Name: Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Poznaj metodę transfekcji komórek RAW264.7 genem reporterowym lucyferazy bez aktywacji komórek. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów w makrofagach z zachowaniem ich stanu spoczynkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantu Canadian Institutes for Health Research (CIHR). STC posiada nagrodę doktorską przyznaną przez CIHR i Fundację Michaela Smitha. EYS jest stypendystą CIHR. Program Szkolenia Transplantacyjnego CIHR zapewnił również stypendia dla absolwentów STC, EYS i SS.

1. Oczyszczanie plazmidowego DNA
<ol>
	<li>Ekstrahuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu maxiprep zgodnie z protokołem producenta. Ponownie zawiesić plazmidowe DNA w 500 μl buforu TE.</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję fenol:chloroform:izoamyl alkoholem i wytrącanie izopropanolu w celu usunięcia resztkowych zanieczyszczeń bakteryjnych. Obecność LPS zakłóca transfekcję9.
	<ol>
		<li>Dodać 500 μl alkoholu fenolo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1, pH 8) do plazmidowego DNA i energicznie wstrząsać przez 15 sekund. Fenol powoduje poważne oparzenia skóry i jest środkiem znieczulającym, więc oparzenia nie zawsze są odczuwalne, dopóki nie dojdzie do poważnych uszkodzeń. Przeprowadzić ekstrakcję fenol:chloroform:izoamyl w dygestorii i zachować ostrożność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 350 μl górnej fazy wodnej do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 350 μl buforu TE do probówki zawierającej dolną fazę organiczną. Wstrząsaj energicznie przez 15 sekund. Wirować przy 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 350 μl górnej fazy wodnej do tej samej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 70 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2) i dobrze wymieszać. Dodać 700 μl 100% izopropanolu. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Wirować przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Do granulatu dodać 500 μl 75% etanolu. Próbki należy mieszać i odwirowywać w temperaturze 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. DNA znajduje się w granulce.</li>
	<li>Otwórz nakrętkę probówki i susz granulat na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut. Granulka powinna stać się przezroczysta. Dodać 500 μl buforu TE, aby ponownie zawiesić osad DNA. Podgrzewać w temperaturze 50 - 60 °C przez 10 minut, aby rozpuścić osad DNA.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 260 nm (A260) i 280 nm (A280) za pomocą spektrometru. Obliczyć stężenie DNA, mnożąc wartość A260 przez 50 ng/μl. Ocenić jakość DNA, obliczając stosunek A260/A280. DNA o wysokiej jakości powinno dawać stosunek A260/A280 1,8 - 2,0.</li>
</ol>
2. Hodowla i wysiew komórek
<ol>
	<li>Hodowla komórek RAW264.7 w DMEM uzupełniona 9% płodową surowicą cielęcą (DMEM/9% FCS) w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Podczas każdego pasażu należy odłączyć komórki od płytki poprzez ciągłe pipetowanie za pomocą pipety Pasteura. Pasażuj komórki co 2 dni i wysiewaj 1,5 - 2 miliony komórek na 10 cm naczyniu poddanym kulturze tkankowej jako podkład. Rozmrażaj nowy zapas komórek co 5-6 tygodni.</li>
	<li>W dniu transfekcji wysiewa się 200 000 komórek na dołek na 24-dołkową płytkę w objętości 500 μl DMEM/9% FCS. Inkubować komórki przez 4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Komórki transfekcyjne za pomocą odczynnika na bazie lipidów (krok 3.1) lub odczynnika na bazie białka/poliaminy (etap 3.2).</li>
</ol>
3. Transfekcja
<ol>
	<li>Transfekcja na bazie lipidów:
	<ol>
		<li>Rozgrzej odczynnik do transfekcji do RT w ciemności. Rozgrzej pożywkę bez serum i DMEM/9% FCS do 37 °C.</li>
		<li>Dodać 0,5 μg plazmidowego DNA do 50 μl pożywki bez surowicy w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 2 μl odczynnika do transfekcji końcówką pipety poniżej powierzchni cieczy. Wirować przez 6 sek.</li>
		<li>Pozostawić mieszaninę odczynnika/DNA w ciemności w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Podczas 30-minutowej inkubacji należy usunąć pożywkę z dołka i dodać 250 μl świeżego DMEM/9% FCS do każdej studzienki.</li>
		<li>Po 30 minutach dodać 250 μl DMEM/9% FCS do mieszaniny odczynnika/DNA. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Dodać 300 μl rozcieńczonej mieszaniny do każdego dołka. Inkubować przez 2 - 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Usunąć roztwór do transfekcji i dodać 500 μl DMEM/9% FCS. Inkubować przez 24 - 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed stymulacją komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja na bazie białka/poliaminy:
	<ol>
		<li>Rozgrzej pożywkę bez serum i DMEM/9% FCS do 37 °C.</li>
		<li>Dodać 0,75 μl odczynnika do transfekcji do 18,75 μl pożywki wolnej od surowicy. Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 0,5 μl 1 μg/μl DNA do rozcieńczonego transfekowanego odczynnika. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Podczas 10-minutowej inkubacji usunąć pożywkę z każdej studzienki 24-dołkowej płytki i dodać 250 μl świeżego DMEM/9% FCS do każdej studzienki.</li>
		<li>Po 10 minutach dodać 250 μl DMEM/9% FCS do mieszaniny odczynnik/DNA.</li>
		<li>Dodać 270 μl rozcieńczonej mieszaniny do studzienki. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 - 4 godziny.</li>
		<li>Usunąć roztwór do transfekcji i dodać 500 μl DMEM/9% FCS. Inkubować przez 24 - 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Stymulacja komórek i test lucyferazy
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę w studzience 250 μl świeżego DMEM/9% FCS.</li>
	<li>Dodać do studzienki 50 μl LPS lub LPS+IL-10 w żądanych stężeniach. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Stymuluj przez 2 - 6 godzin.</li>
	<li>Usuń roztwór stymulacyjny przez aspirację, przemyj lodowatym PBS i dodaj 200 μl 1x pasywnego buforu do lizy. Kołysz się w RT przez 30 minut. Zeskrobać i przenieść lizat do probówek o pojemności 1,5 ml i usunąć resztki komórek, wirując przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 40 μl oczyszczonego lizatu (supernatantu) na białą, przezroczystą płytkę 96-dołkową w celu oznaczenia sygnałów lucyferazy zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Odczytaj sygnał lucyferazy za pomocą luminometru w całym spektrum światła widzialnego.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz stosunek świetlików do Renilli, dzieląc poszczególne wartości lucyferazy świetlika przez wartości lucyferazy Renilla z każdej studzienki.</li>
	<li>Oblicz zmianę zagięcia, dzieląc stosunek świetlika do Renilla w dobrze traktowanej studni przez tę w studni nieleczonej.</li>
</ol>

