Name: Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę fotozakrzepicy różaną bengalską w korze somatosensorycznej myszy przy użyciu mikroskopii konfokalnej in vivo. Technika umożliwia natychmiastową obserwację odpowiedzi komórkowych po indukcji zakrzepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez: AG007218 i NIH F32 AG031606.
Obrazy zostały wygenerowane w Core Optical Imaging Facility, który jest obsługiwany przez UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) i NIH-NIA P01AG19316.

Uwaga: Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio i były zgodne z wytycznymi ARRIVE.
1. Znieczulenie do przygotowania kory mózgowej
<ol>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej z 2-3% izofluoranem zmieszanym z tlenem w celu wywołania znieczulenia. Obserwuj spadek częstości oddechów w miarę indukcji myszy. Ściśnij łapę myszy, aby określić, czy mysz jest gotowa do przejścia do stożka nosowego. Uwaga: Poziom znieczulenia jest krytycznym krokiem w każdym przygotowaniu in vivo i należy zachować ostrożność, aby nie wywołać poziomu, który spowoduje globalne niedokrwienie.</li>
	<li>Gdy mysz jest wystarczająco znieczulona, przenieś zwierzę na platformę chirurgiczną/obrazową i umieść nos myszy w stożku nosowym i zastosuj 1-1,2% izofluoranu, aby utrzymać stan znieczulenia. Upewnij się, że mysz leży na poduszce grzewczej o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę ciała (37°C +/- 0.5°C) podczas pozostałych procedur. Umieść maść weterynaryjną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Monitoruj fizjologię myszy za pomocą systemu pulsoksymetrii za pomocą klipsa ogonowego lub stopowego dostarczonego z systemem. Sprawdź, czy częstość oddechów utrzymuje się w zakresie 50-65 oddechów/min. Sprawdź, czy tętno utrzymuje się w zakresie od 300 do 450 uderzeń na minutę, a nasycenie tlenem utrzymuje się w zakresie 97-98%, aby zapewnić długotrwałe przeżycie zwierzęcia.</li>
	<li>Gdy mysz jest odpowiednio znieczulona, ogol włosy nad czaszką za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia, usuń resztki włosów i wyczyść betadyną, a następnie wacikiem etanolowym. Powtórz tę procedurę do trzech razy, aby zapewnić sterylne środowisko chirurgiczne.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Gdy skóra głowy jest całkowicie oczyszczona i ogolona, wykonaj 5-milimetrowe nacięcie w skórze głowy myszy, aby odsłonić szczeliny czaszki i zlokalizować bregmę.</li>
	<li>Użyj sterylnego bawełnianego aplikatora, aby usunąć pozostałą powięź pokrywającą czaszkę.</li>
	<li>Przyklej wykonany na zamówienie pierścień ze stali nierdzewnej (ryc. 1) z klejem tkankowym do kości pokrywającej korę ciemieniową, używając współrzędnych stereotaktycznych Bregmy: od -1 do -3 mm i bocznych: 2-4 mm. Uwaga: Klej zwykle twardnieje w ciągu 2 minut po umieszczeniu pierścienia na kości.</li>
	<li>Przymocuj pierścień do uchwytu stereotaktycznego (rysunek 2), aby ustabilizować mysz i zapobiec ruchowi podczas obrazowania.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym klasy chirurgicznej powoli wywierć odcinek 1-2 mm w czaszce za pomocą narzędzia podobnego do dremelu o regulowanej prędkości (wiertło Meisinger 3,9 mm), upewniając się, że obszar jest równy podczas wiercenia. Osiągnij to za pomocą zygzakowatego wzoru. Aby uniknąć gromadzenia się ciepła, ustaw niską prędkość wiertła i rób częste przerwy.</li>
