kranu przez dwie godziny, aby usunąć jak największą ilość roztworu utrwalającego.Na koniec przenieś pary do 3 mL 70% etanolu każdą i przechowuj przez maksymalnie kilka dni. Na tych obrazach udanych kultur nie obserwuje się żadnej reakcji immunologicznej tkanki prawidłowej ani w tkance nowotworowej, ani w tkance serca, co potwierdza, że embriony kurcząt zostały wykorzystane przed rozwojem układu odrzucania immunologicznego. Nie są również widoczne bakterie, co wskazuje na brak grubego zanieczyszczenia w okresie hodowli.Ponadto zaokrąglony obrys przekrojów potwierdza, że hodowle znajdowały się w zawiesinie, bez oznak tymczasowego przylegania do ścianek kolby Erlenmeyera. W tym teście inwazji serca kurczaka przetestowano wiele związków. W przypadku związków o pokrewnym budowie strukturalnej ustalono ilościową zależność struktura-aktywność na podstawie wyników testu, a uzyskane dane wykazały wyraźną korelację między przewidywaną a eksperymentalną aktywnością przeciwinwazyjną.W rzeczywistości ta macierz pomyłek może służyć do podsumowania słabych i mocnych stron testu, dając przybliżony obraz dokładności i powtarzalności eksperymentu. Podczas próby zastosowania tej nowej procedury niezwykle ważne jest ścisłe przestrzeganie określonych wymiarów fragmentów tkanki zgodnie z opisaną procedurą. Aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: czy komórki zapalne naciekają?, można przeprowadzić inne metody, np. konfrontację z komórkami nienowotworowymi.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat rozróżniania inwazyjnych i nieinwazyjnych komórek nowotworowych. Należy pamiętać, że praca z utrwalaczami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak zapewnienie wentylacji powietrza.

chick-heart-invasion-assay-for-testing-invasiveness-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test inwazji serca kurczaka do badania inwazyjności komórek rakowych i aktywności potencjalnie antyinwazyjnych związków

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób pomiaru inwazji komórek przez wkładki do hodowli komórkowych z wykorzystaniem metody fluorescencyjnej.

Test inwazyjności guza FluoroBlok In vitro

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Ten film opisuje test inwazji przy użyciu trzykomorowej matrycy opartej na impedancji elektrycznej. Technika ta mierzy potencjał inwazyjny komórek nowotworowych pod wpływem rozpuszczalnych czynników wydzielanych przez rezydentne komórki zrębu w mikrośrodowiskach guza.

Trójkomorowy test impedancji oparty na układzie: technika analizy w czasie rzeczywistym do oceny potencjału inwazyjnego komórek rakowych poprzez pomiar impedancji elektrycznej

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Ten artykuł wideo opisuje zmodyfikowaną metodę in vitro do badania roli hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu w napędzaniu inwazji komórek rakowych.

Zmodyfikowany test inwazji in vitro w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i / lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w inwazji komórek rakowych

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Poznaj metodę hodowli organowej do badania inwazji komórek nowotworowych w trzech wymiarach przy użyciu fragmentów serca piskląt. Technika ta umożliwia testowanie związków przeciwinwazyjnych in vitro.

Test inwazji serca piskląt do badania inwazyjności komórek rakowych i aktywności potencjalnie przeciwinwazyjnych związków

Przeglądaj więcej filmów