<ol><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).</li>
<li>Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+transient+transfection+of+a+murine+macrophage+cell+line+RAW+264.7%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7.</a> Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).</li>
<li>Kim, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+ingest+and+are+activated+by+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA.</a> Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).</li>
<li>Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+activation+of+the+RAW264.7+macrophage+cell+line+by+transfected+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA.</a> Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).</li>
<li>Jiang, W., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+HMGB1+release+from+RAW+264.7+cells+by+transfected+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA.</a> Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).</li>
<li>Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+inducible+gene+expression+by+signal-dependent+transcriptional+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation.</a> Cell. 138 (1), 129-147 (2009).</li>
<li>Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+inhibits+lipopolysaccharide+induced+miR-155+precursor+stability+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation.</a> PLoS One. 8 (8), e71336(2013).</li>
<li>Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+technical+reports.+Effects+of+lipopolysaccharide+on+transfection+efficiency+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells.</a> Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).</li>
<li>Berghaus, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).</li>
<li>Fiszer-Kierzkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+DNA+carriers+may+induce+cellular+stress+response+and+change+gene+expression+pattern+in+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół nie skupia się wyłącznie na wydajności transfekcji, ale ma na celu osiągnięcie równowagi między wydajnością a zachowaniem stanów fizjologicznych komórek. W szczególności nasza procedura skutecznie minimalizuje toksyczność odczynnika do transfekcji i maksymalizuje sygnał lucyferazy.
Jednym z krytycznych kroków w protokole jest zdrowie komórek. Przerośnięte kultury nie nadają się do transfekcji, ponieważ zmienia się ich fizjologia, a ciągła hodowla komórek RAW264.7 przez d...

