Name: Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj metodę dostarczania białek do komórek ssaków za pomocą domen palców cynkowych Cys2-His2. Technika ta umożliwia efektywną transdukcję białek fluorescencyjnych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (DP1CA174426 Carlosa F. Barbasa) i ShanghaiTech University, Shanghai, China (do J.L.). Grafika molekularna została wygenerowana przy użyciu PyMol.

1. Klonowanie
<ol>
	<li>Uzyskaj podstawione alaniną dwupalcowe domeny ZiF, które zostały sklonowane do systemu wektorów ekspresyjnych pET-28 i są dostępne na żądanie (pET-2F-ZiF). Rozdział 34</li>
	<li>PCR amplifikuje EmGFP z plazmidu Emerald-pBAD za pomocą starterów 5' XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTGCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGCTGTTCAC-3'; Xma (Międzynarodowa Sieć TI strona pogrubiona) i 3' SacI-EmGFP (5'-CGGATCTGAGCTCTTACTTGTACAGCTCCATGCCGAG-3'; SacI strona pogrubiona).
	<ol>
		<li>Użyć 5 ng matrycy DNA, 10 μl 10x buforu polimerazy, 1 jednostki (U) polimerazy Taq DNA, 0,2 mM każdy dNTP i 0,2 μM każdego startera w roztworze o objętości 100 μl, a pozostała objętość składa się z wody destylowanej/dejonizowanej. Korzystaj z warunków jazdy na rowerze: 95 °C przez 5 minut; 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund i w temperaturze 72 °C przez 1 minutę; 72 °C przez 10 min. Oczyścić produkt PCR przez ekstrakcję żelem i oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru o wymiarach Abs260 x 50 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić pET-2F-ZiF i wkładkę kodującą EmGFP z enzymami restrykcyjnymi XmaI i SacI w zalecanym buforze przez 3 godziny w temperaturze 37 °C przy użyciu 10 U enzymu na 1 μg DNA. Wizualizacja DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego, takiego jak bromek etydyny.</li>
	<li>Oczyść strawione DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i oznacz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru o wymiarach Abs260 x 50 μg/ml.</li>
	<li>Zlikuluj oczyszczone DNA kodujące EmGFP do 50-100 ng pET-2F-ZiF za pomocą 1 U ligazy DNA T4 przez co najmniej 1 godzinę w RT. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy przeprowadzić reakcję ligacji, stosując stosunek trzonowców do liczby wstawek do wektora wynoszący 6:1.</li>
	<li>Rozmrozić 50 μl dowolnych chemicznie kompetentnych komórek XL-1 Blue Escherichia coli na lodzie i delikatnie wymieszać z 10-20 ng ligowanego pET-2F-ZiF-EmGFP.</li>
	<li>Przechowywać na lodzie przez 30 minut. Mieszaninę poddać szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 90 sekund i odzyskać komórki w 2 ml bulionu Super Optimal z represją kataboliczną (SOC) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl kultury odzysku na płytce agarowej z bulionu lizogenicznego (LB) z 50 μg/ml kanamycyny i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zaszczepić 6 ml kultury Super Bulion (SB) lub LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny jedną kolonią z płytki agarowej LB i wyhodować O/N w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Colony PCR przy użyciu starterów 5' XmaI-EmGFP i 3' SacI-EmGFP można użyć do identyfikacji pozytywnych klonów przed miniprepem.</li>
	<li>Oczyść pET-2F-ZiF-EmGFP przez miniprep i potwierdź plazmid przez sekwencjonowanie DNA przy użyciu promotora T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3').</li>
</ol>
2. Ekspresja i Oczyszczanie
<ol>
	<li>Rozmrozić 50 μl chemicznie kompetentnych komórek BL21 E. coli na lodzie i delikatnie wymieszać ze 100 ng plazmidu pET-2F-ZiF-EmGFP. Przekształć zgodnie z opisem w krokach 1.7-1.8.</li>
	<li>Następnego dnia zaszczepić 10 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny pojedynczą kolonią i wyhodować O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.</li>
	<li>Następnego dnia rozcieńczyć 10 ml kultury O/N w 1 l pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny, 0,2% glukozy i 100 μM ZnCl2. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem do gęstości optycznej 0,8 przy długości fali 600 nm (OD600) i indukować ekspresję białka za pomocą 2 mM izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Po 6 godzinach wzrostu w temperaturze 37 °C zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Warunki indukcji są bardzo zmienne i zależą od stabilności wyrażanych białek. Monitoruj OD600 co 30 minut, aż zostanie osiągnięty OD600 0.8.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM MgCl2, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) i 10 mM imidazol, pH 8,0). Lizuj ogniwa na lodzie za pomocą sonikacji z następującym ustawieniem: 50% mocy wyjściowej, 4-minutowy czas procesu z 5-sekundowymi interwałami włączenia/10-sekundowego wyłączenia. Unikaj przegrzania roztworu.</li>