	<li>Kiedy czaszka czaszki stanie się błyszcząca, kontynuuj przerzedzanie czaszki za pomocą ostrza skalpela, wykorzystując ten sam zygzakowaty wzór, aby utrzymać ścieńczoną powierzchnię na poziomie i ułatwić płynne usuwanie cienkich warstw czaszki. Za pomocą końcówki ostrza skalpela wykonuj małe liniowe pociągnięcia z lekkim naciskiem, aby usunąć cienkie warstwy kości na raz. Kontynuuj tę czynność, aż układ naczyniowy będzie wyraźnie widoczny pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Jeśli eksperymentator przebije lub złamie czaszkę podczas procesu przerzedzania, zwierzę zostanie poddane eutanazji z powodu prawdopodobnego uszkodzenia kory mózgowej. 
	Uwaga: Czaszka myszy ma grubość około 300 μm i składa się z dwóch cienkich warstw zwartej kości (jedna warstwa zewnętrzna i jedna wewnętrzna) oraz warstwy kości gąbczastej umieszczonej pomiędzy dwiema warstwami kości zwartej. Zewnętrzna warstwa zwartej kości i większość kości gąbczastej są usuwane w obszarze wiercenia o średnicy 5 mm, w wyniku czego pozostaje około 50 μm warstwy zwartej kości (patrz rysunek 2B). Wizualizacja układu naczyniowego zapewni, że ostateczna nienaruszona, przerzedzona czaszka ma grubość około 50 μm. Czaszka jest zatem nadal obecna, gdy zostanie przerzedzona do tej grubości.</li>
</ol>
3. Ustawienie mikroskopu
<ol>
	<li>Użyj systemu mikroskopu odwróconego (konwencjonalny, konfokalny lub dwufotonowy), który ma falownik obiektywu. Uwaga: Możliwe jest również użycie standardowego mikroskopu pionowego. Czynnikiem ograniczającym będzie przestrzeń między sceną a celami. Do wykonania tej konfiguracji mogą być konieczne modyfikacje sceny.</li>
	<li>Przymocuj platformę chirurgiczną/obrazową do specjalnie wykonanego stolika, który znajduje się z boku podstawy mikroskopu. Uwaga: Platforma jest wykonana za pomocą podnośnika laboratoryjnego, aby umożliwić pionowy ruch platformy chirurgicznej/obrazowej pod obiektywem. Podnośnik laboratoryjny jest zamontowany na płycie przymocowanej do czterech cylindrycznych biegunów. (Patrz rysunek 2).</li>
	<li>Umieść falownik obiektywu zawierający obiektyw 20X nad oknem czaszki. Użyj zewnętrznego źródła światła, aby znaleźć okno czaszki, patrząc przez okulary mikroskopu i ustawić obiektyw w obszarze obrazowania. Uwaga: Obszar obrazowania będzie oznaczony obecnością układu naczyniowego.</li>
	<li>W przypadku celów opartych na wodzie należy użyć sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH2PO4; 200 mM NaHCO3; 30 mM HEPES i 100 mM glukozy) jako medium ze względu na potencjalny wyciek do jamy czaszki podczas obrazowania (ryc. 3).</li>
</ol>
4. Przygotowanie, podawanie i indukcja udaru różanego barwnika bengalskiego
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór róży bengalskiej o stężeniu 20 mg/ml w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF); przefiltrować i wysterylizować przed podaniem. Nie używaj ponownie ani nie przechowuj Rose Bengal po wymieszaniu. Przygotuj nowe rozwiązanie dla każdego eksperymentu.</li>
	<li>Wykonaj 0,1 ml wstrzyknięcia do żyły ogonowej Rose Bengal, skanując okno czaszki laserem o długości fali 561 nm, aby zapewnić odpowiednie wstrzyknięcie roztworu. Uwaga: Róża bengalska zostanie uwidoczniona w ciągu 5 sekund po wstrzyknięciu do układu naczyniowego mózgu. Całe naczynie powinno być wypełnione Rose Bengal.</li>