Transfekcja kwasów nukleinowych w komórkach ma różnorodne zastosowanie w badaniach naukowych. Przykłady obejmują (1) geny reporterowe do badania roli różnych elementów genów w ekspresji genów, (2) plazmidy ekspresji białek do nadekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz (3) małe interferujące RNA do obniżania ekspresji genów. Manipulując poziomem ekspresji poszczególnych genów i mierząc zróżnicowany efekt takich manipulacji, naukowcy mogą wydedukować funkcje genów w wybranych systemach biologicznych. Nie wszystkie metody transfekcji zapewniają taką samą skuteczność transfekcji, a nawet ta sama metoda transfekcji nie transfekuje wszystkich typów komórekw równym stopniu 1. W związku z tym opracowano różne metody transfekcji, takie jak metoda fosforanu wapnia, dekstran DEAE, kationowa transfekcja lipidów, kationowa transfekcja polimerów nielipidowych, elektroporacja i nukleofekcja2,3.
Transfekcja do makrofagów jest szczególnie trudna ze względu na fakt, że makrofagi są profesjonalnymi fagocytami, które są bardzo wrażliwe na obce materiały, w tym pochodzące z bakterii (metylowane) DNA4. Wprowadzenie obcego DNA aktywuje szlak receptora Toll-podobnego 9 (TLR9) prowadzący do produkcji cytokin i tlenku azotu5,6. Te aktywowane makrofagi mogą być wtedy mniej wrażliwe na leczenie, które naukowcy zamierzają zbadać.
Nasze laboratorium rutynowo transfekuje linię komórkową makrofagów RAW264.7 genami reporterowymi lucyferazy i opracowaliśmy protokół, który jest wystarczająco solidny, aby sygnał lucyferazy był znacznie wyższy niż tło, ale także wystarczająco łagodny, aby makrofagi mogły pozostać w stanie spoczynku. Zachowania transfekowanych komórek oceniano za pomocą genu reporterowego świetlika-lucyferazy zawierającego region promotorowy IκBζ (pGL3- IκBζ). Ekspresja IκBζ jest regulowana w górę przez lipopolisacharyd składnika ściany komórkowej bakterii (LPS)7,8 i obniżana przez cytokinę przeciwzapalną, interleukinę-10 (IL-10)8. Aby uwzględnić zmienność transfekcji między studzienkami, współtransfekujemy plazmid kontrolny zawierający gen lucyferazy Renilla (np. phRL-TK) w celach normalizacyjnych. Opisany protokół jest optymalizowany po przetestowaniu różnych parametrów, w tym czasu transfekcji, rodzaju odczynników do transfekcji, ilości odczynników do transfekcji i plazmidowego DNA, a także stosunku odczynnika do transfekcji do plazmidowego DNA. Dwa odczynniki do transfekcji zawarte w tym protokole to (1) odczynnik do transfekcji na bazie lipidów i (2) odczynnik do transfekcji na bazie białka/poliaminy.

<table><tbody><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td> Life <td>Technologies</td><td>K210007</td><td>Każdy zestaw maxiprep będzie działał</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy</td><td>Life Technologies</td><td>15593-049</td><td>Klasa biologii molekularnej. Fenol jest toksyczny, więc jeśli to możliwe, pracuj w dygestorium. Użyj dolnej przezroczystej warstwy organicznej, jeśli w pojemniku tworzą się dwie warstwy płynu.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30243.01</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td>Inaktywowana w 56 & stopniach; C kąpiel wodna przez 45 minut przed użyciem.</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Przed użyciem ogrzać do temperatury co najmniej pokojowej.</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji XtremeGene HP DBA</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Przed użyciem podgrzać do temperatury pokojowej.</td></tr><tr><td>GeneJuice</td><td>EMD Millipore</td><td>70967</td><td>Przed użyciem podgrzać do temperatury pokojowej.</td></tr><tr><td>5x Pasywny Bufor do Lizy</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>30 ml jest zawarty w Dual Luciferae Reporter Assay System</td></tr><tr><td>Dual Lucyferazy Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr></tbody></table>