	<li>Odwirować lizat komórkowy przy 25 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do świeżej probówki zbiorczej. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wykonaj wszystkie poniższe czynności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepuścić supernatant przez kolumnę uprzednio wypełnioną 1 ml zrównoważonej gnojowicy Ni-NTA. Przepłukać żywicę 20 ml buforu do przemywania (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 i 30 mM imidazolu, pH 8,0).</li>
	<li>Eluować białko za pomocą 5 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 i 300 mM imidazolu, pH 8,0).</li>
	<li>Wymienić buforowo eluowane białko z buforem spichrzowym (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 i 10% glicerolu, pH 8,0) i zagęścić białko do co najmniej 40 μM za pomocą koncentratora wirowego przez odwirowanie zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Określić stężenie białka za pomocą testu BCA lub Bradforda. Zmieszaj 2 μl oczyszczonych białek z 2 μl barwnika ładującego 2× SDS-PAGE, gotuj w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie rozpuść na 4%-20% Tris-Glycine SDS-PAGE w celu oceny czystości białka (Rysunek 2).</li>
</ol>
3. Magazynowanie białka
<ol>
	<li>Podwielokrotność zagęszczonego białka, błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C. W przypadku białek fuzyjnych EmGFP należy przykryć probówkę folią aluminiową, aby chronić białko przed światłem.</li>
	<li>Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania roztworu białkowego. Uwaga: Białka połączone z ZiF są stabilne w tych warunkach przez co najmniej 1 miesiąc. Niewłaściwe lub >4-miesięczne przechowywanie może prowadzić do wytrącania się białka lub fotowybielania EmGFP.</li>
</ol>
4. Transdukcja białek
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki HeLa w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Habitat (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego w temperaturze 37 °C w całkowicie nawilżonej atmosferze z 5% CO2, 
	Uwaga: Komórki pasażowane więcej niż 30 razy nie są zalecane do transdukcji białek.</li>
	<li>Wstępnie pokryć 24-dołkową płytkę 500 μl 50 μg/ml polilizyny przez 30-60 minut w temperaturze 25 °C. Komórki nasienne umieścić na 24-dołkowej płytce o gęstości 2 ×10,5 komórek na basenik. Po 24 godzinach od wysiewu lub gdy komórki zlewają się w 80%-90%, usuń pożywkę z każdej studzienki i przemyj 500 μl wstępnie podgrzanego DMEM bez surowicy (SFM).</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 250 μl SFM zawierającego 2 μM białka ZiF-EmGFP i 100 μM ZnCl2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Uwaga: Domeny ZiF dostają się do komórek głównie przez makropinocytozę,34 która jest mechanizmem zależnym od energii. Dlatego komórki muszą być inkubowane w temperaturze 37 °C w celu efektywnej internalizacji białek.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek i przemyć trzykrotnie 500 μl soli fizjologicznej (DPBS) Dulbecco, buforowanej fosforanem bez wapnia i magnezu, uzupełnionej 0,5 mg/ml heparyny. Uwaga: Heparyna jest niezbędna do usunięcia białka związanego z powierzchnią, które może komplikować dalsze analizy.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Powtórz zabiegi do trzech razy, aby usprawnić poród.</li>
	<li>Odizolować leczone komórki natychmiast po przepłukaniu heparyną przez trawienie 0,05% trypsyną-EDTA w temperaturze 37 °C przez 2 min. Ponownie zawiesić oderwane komórki w 0,5 ml DPBS uzupełnionego 1% FBS.</li>
	<li>Zmierzyć intensywność fluorescencji każdej próbki za pomocą cytometrii przepływowej35 przy użyciu kanału izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (rysunek 3). Dostosuj rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), aby umieścić populację zainteresowania na skali, zapewniając, że populacje o różnych właściwościach są od siebie oddzielane.</li>
	<li>Zbierz 10 000 zdarzeń na żywo dla każdej próbki i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej. 36 Normalizuj fluorescencję z komórek HeLa traktowanych ZiF-EmGFP do komórek traktowanych tylko SFM.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domain+delivery+of+therapeutic+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).</li>
<li>Lindsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+cell+delivery%3A+application+in+protein+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA delivery systems.</a> Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).</li>
<li>Guo, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+nonviral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in nonviral vectors for gene delivery.</a> Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55, 1189-1193 (1988).</li>
<li>Elliott, G., O'Hare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+trafficking+and+protein+delivery+by+a+herpesvirus+structural+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.</a> Cell. 88, 223-233 (1997).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).</li>