	<li>Po odpowiednim wstrzyknięciu barwnika Rose Bengal należy wybrać odpowiednie naczynie do zakrzepicy na podstawie średnicy naczynia (40-80 μm), aby zapewnić powtarzalność określonej objętości zmiany. Rozróżnij tętnice i żyły, patrząc na kierunek przepływu krwi: tętnice będą się przemieszczać z naczyń o większej średnicy do naczyń o mniejszej średnicy, żyły przemieszczają się z naczyń o mniejszej do większej średnicy. Można to łatwo osiągnąć poprzez wizualizację po wstrzyknięciu Rose Bengal.</li>
	<li>Zmień ustawienia mikroskopu w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wydłuża czas przebywania. Uwaga: Będzie się to różnić w zależności od używanego systemu mikroskopu.</li>
		<li>Zwiększ moc lasera do 100%.</li>
		<li>Zbieraj obrazy sekwencji czasowej z prędkością 1 klatki/s, korzystając z maksymalnej prędkości skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skanuj mysz, aż w naczyniu utworzy się stabilny skrzep. Uwaga: Zwykle osiąga się to w ciągu 5 minut ciągłego skanowania (patrz rysunek 4).</li>
	<li>Po indukcji tworzenia się skrzepów za pomocą Rose Bengal, usuń mysz z obszaru obrazowania z powrotem do mikroskopu preparacyjnego. Ostrożnie zdejmij pierścień ze stali nierdzewnej z czaszki. Zbadaj okno czaszki pod kątem krwawienia. Jeśli wystąpi krwawienie, przerwij eksperyment.</li>
	<li>Użyj szwu monofilamentowego 6.0, aby zamknąć nacięcie nad czaszką. Umieść maść z antybiotykiem wzdłuż linii szwów, aby zapobiec infekcji. Wstrzykiwać Buprenex (0,05 mg/kg) podskórnie co 12 godzin przez trzy dni w celu leczenia bólu.</li>
	<li>Po wyjęciu ze środka znieczulającego umieść mysz w komorze regeneracyjnej, aż do momentu, gdy zostanie całkowicie wybudzona i będzie się swobodnie poruszać.</li>
	<li>Przywróć mysz do czystej klatki w celu dalszego zbadania w późniejszym czasie.</li>
</ol>
5. Obrazowanie podłużne w kolejnych dniach
<ol>
	<li>Zastosuj następujące metody, aby wykonać obrazowanie podłużne w kolejnych dniach po fotozakrzepicy.
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz zgodnie z opisem w sekcji 1 metod.</li>
		<li>Po odpowiednim znieczuleniu ponownie otwórz skórę głowy, usuwając wszelkie pozostałe szwy, aby ponownie otworzyć skórę pokrywającą wcześniej wywiercone pole obrazowania.</li>
		<li>Użyj sterylnego bawełnianego aplikatora, aby usunąć pozostałą powięź pokrywającą czaszkę.</li>
		<li>Przyklej wykonany na zamówienie pierścień ze stali nierdzewnej (ryc. 1) z klejem tkankowym do kości pokrywającej poprzednie pole obrazowania.</li>
		<li>Przymocuj pierścień do uchwytu stereotaktycznego (rysunek 2), aby ustabilizować mysz i zapobiec ruchowi podczas obrazowania.</li>
		<li>Zlokalizuj układ naczyniowy pod poprzednio cieńszą czaszką. Zastosować iniekcję FITC-Dekstranu do żyły ogonowej w celu sprawdzenia obecności wcześniej wywołanego skrzepu.</li>
		<li>Użyj szwu monofilamentowego 6.0, aby zamknąć nacięcie nad czaszką. Umieść maść z antybiotykiem wzdłuż linii szwów, aby zapobiec infekcji. Wstrzykiwać Buprenex (0,05 mg/kg) podskórnie co 12 godzin przez trzy dni w celu leczenia bólu.</li>
		<li>Po wyjęciu ze środka znieczulającego umieść mysz w komorze regeneracyjnej, aż do momentu, gdy zostanie całkowicie wybudzona i będzie się swobodnie poruszać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Weryfikacja indukcji udaru (sekcja zwłok)
<ol>
	<li>Na zakończenie badania należy sprawdzić objętość wyrzutową za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC), jak pokazano na rysunku 5. Pełną metodę można znaleźć w12.</li>
</ol>