transfekcja komórek raw264.7 z genem reporterowym lucyferazy

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfekcja pożądanych materiałów genetycznych do komórek jest nieuniknioną procedurą w badaniach biomedycznych. Chociaż opisano wiele metod, niektóre typy komórek są odporne na wiele z tych metod i dają niską wydajność transfekcji1, co potencjalnie utrudnia badania nad tymi typami komórek. W tym protokole przedstawiamy zoptymalizowaną procedurę transfekcji w celu wprowadzenia genów reporterowych lucyferazy jako plazmidowego DNA do linii komórkowej makrofagów RAW264.7. Opisano dwa różne rodzaje odczynników do transfekcji (na bazie lipidów i poliaminy), a w całym protokole podaje się ważne uwagi, aby zapewnić, że komórki RAW264.7 są minimalnie zmienione przez procedurę transfekcji, a wszelkie uzyskane dane eksperymentalne są bezpośrednimi wynikami eksperymentalnego traktowania. Chociaż skuteczność transfekcji może nie być wyższa w porównaniu z innymi metodami transfekcji, opisana procedura jest wystarczająco solidna, aby wykryć sygnał lucyferazy w RAW264.7 bez zmiany fizjologicznej odpowiedzi komórek na bodźce.

Rysunek 1 porównuje wydajność transfekcji dwóch odczynników transfekcyjnych w komórkach RAW264.7. Odczynnik oparty na lipidach zazwyczaj dawał wydajność transfekcji na poziomie około 25%, podczas gdy transfekcja oparta na białkach/poliaminach skutkowała wydajnością około 5% (Rysunek 1A). Różnica w wydajności transfekcji była widoczna również w sygnałach lucyferazy w komórkach RAW264.7 transfekowanych reporterem promotora pGL3-IκBζ (Rysunek 1B). Dodanie LPS do tych transf...

Transfekcja do linii komórkowej makrofagów, RAW264.7, jest trudna ze względu na naturalną reakcję komórki na obce materiały. Opisaliśmy tutaj delikatną, ale solidną procedurę transfekcji genów reporterowych lucyferazy do komórek RAW264.7.

Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Ogólnym celem tej procedury jest transfekcja konstruktów reporterowych lucyferazy do komórek raw 2 6 4 0.7 bez aktywacji tych komórek. Osiąga się to poprzez uprzednie zebranie komórek raw 2 6 4 0.7 z płytki zapasowej za pomocą delikatnego pipetowania i wysianie komórek na 24-dołkową płytkę do hodowli tkanek. Drugim krokiem jest kotransfekcja komórek plazmidem reporterowym lucyferazy świetlikowej oraz kontrolnym plazmidem lucyferazy Renilla.Plazmidy te muszą być wolne od endotoksyn. Następnie komórki poddaje się stymulacji pożądanymi czynnikami, po czym następuje lizy komórek i przeniesienie zawartości do białej płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem. Ostatnim krokiem jest oznaczenie aktywności lucyferazy świetlika, a następnie pomiar aktywności lucyferazy w celu obliczenia stosunku aktywności lucyferazy świetlika do całkowitej.Ostatecznie krotność zmiany (fold change) w porównaniu z niestymulowaną kontrolą służy do wykazania wpływu bodźców na reporter lucyferazy, co koreluje z poziomem ekspresji badanego genu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak konwencjonalna transfekcja nocna, jest to, że transfektowane komórki pozostają w stanie spoczynku pr

transfecting-raw2647-cells-with-a-luciferase-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transfekcja komórek RAW264.7 genem reporterowym luciferase

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Niniejsza metoda opisuje wysokowydajną syntezę in vitro zarówno zmodyfikowanego (z czapeczką), jak i niezmodyfikowanego (bez czapeczki) mRNA z liniowego plazmidu zawierającego gen lucyferazy Gaussia (GLuc). RNA zostaje poddane oczyszczaniu, a następnie część mRNA bez czapeczki zostaje enzymatycznie zmodyfikowana z wykorzystaniem enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia. W ostatnim kroku mRNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie analizowana jest aktywność lucyferazy w supernatantach...

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Ten film demonstruje test do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem poxvirus. Niezakażone i zakażone wirusem komórki były współtransfekowane mRNA kodującymi lucyferazy świetlika (Fluc) i lucyferazy Renilla (Rluc), przy czym mRNA Fluc zawierało sekwencję liderową 5' poli(A). Po dodaniu substratów bioluminescencyjnych na lizowanych komórkach, zmierz sygnał z obu lucyferazy, aby zidentyfikować przewagę translacyjną mRNA Fluc w komórkach zakażonych wirusem, przyznaną przez...

Test reporterowy lucyferazy do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych ospą

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Poznaj metodę transfekcji komórek RAW264.7 genem reporterowym lucyferazy bez aktywacji komórek. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów w makrofagach z zachowaniem ich stanu spoczynkowego.

Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy

Przeglądaj więcej filmów