<li>Smith, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+cationic+cell-permeable+miniature+proteins+via+alpha-helical+arginine+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).</li>
<li>Daniels, D. S., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+cell-permeable+miniature+proteins+based+on+a+minimal+cationic+PPII+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).</li>
<li>Karagiannis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+biomimetic+cell+penetrating+peptide+library%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library.</a> ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).</li>
<li>Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+cell+penetrating+peptide+identified+using+a+plasmid+display-based+functional+selection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform.</a> ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+grafting+to+endow+cell+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Arginine grafting to endow cell permeability.</a> ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+delivery+of+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo+using+a+supercharged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.</a> ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).</li>
<li>Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery+to+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).</li>
<li>Zelphati, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+with+a+new+lipid-mediated+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.</a> J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Voelkel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+from+retroviral+Gag+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein transduction from retroviral Gag precursors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).</li>
<li>Sinha, V. R., Trehan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+microspheres+for+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable microspheres for protein delivery.</a> J. Control Release. 90, 261-280 (2003).</li>
<li>Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+TALEN+proteins+via+bioconjugation+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering.</a> PLoS One. 9, e85755(2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyarginine+as+a+multifunctional+fusion+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Polyarginine as a multifunctional fusion tag.</a> Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).</li>
<li>Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+protein+transduction+is+cell+type-dependent+and+is+enhanced+by+dextran+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate.</a> J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).</li>
<li>Al-Taei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+traffic+and+fate+of+protein+transduction+domains+HIV-1+TAT+peptide+and+octaarginine.+Implications+for+their+utilization+as+drug+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors.</a> Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cell-penetrating+peptide-mediated+peptide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.</a> Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188, 773-782 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+by+direct+delivery+of+zinc-finger+nuclease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins.</a> Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).</li>
<li>Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+zinc+finger+proteins%3A+the+advent+of+targeted+gene+regulation+and+genome+modification+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies.</a> Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in targeted genome editing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+human+proteins+that+deliver+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo.</a> Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+Cys2-His2+zinc-finger+domains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains.</a> ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).</li>
<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basics of flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).</li>
<li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li>
<li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Aart%2C+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide%2C+bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiono krok po kroku protokół dostarczania białka za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen palca cynkowego (ZiF). Domena ZiF nie zmniejsza aktywności skondensowanego ładunku enzymatycznego34; pozwala na produkcję i oczyszczanie białek w plonach prawie identycznych z tymi obserwowanymi w przypadku białka niemodyfikowanego; i może transportować białka i enzymy do szerokiego zakresu typów komórek z wydajnością przewyższającą tradycyjne peptydy penetrujące komórki lub systemy domen transdu...