<ol><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).</li>
<li>Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+in+the+cerebral+microcirculation%3A+effect+of+aspirin+and+other+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents.</a> Circulation Research. 40, 320-328 (1977).</li>
<li>Owens, A. P. 3rd, Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+tissue+factor+that+contribute+to+thrombosis+after+rupture+of+an+atherosclerotic+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque.</a> Thrombosis Research. 129, Suppl 2. S30-S33 (2012).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+stroke+models+in+rats%22">Manual of stroke models in rats</a>. , 332 CRC Press. (2009).</li>
<li>Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+middle+cerebral+artery+occlusion+by+an+intraluminal+thread+compromises+collateral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow.</a> Brain Research. 791, 223-228 (1998).</li>
<li>Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+brain+ischemia+in+the+rat%3A+methods+for+reproducible+neocortical+infarction+using+tandem+occlusion+of+the+distal+middle+cerebral+and+ipsilateral+common+carotid+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism+%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+stimulation+reduces+cytotoxic+edema+and+brain+infarcts+in+mouse+induced+by+photothrombosis+by+energizing+glial+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria.</a> PloS One. 5, e14401(2010).</li>
<li>Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2Y. 1R. -initiated <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP3R-dependent+stimulation+of+astrocyte+mitochondrial+metabolism+reduces+and+partially+reverses+ischemic+neuronal+damage+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).</li>
<li>Witte, O. W., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+and+remote+effects+of+focal+cortical+infarctions%3A+secondary+damage+and+reactive+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity.</a> Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).</li>
<li>Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+long-term+potentiation+in+the+surround+of+experimentally+induced+focal+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction.</a> Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).</li>
<li>Kramer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTC+staining+of+damaged+brain+areas+after+MCA+occlusion+in+the+rat+does+not+constrict+quantitative+gene+and+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).</li>
<li>Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+basis+for+the+robust+distribution+of+blood+to+rodent+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).</li>
<li>Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+collateral+flow+after+occlusion+of+a+single+cortical+penetrating+arteriole%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365(2007).</li>
<li>Blum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+after+silent+stroke%3A+Hippocampus+and+infarcts+both+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter.</a> Neurology. 78, 38-46 (2012).</li>
<li>Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+infarcts+in+the+middle+cerebral+artery+territory+Etiology+and+outcome+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns.</a> Neurology. 50, 341-350 (1998).</li>
<li>Wardlaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+causes+lacunar+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery+%26+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">What causes lacunar stroke.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).</li>
<li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+under+anticoagulant+therapy%5D.+Rinsho+shinkeigaku%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku.</a> Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).</li>
<li>Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Volume+of+the+Focal+Cerebral+Ischemic+Lesion+through+Photothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis.</a> American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).</li>
<li>Head, B. P., Patel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+and+brain+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetics and brain protection.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).</li>
<li>Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+and+cerebroprotection%3A+experimental+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22International+Anesthesiology+Clinics%22%5BJournal%5D)">Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects.</a> International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).</li>
<li>Koerner, I. P., Brambrink, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+protection+by+anesthetic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Brain protection by anesthetic agents.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).</li>
<li>Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+anesthesia+compared+to+awake+reduces+infarct+size+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats.</a> Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).</li>
<li>Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic+choice+of+halothane+versus+propofol%3A+impact+on+experimental+perioperative+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+A+Journal+Of+Cerebral+Circulation%22%5BJournal%5D)">Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke.</a> Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).</li>
<li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zdolność do przełożenia eksperymentalnej patofizjologii udaru z zastosowania u zwierząt na ludzi była obarczona niepowodzeniem. Jednak wykorzystanie modeli zwierzęcych, takich jak model fotozakrzepicy, pozwala na lepsze zrozumienie patofizjologii udaru mózgu i zbadanie nowych podejść terapeutycznych w celu zapewnienia neuroprotekcji po udarze. Małe udary korowe i mikrozawały wywołane przez model fotozakrzepowy są klinicznie istotne dla subklinicznego lub "cichego" udaru13-15, który ma wysoką częstość występowa...

