Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy

Ogólnym celem tej procedury jest transfekcja konstruktów raportów lucyferazy do surowych 2, 6, 4, 0,7 komórek bez aktywacji komórek. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie surowych komórek 2, 6, 4, 0,7 z płytki podstawowej poprzez delikatne pipetowanie i wysiewanie komórek na 24-dołkową płytkę poddaną działaniu kultur tkankowych. Drugim krokiem jest transfekcja transfekcji raportu lucyferazy świetlika plazmidu, a kontrola wprowadziła plazmid lucyferazy do komórek.

Te plazmidy muszą być wolne od endotoksyn. Następnie komórki są stymulowane pożądanymi zabiegami, a następnie lizą komórek i przenoszone na białą 96-dołkową płytkę z przezroczystym dnem. Ostatnim krokiem jest oznaczenie aktywności lucyferazy świetlika, a następnie przeprowadzenie aktywności lucyferazy w celu obliczenia stosunku świetlików do nich.

Ostatecznie, zmiana fałdowania w porównaniu z niestymulowaną kontrolą jest wykorzystywana do pokazania wpływu bodźców na reportera Lucyfera, który jest skorelowany z poziomem ekspresji interesującego genu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna nocna transsekcja, jest to, że komórki transektu są utrzymywane w stanie spoczynku przy minimalnym uszkodzeniu komórek. DNA w kratę, które ma być użyte do transfekcji, zostało wcześniej wyekstrahowane przy użyciu dostępnego na rynku zestawu przygotowawczego maxi i ponownie zawieszone w 500 mikrolitrach buforu.

Ponieważ obecność składnika ściany komórkowej bakterii, lipopolisacharydu lub LPS, zakłóca transfekcję, resztki zanieczyszczeń bakteryjnych muszą zostać usunięte z DNA w dygestorium. Dodaj 500 mikrolitrów alkoholu izoamylowego fenylochloroformu do plazmidowego DNA i energicznie wstrząsaj przez 15 sekund. Należy zachować ostrożność, ponieważ fenol powoduje poważne oparzenia skóry.

Inkubować mieszaninę przez pięć minut wirówki w temperaturze pokojowej przy 13 000 razy G przez 10 minut przenoszenia w temperaturze pokojowej 350 mikrolitrów górnej fazy wodnej do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 350 mikrolitrów buforu TE do probówki zawierającej dolną fazę organiczną. Wstrząsaj energicznie przez 15 sekund.

Wirować przy 13 000 razy G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej przenieść 350 mikrolitrów górnej fazy wodnej do tej samej 1,5 mililitrowej probówki zbiorczej. Dodać 70 mikrolitrów roztworu octanu sodu i dobrze wymieszać.

Dodaj 700 mikrolitrów 100% izopropanolu. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut wirówki w temperaturze pokojowej w temperaturze 13 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supinat i dodać 500 mikrolitrów 75% etanolu do osadu Wirować próbki do wymieszania i odwirować pod ciśnieniem 5 000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć supernatant.

Plazmidowe DNA znajduje się w pastylce. Otwórz nakrętkę probówki i susz granulki na powietrzu o temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Granulka powinna stać się przezroczysta.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu TE do osadu DNA i podgrzewaj w temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby rozpuścić osad DNA. Na koniec zmierz absorbancję zawiesiny DNA przy 260 nanometrach i 280 nanometrach za pomocą spektrometru. Aby obliczyć stężenie DNA i ocenić jego jakość, surowe 2 6 4 0,7 komórek makrofagów ukrytych w DMEM uzupełniono 9% płodową surowicą cielęcą w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i pasażowano co dwa dni.

Podczas każdego pasażu należy zastąpić starą pożywkę mniejszą objętością świeżej pożywki i odłączyć komórki od płytki poprzez delikatne, ciągłe pipetowanie nasion. 1,5 do 2 milionów komórek na 10-centymetrowej kulturze tkankowej traktowanej na szalce jako materiał wyjściowy w dniu transfekcji nasion. 200 000 komórek na dołek.

Na 24-dołkowej płytce o objętości 500 mikrolitrów DMEM 9%FCS inkubować komórki przez cztery godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć tę procedurę, rozgrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej w ciemnym ciepłym rozgrzewce, pożywce wolnej od surowicy i DMEM 9% FCS do 37 stopni Celsjusza. Dodaj 0,5 mikrograma plazmidowego DNA do 50 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji końcówką pipety pod powierzchnią wiru cieczy na sześć sekund. Pozostaw mieszaninę odczynnika DNA w ciemności w temperaturze pokojowej na 30 minut. Podczas 30-minutowej inkubacji należy usunąć pożywkę z dołków płytki 24-dołkowej i dodać do każdej z nich 250 mikrolitrów świeżego DMEM 9% FCS.

Cóż, po 30 minutach włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Dodaj 250 mikrolitrów DMEM 9% FCS do mieszaniny odczynnika DNA i dobrze wymieszaj, oczyszczając W górę iw dół, dodaj 300 mikrolitrów rozcieńczonej mieszaniny do każdej studzienki inkubacji na 24-dołkowej płytce przez dwie do czterech godzin w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch do czterech godzinach usuń roztwór do transfekcji i dodaj 500 mikrolitrów DMEM 9% FCS inkubuj przez 24 do 48 godzin w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%.