Wysoce efektywne i wszechstronne strategie dostarczania białka są kluczowe dla wielu podstawowych badań i zastosowań terapeutycznych. Bezpośrednie dostarczanie oczyszczonych białek do komórek stanowi jedną z najbezpieczniejszych i najłatwiejszych metod osiągnięcia tego celu. 1,2 W przeciwieństwie do strategii, które opierają się na ekspresji genów z kwasów nukleinowych,3-5 dostarczanie białek nie stwarza ryzyka mutagenezy insercyjnej, jest niezależne od komórkowej maszynerii transkrypcji/translacji i pozwala na natychmiastowy efekt. Jednak brak prostych i dających się uogólnić metod nadawania białkom aktywności penetrującej komórki rutynowo zakłóca ich bezpośrednie wejście do komórek. Obecne metody ułatwiające wewnątrzkomórkowe dostarczanie białek opierają się na wykorzystaniu naturalnie występujących6-8 lub zaprojektowanych peptydów penetrujących komórki9-12, doładowanych domen transdukcji13,14, nanocząstek15 i liposomów,16 cząstek wirusopodobnych 17,18 i polimerowych materiałów mikrosferycznych. 19 Niestety, wiele z tych podejść jest utrudnionych przez niskie wskaźniki wychwytu komórkowego,20,21 słabą stabilność,22 niezamierzoną specyficzność typu komórki,23niskie właściwości ucieczki endosomalnej24 i toksyczność. 25 Ponadto wiele technologii transdukcji białek zmniejsza bioaktywność dostarczanych białek. 14
Nasze laboratorium wcześniej wykazało, że białka nukleazy palca cynkowego (ZFN) — chimeryczne endonukleazy restrykcyjne składające się z programowalnego białka wiążącego DNA Cys2-His 2 z palcami cynkowymi i domeny rozszczepienia endonukleazy restrykcyjnej FokI26-28 — są z natury przepuszczalne dla komórek. Wykazano, że ta zaskakująca aktywność penetrująca komórki jest wewnętrzną właściwością specjalnie zaprojektowanej domeny palca cynkowego, platformy wiążącej DNA, która pojawiła się jako potężne narzędzie do ukierunkowanej inżynierii genomu i uważana za wynik konstelacji sześciu dodatnio naładowanych reszt na powierzchni białka. Rzeczywiście, wykazano, że kilka białek wiążących DNA, w tym c-Jun i N-DEK, ma wrodzoną zdolność do przenikania przez błony komórkowe. 33 Niedawno nasze laboratorium rozszerzyło te wyniki i wykazało, że aktywność przenikania do komórek domen palca cynkowego (ZiF) może być wykorzystana do wewnątrzkomórkowego dostarczania białek. Genetyczna fuzja jedno- lub dwupalcowych domen ZiF z określonym ładunkiem białkowym doprowadziła do zwiększenia wydajności wychwytu, która przewyższyła wiele konwencjonalnych systemów dostarczania peptydów penetrujących komórki. 34 Przede wszystkim dostarczanie za pośrednictwem ZiF nie zagroziło aktywności skondensowanego ładunku enzymatycznego i ułatwiło wysokie poziomy dostarczania cytozolu. Podsumowując, odkrycia te pokazują potencjał domeny ZiF w zakresie ułatwiania wydajnego i łatwego dostarczania białek i potencjalnie bardziej zróżnicowanych typów makrocząsteczek do komórek.
Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku, jak wdrożyć technologię ZiF do dostarczania białek w komórkach ssaków. Wcześniej skonstruowaliśmy zestaw jedno-, dwu-, trzy-, cztero-, pięcio- i sześciopalcowych domen ZiF, które nie mają zdolności do wiązania DNA, ze względu na podstawienie każdej z reszt wiążących α-helisowe DNA, ale są zdolne do dostarczania białek do komórek34 (Figura 1). Opisano produkcję i transdukcję szmaragdowego GFP (EmGFP) do komórek HeLa przy użyciu dwupalcowej domeny ZiF. Protokół ten można rozszerzyć na prawie każde białko zdolne do rozpuszczalnej ekspresji w Escherichia coli i prawie każdym typie komórek ssaków. Przedstawiono oczekiwane wyniki, a także omówiono strategie maksymalizacji wydajności tego systemu.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiń system High Fidelity PCR</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine Mini żele białkowe, 1,5 mm, 10 dołków</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Bufor do próbek Laemmli</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Kompetentny E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan</td> <td>KanamycynyFisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Żywica agarozowa Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Technologie życia</td><td>płodu bydlęcego</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płaska płyta dolna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poli-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan heparanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>Ogniwa HeLa</td> Spektrofotometr <td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000&nbsp;</td><td>Zestaw do oczyszczania Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen cys2-his 2 palców cynkowych

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Ze względu na ich modułowość i możliwość przeprogramowania do rozpoznawania szerokiego zakresu sekwencji DNA, domeny wiążące DNA Cys2-His 2 palcami cynkowymi stały się użytecznymi narzędziami do ukierunkowanej inżynierii genomu. Podobnie jak wiele innych białek wiążących DNA, palce cynkowe mają również wrodzoną zdolność do przenikania przez błony komórkowe. Niedawno wykazaliśmy, że ta wewnętrzna przepuszczalność komórek może być wykorzystana do wewnątrzkomórkowego dostarczania białek. Genetyczna fuzja motywów palców cynkowych prowadzi do efektywnego transportu ładunku białek i enzymów do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W przeciwieństwie do innych technologii transdukcji białek, dostarczanie przez domeny palca cynkowego nie hamuje aktywności enzymów i prowadzi do wysokiego poziomu dostarczania cytozolowego. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący wdrożenia technologii palca cynkowego do dostarczania białek do komórek ssaków. Podkreślono kluczowe kroki w celu osiągnięcia wysokiego poziomu wewnątrzkomórkowego dostarczania za pośrednictwem palców cynkowych i omówiono strategie maksymalizacji wydajności tego systemu.