Opisana technika pozwala na wizualizację reakcji komórkowych in vivo natychmiast po indukcji fotozakrzepicy bengalskiej u nienaruszonej myszy. Róża bengalska (4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'-tetraiodofluoresceina) jest światłoczułym barwnikiem stosowanym do wywoływania udaru niedokrwiennego u modeli zwierzęcych (myszy i szczurów). Po wstrzyknięciu bolusa RB przez żyłę ogonową, a następnie oświetleniu przez ścieńczoną czaszkę światłem laserowym o długości fali 564 nm, indukowana jest skrzeplina, powodująca udar fizjologiczny1. Metoda ta została po raz pierwszy opisana przez Rosenbluma i El-Sabbana w 1977 roku, a następnie została zaadaptowana przez Watsona w połowie lat 80. Krótko mówiąc, Rose Bengal jest naświetlany zielonym światłem wzbudzenia (w naszym przypadku laserem o długości fali 561 nm), które generuje produkcję reaktywnych form tlenu, które następnie aktywują czynnik tkankowy, inicjator kaskady krzepnięcia. Indukcja kaskady krzepnięcia powoduje powstanie zmiany niedokrwiennej, która jest patologicznie istotna dla klinicznego udarumózgu 3.
Udar mózgu ma złożoną patofizjologię ze względu na wzajemne oddziaływanie wielu różnych typów komórek, w tym neuronów, gleju, śródbłonka i układu odpornościowego. Wybór najlepszej techniki badania konkretnego procesu komórkowego wymaga wielu rozważań. Techniki eksperymentalne można ogólnie podzielić na jedną z trzech kategorii: in vitro, in vivo i in silico, przy czym każda z nich ma zalety i wady. Badania in vitro mają podstawową wadę polegającą na usuwaniu komórek z ich naturalnego środowiska i dlatego mogą nie odtwarzać efektów obserwowanych u nienaruszonego, żywego zwierzęcia. Techniki in vivo umożliwiają ulepszoną eksperymentalną replikację stanów chorobowych o zwiększonym znaczeniu translacyjnym. In silico ogólnie odnosi się do komputerowego modelowania choroby lub procesu komórkowego i chociaż jest coraz częściej wykorzystywane na przykład do badania potencjalnych interakcji leków, wszelkie zebrane informacje muszą być nadal testowane na żywych komórkach lub tkankach.
Idealny model udaru mózgu w warunkach laboratoryjnych powinien wykazywać podobne cechy patologiczne do tych obserwowanych w populacji ludzkiej. Chociaż istnieją wspólne fizjologiczne cechy udaru w populacji ludzkiej, istnieje również wiele różnic w zależności od rodzaju doświadczonego urazu. Udar mózgu w populacji ludzkiej występuje jako niedrożność małych lub dużych naczyń, zmiany krwotoczne i tętnica-tętnica lub zatorowość, które skutkują zróżnicowaną objętością zawału, a także różnicami w mechanizmach związanych z każdą patologią. Zaletą wykorzystania zwierzęcych modeli udaru mózgu jest generowanie powtarzalnych zawałów, które naśladują cechy ludzkiego udaru. Do najczęstszych modeli udaru u zwierząt zalicza się niedrożność tętnic z wykorzystaniem: niedrożności tętnicy środkowej mózgu (metoda filamentu zatorowego lub wewnątrznaczyniowego), która modeluje dystalne MCAO oraz model fotozakrzepicy. Zalety i wady każdego modelu zostały omówione w innym miejscu (patrz 4 i 5). Globalne modele niedokrwienne (MCAO), choć stosunkowo łatwe do wykonania, mają mniejsze znaczenie dla udaru mózgu u ludzi niż modele udaru ogniskowego. Ponadto metody te są bardzo zmienne w wywoływaniu powtarzalnych zmian w zawale mózgu. Model fotozakrzepicy jest wysoce powtarzalny, o ile eksperymentator dobrze kontroluje swoje eksperymenty, zapewniając wyraźną przewagę nad modelami MCAO. Jednak ze względu na uszkodzenie mikrokrążenia model został opisany jako wykazujący minimalny niedokrwienny półcień, obszar, w którym uważa się, że komórki są możliwe do uratowania 6,7. Dodatkowo, obrzęk naczyniopochodny i powstawanie obrzęku cytotoksycznego mogą być również wywołane po napromienianiu obszaru obrazowania. Pomimo tych ograniczeń technika ta dostarczyła nowych informacji na temat wielu procesów fizjologicznych zachodzących po udarze 8,9,10,11.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran Znieczulenie</td><td>MWI Zaopatrzenie weterynaryjne</td><td>088-076</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>aCSF&nbsp;</td><td>126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glukozy i 26 mM NaHCO3 (pH 7,4).</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparowania</td><td>sprzętu Produkty bioprzemysłowe</td><td>500-410</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne 14 cm</td><td>Produkty bioprzemysłowe</td><td>12-055</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont High Tech #5 styl, proste</td><td>Produkty bioprzemysłowe</td><td>TWZ-301.22</td><td></td></tr><tr><td>LabJack 132X80</td><td>Optosigma Co</td><td>123-6670</td><td></td></tr><tr><td>Platforma do Labjack 8X 8</td><td>Optosigma Co</td><td>145-1110</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na nauszniki z konfiguracji stereotaktycznej</td><td>Stoelting/Cyborg</td><td>51654</td><td></td></tr><tr><td>Dispomed Labvent Gryzoń aparat do znieczulenia</td><td>DRE, Inc.</td><td>15001</td><td></td></tr><tr><td>Tech IV Waporyzator izofluranowy</td><td>DRE, Inc.</td><td>34001</td><td></td></tr><tr><td>F Kanister powietrza</td><td>DRE, Inc</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Rurka oddechowa z obwodem Baina</td><td>DRE, Inc</td><td>86111B</td><td></td></tr><tr><td>Adapter dla gryzoni do rurki bekaliowej</td><td>DRE, Inc</td><td>891000</td><td></td></tr><tr><td>Reduktor O2 do zbiorników tlenu</td><td>DRE, Inc</td><td>CE001E</td><td></td></tr><tr><td>Komora indukcyjna dla gryzoni</td><td>DRE, Inc</td><td>15004C</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Silk 6-0; 18 cali z igłą P-3</td><td>Szew Express</td><td>1639G</td><td></td></tr><tr><td>Falownik obiektywu Adapter optyczny</td><td>Technologie</td><td></td><td></td>LSM</tr><tr><td>Wiertarka Przednie Podwójne napięcie 110/120</td><td>Foredom</td><td>134,53</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło Meisinger 3,9 mm Meisinger</td><td></td><td></td> <td>(Ref#310 104 001 001 009)</td></tr></tbody></table>

fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Techniki obrazowania in vivo zyskały na popularności dzięki niedawnym postępom w barwnikach do obrazowania i technologiach optycznych, co pozwala na obrazowanie zdarzeń komórkowych u nienaruszonego zwierzęcia. Dodatkowo zdolność do wywoływania fizjologicznych stanów chorobowych, takich jak udar mózgu in vivo, zwiększa jego użyteczność. Opisana w niniejszym dokumencie technika pozwala na fizjologiczną ocenę odpowiedzi komórkowych w obrębie OUN po udarze mózgu i może być dostosowana do innych badanych stanów patologicznych. Przedstawiona technika wykorzystuje wzbudzenie laserowe światłoczułego barwnika Rose Bengal in vivo w celu wywołania ogniskowego zdarzenia niedokrwiennego w pojedynczym naczyniu krwionośnym. 
Protokół wideo demonstruje przygotowanie okna czaszkowego o cienkiej czaszce nad korą somatosensoryczną u myszy do indukcji zdarzenia fotozakrzepowego u Rose Bengal, ograniczając do minimum uszkodzenia opony twardej i mózgu. Przygotowanie chirurgiczne jest początkowo wykonywane pod mikroskopem preparacyjnym z specjalnie wykonaną platformą chirurgiczną/obrazową, która jest następnie przenoszona do mikroskopu konfokalnego wyposażonego w odwrócony adapter obiektywu. Prezentowane są reprezentatywne obrazy uzyskane przy użyciu tego protokołu, a także sekwencje poklatkowe indukcji udaru. Technika ta jest skuteczna, ponieważ ten sam obszar może być obrazowany wielokrotnie w kolejnych dniach, co ułatwia podłużne badania in vivo procesów patologicznych po udarze.