Rozpocznij tę procedurę od rozgrzania pożywki wolnej od surowicy i DMEM 9% FCS do 37 stopni Celsjusza. Dodać 0,75 mikrolitra odczynnika do transfekcji do 18,75 mikrolitra wiru pożywki wolnej od surowicy w celu wymieszania i inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra jednego mikrograma na mililitr roztworu DNA do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji w inkubowanej temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Podczas 10-minutowej inkubacji usunąć pożywkę z każdej studzienki z płytki 24-dołkowej i dodać 250 mikrolitrów świeżego DMEM 9% FCS do każdego dołka po 10 minutach. Dodaj 250 mikrolitrów DMEM 9% FCS do mieszaniny odczynnika DNA. Dodać 270 mikrolitrów rozcieńczonej mieszaniny do każdego dołka inkubacji na 24-dołkowej płytce przez dwie do czterech godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po dwóch do czterech godzinach usuń roztwór do transfekcji i dodaj do każdego 500 mikrolitrów DMEM 9%FCS. Dobrze inkubować przez 24 do 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i procentowym dwutlenku węgla. 24 do 48 godzin po transfekcji komórki mogą być stymulowane i oznaczane pod kątem aktywności lucyferazy.

Zastąp pożywkę w każdym dołku 250 wersjami świeżego DMEM 9% FCS Dodaj 50 mikrouwolnień LPS lub LPS oraz cytokinę przeciwzapalną IL 10 w żądanych stężeniach do studzienek. Włóż płytkę do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza, stymulowaj przez dwie do sześciu godzin. Następnie usuń roztwór stymulujący przez aspirację.

Umyj komórki lodowatym PBS i dodaj do każdej z nich 200 mikrolitrów jednego x pasywnego buforu do lizy. Dobrze kołysz talerzem w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po 30 minutach zeskrob i przenieś lizat do 1,5 mililitrowych probówek i usuń resztki komórek, wirując 20 000 razy.

G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Przenieść 40 mikrolitrów klarownego lizatu do białego, klarownego. Dolna płytka 96-dołkowa mierzy sygnał Lucyfera za pomocą luminometru w całym spektrum światła widzialnego.

Zgodnie z protokołem producenta, analiza niskocytometryczna komórek transfekowanych plazmidem eksprymującym GFP wykazała, że odczynnik na bazie lipidów dał szybkość transfekcji około 25%, podczas gdy transfekcja na bazie poliamidu białka dała szybkość około 5%Różnicę w skuteczności transfekcji zaobserwowano również w sygnałach lucyfekazy w komórkach transfekowanych regionem promotorowym I capa b Zeta. Dodanie LPS zwiększyło sygnał lucyferazy świetlika. Zazwyczaj komórki są transfekowane plazmidem kontrolnym zawierającym gen lucyferazy run, a sygnały lucyferazy świetlika są normalizowane do sygnału lucyferazy ran.

Porównanie znormalizowanych sygnałów między próbkami niepoddanymi działaniu substancji i poddanymi działaniu substancji wykazało, że LPS zwiększa regulację, aktywność promotora reporterowego, a IL 10 hamuje działanie LPS. Porównanie długości czasu odpoczynku między transfekcją a stymulacją wykazało, że sygnały lucyferazy zmniejszają się z czasem, co tylko wpłynęło na interpretację danych. Gdy użyto odczynnika do transfekcji na bazie poliaminy białka do oceny wpływu każdej metody transfekcji na śmierć komórki, komórki barwiono aneksyną piątą i jodkiem propidyny i analizowano wyłącznie za pomocą cytometrii przepływowej.

Transfekcja oparta na lipidach nieznacznie zwiększyła proporcję pięciu dodatnich komórek aneksyny. Badanie immunologiczne wykazało, że transfekcja oparta na lipidach nieznacznie zwiększyła proporcję rozszczepionego białka polimerazy rybozy poli a DP. Podczas gdy transfekcja na bazie poli białka nie.

Pomimo podwyższonej liczby komórek apoptotycznych, morfologia komórek pod mikroskopem świetlnym nie uległa zmianie. Co ważniejsze, odpowiedź biologiczna transfekowanych komórek na bazie lipidów pozostała identyczna z odpowiedzią komórek niewyciętych, obie wytwarzały podobne ilości TNF alfa w odpowiedzi na LPS i były hamowane przez dodanie IL 10. TNF alfa nie został wyprodukowany, gdy komórki nie były stymulowane, co sugeruje, że komórki pozostają naiwne po transfekcji.

Po umyciu tego filmu użytkownik dobrze rozumie, jak tłumaczyć surowe komórki 2, 6, 4, 0,7 za pomocą Lucyfera zgłoszonego plazmy w minimalnie inwazyjny sposób, który nie zmienia natywnej odpowiedzi komórek.