Celem opisanej metody było wywołanie udaru niedokrwiennego u modeli zwierzęcych (myszy i szczura) poprzez bolusową iniekcję RB do żyły ogonowej, a następnie naświetlanie cieńszej kości czaszki światłem lasera o długości fali 561 nm. Obrazy na Rysunku 4 przedstawiają postęp tworzenia się skrzepu w obrębie pojedynczego naczynia po naświetlaniu obszaru w czasie 0, 1, 1,5 i 2 min. Przed utworzeniem się skrzepu całe naczynie jest białe ze względu na swobodny przepływ Rose Bengal. Po rozpoczęciu naświetlania n...

Tutaj opisujemy półinwazyjną metodę mikroskopii optycznej do indukcji skrzepu fotozakrzepowego Rose Bengal w korze somatosensorycznej myszy in vivo. Opisano techniczne aspekty procedury obrazowania, począwszy od indukcji zdarzenia fotozakrzepowego, a skończywszy na zastosowaniu i gromadzeniu danych.

Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie półinwazyjnego podejścia z użyciem mikroskopii optycznej w celu wywołania fototromboticznej zakrzepnicy z użyciem błękitu różowego w korze somatosensorycznej myszy. Osiąga się to poprzez znieczulenie myszy i przygotowanie cienkiego okna czaszkowego do obrazowania. Następnie wstrzykuje się błękit różowy i wykorzystuje laser do wywołania fototrombozy.W rezultacie efekty skrzepu powstałego w wyniku fototrombizacji z użyciem bengały różowego mogą zostać przeanalizowane natychmiast po wybudzeniu z narkozy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji komórkowych odpowiedzi in vivo bezpośrednio po wywołaniu fototrombizacji bengałą różowym. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z wykonaniem cienkiego okna czaszkowego, ponieważ jest to procedura wymagająca i czasochłonna.W celu rozpoczęcia należy podać myszy znieczulenie przy użyciu 2–3% izofluranu zmieszanego z tlenem. Należy zwrócić uwagę na spowolnienie oddechu podczas wprowadzania zwierzęcia w stan narkozy. Następnie należy uszczypnąć łapę myszy.Aby potwierdzić stan znieczulenia, należy zastosować podgrzewacz oraz sondę temperatury, aby utrzymać temperatu

rose-bengal-photothrombosis-confocal-optical-imaging-vivo-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Fototromboza różą bengalską za pomocą konfokalnego obrazu optycznego in vivo: Model udaru pojedynczej naczyniowej

Źródło: Talley Watts, L.,  i wsp. Fotozakrzepica róży bengalskiej za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę wywoływania tworzenia się skrzepów krwi w mózgu myszy. Znieczulona mysz z oknem czaszkowym i ścieńczoną czaszką ulega fotozakrzepicy poprzez aktywację światłoczułego barwnika za pomocą światła o dużym natężeniu. Proces ten generuje reaktywne formy tlenu, które uszkadzają ściany naczyń i...

 Indukowanie tworzenia się skrzepów krwi w mózgu myszy za pomocą światłoczułego barwnika

Fotozakrzepica to szybka, minimalnie inwazyjna technika wywoływania małego i dobrze zdefiniowanego zawału w obszarach zainteresowania w wysoce powtarzalny sposób. Jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Tradycyjne modele udaru fotozakrzepowego (PTS) głównie indukują gęste agregaty płytek krwi o wysokiej odporności na tkankowe leczenie aktywatorem plazminogenu (tPA)-litycznym. Tutaj zmodyfikowany mysi model PTS jest wprowadzany przez jednoczesne wstrzykiwanie trombiny i barwnika światłoczułego w celu fotoaktywacji. Model PTS wzmocniony trombiną wytwarza mieszane skrzepy płytkowo-fibrynowe i jest bardzo wrażliwy na trombolizę tPA.

Wzbogacony fibryną i wrażliwy na tPA model udaru fototrombotycznego

Tutaj opisany jest model udaru fotozakrzepowego, w którym udar jest wytwarzany przez nienaruszoną czaszkę poprzez wywołanie trwałej okluzji mikronaczyniowej za pomocą oświetlenia laserowego po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru u myszy: ogniskowe zmiany korowe spowodowane fotozakrzepicą

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Ta praca demonstruje wykorzystanie multimodalnej platformy obrazowania opartej na ultradźwiękach do nieinwazyjnego obrazowania udaru niedokrwiennego. System ten pozwala na ilościowe określenie natlenienia krwi za pomocą obrazowania fotoakustycznego i upośledzonej perfuzji w mózgu za pomocą angiografii akustycznej.

Zintegrowana tomografia fotoakustyczna, ultrasonograficzna i angiograficzna (PAUSAT) do nieinwazyjnego obrazowania całego mózgu udaru niedokrwiennego

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Stosując całkowicie optyczne podejście, udar niedokrwienny jest indukowany, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów Ca2+ za pomocą fluorescencyjnego biosensora w wyłaniającym się rdzeniu udaru czujnej, zachowującej się myszy.

Jednoczesna fotozakrzemia i fotometria włókien w celu wywołania i monitorowania udaru niedokrwiennego u zachowujących się myszy

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj metodę fotozakrzepicy różaną bengalską w korze somatosensorycznej myszy przy użyciu mikroskopii konfokalnej in vivo. Technika umożliwia natychmiastową obserwację odpowiedzi komórkowych po indukcji zakrzepu.

Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

Przeglądaj więcej filmów