Białka fuzyjne ZiF-EmGFP z dwoma palcami mogą być ekspresowane w E. coli z homogenicznością &gt;95% i wysoką wydajnością (&gt;25 mg/ml) (Rysunek 2). Ogólnie białka fuzyjne ZiF z jednym i dwoma palcami mogą być produkowane w ilościach niemal identycznych jak w przypadku białka dzikiego typu niezmodyfikowanego. Jednak w niektórych kontekstach białka fuzyjne ZiF z pięcioma i sześcioma palcami nie mogą być produkowane z wydajnością wystarczającą dla dalszych zastosowań.
B...

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie sposobu wykorzystania domen palca cynkowego do dostarczania funkcjonalnych białek, takich jak zielone białko fluorescencyjne, do komórek ssaków. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie plazmidu ekspresyjnego zawierającego szmaragdowe zielone białko fluorescencyjne MGFP połączone translacyjnie z domenami palca cynkowego. Drugim krokiem jest ekspresja fluorescencyjnego białka fuzyjnego w bakteriach.Następnie komórki bakteryjne są lizowane, a fluorescencyjne białko fuzyjne zostaje oczyszczone. Ostatnim krokiem jest inkubacja komórek ssaczych z oczyszczonym fluorescencyjnym białkiem fuzyjnym w celu umożliwienia jego pobrania. Ostatecznie fluorescencję traktowanych komórek można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić efektywność dostarczania białka fuzyjnego do wnętrza komórek.Główną zaletą thief lub innych domen transdukcji białek, takich jak pochodzący z HIV peptyd tight lub poliarginina, jest możliwość ułatwienia wysokiego poziomu dostarczania do cytozolu bez upośledzenia aktywności enzymatycznego ładunku. Aby rozpocząć PCR, należy namnożyć sekwencję emerald GFP lub MGFP z plazmidu zgodnie z protokołem tekstowym, oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu, a następnie oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Następnie należy uzyskać wektor ekspresyjny PET 28 zawierający sekwencję alaniny.Przetrawiono wektor zawierający dwa palce cynkowe lub dwie domeny FZ oraz produkt MG F-P-P-C-R za pomocą enzymów restrykcyjnych XMA i SAC, stosując 10 jednostek enzymu na mikrogram DNA, a następnie inkubowano przetrawienia przez trzy godziny w temperaturze 37 °C. Fragmenty DNA oczyszczono metodą ekstrakcji z żelu i zmierzono stężenia wektora oraz produktu MG F-P-P-C-R. Wykorzystując spektrofotometr, połączono produkt MG F-P-P-C-R i od 50 do 100 nanogramów wektora w jednej probówce, zachowując molowy stosunek insertu do wektora wynoszący sześć do jednego.Następnie dodaje się 1 jednostkę ligazy DNA T4 i inkubuje reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby przeprowadzić transformację bakterii ligowanym plazmidem. Odmrozić 50 µL aliquotę chemicznie kompetentnych komórek E. coli na lodzie. Następnie delikatnie miesza się komórki z 100–20 ng ligowanego DNA i inkubuje komórki z DNA na lodzie przez 30 minut.Po inkubacji poddaj komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 90 sekund. Do probówki dodaj dwa mililitry pożywki SOC i pozwól komórkom regenerować się przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C przy potrząsaniu w celu selekcji transformantów. Wyjałowij 100 µL hodowli na płytkach z agarem LB zawierającym 50 µg/mL kanamycyny i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C.Zaszczep sześciomililitrową hodowlę LB zawierającą 50 µg/mL kanamycyny, wykorzystując wyizolowaną kolonię z płytki inkubowanej przez noc. Inkubuj hodowlę przez noc w temperaturze 37 °C przy potrząsaniu. Następnego dnia zbierz komórki i przeprowadź mini-prep w celu wyizolowania plazmidu, a następnie potwierdź obecność plazmidu poprzez sekwencjonowanie z użyciem primera.W przypadku promotora T7 plazmid powinien zawierać fuzję translacyjną na N-końcu dwóch domen FZ z MGFP. Aby rozpocząć oczyszczanie białka, najpierw należy przeprowadzić transformację komórek BL 21 equalize przy użyciu 100 nanogramów oczyszczonego plazmidu.Następnego dnia wyselekcjonuj transformanty na agarze LB z kanamycyną, a następnie zaszczep kulturę 10 ml pożywki LB z kanamycyną pojedynczą kolonią z płytki inkubowanej przez noc i inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 °C przy potrząsaniu; rozcieńcz całą kolonię z nocnej hodowli w jednym litrze pożywki LB uzupełnionej o kanamycynę, 0,2% glukozy oraz 100 µM chlorku cynku. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 °C przy potrząsaniu, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm równą 0,8, a następnie dodaj IPTG do stężenia końcowego 2 mM w celu indukcji ekspresji. Po sześciu godzinach indukcji odwiruj kulturę przy 5 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby zebrać komórki.Resuspend pellet komórkowy w pięciu mililitrach buforu do lizy, a następnie przeprowadź lizę komórek na lodzie poprzez sonikację, używając 50% mocy wyjściowej w cyklu pięć sekund włączone i dziesięć sekund wyłączone przez cztery minuty. Następnie odwiruj lizat komórkowy przy 25 000 ×g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a potem przenieś supernatant do nowej probówki kolekcjącej na lód. Aby oczyścić białko, nałóż supernatant na kolumnę upakowaną uprzednio jednym mililitrem zawiesiny kwasu octowego z niklem.Po przepuszczeniu supernatantu przez kolumnę, przemyj żywicę 20 mililitrami buforu do płukania. Eluuj białko z kolumny przy użyciu pięciu mililitrów buforu do elucji, a następnie przenieś roztwór do tuby dializacyjnej, przeprowadź dializę białka oraz buforu do przechowywania przez noc. Użyj koncentratora wirówkowego, aby skoncentrować białko do stężenia co najmniej 40 micromolar poprzez wirowanie przy 3000 ×g przez jedną godzinę.Wyznacz stężenie i czystość białka zgodnie z instrukcją zawartą w protokole tekstowym przed przechowywaniem. Alikwotuj 200 µL białka do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mL i owiń probówkę folią, aby chronić białka fuzyjne MGFP przed fotoblaknięciem. Następnie zamroź białko gwałtownie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C. W celu przygotowania do transdukcji białek, najpierw przygotuj doznania studni płytki 24-dołkowej, dodając 500 µL roztworu o stężeniu 50 µg/mL.Polilizynę przez 30 do 60 minut w temperaturze 25°C. Odessać roztwór z dołków przed wysianiem hodowli komórkowej. Inkubować komórki w pożywce DMM zawierającej 10% FBS oraz 1% antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% dwutlenkiem węgla.Zebierz komórki i zasiaj je na płytce 24-dołkowej z gęstością 200 000 komórek na dołek. Następnie umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze; po około 24 godzinach inkubacji, gdy komórki osiągną 80 do 90% konfluencji, odessaj medium z każdego dołka i przemyj komórki 500 µL podgrzanego medium pozbawionego surowicy lub SFM.Do każdego dołka dodaj 250 µL SFM zawierającego 2 µM białka Z-M-G-F-P oraz 100 µM chlorku cynku, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie odessij pożywkę z dołków i przemyj komórki trzykrotnie 500 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym bez jonów wapnia i magnezu (DPBS) uzupełnionej o 0,5 mg/mL heparyny. Następnie do dołków dodaj 200 µL 0,05% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez dwie minuty, aby odseparować komórki od płytki.Przenieś oddzielone komórki do nowej probówki i odwiruj przy 300 ×g przez pięć minut. Następnie resuspenduj komórki w 500 ml DPBS uzupełnionego o 1% FBS i zmierz średnią intensywność fluorescencji próbki metodą cytometrii przepływowej w kanale FITC, zgodnie z wcześniejszym opisem. Dostosuj rozproszenie przednie (forward scatter) i boczne (side scatter), aby umieścić badaną populację w skali.Następnie należy zastosować zdefiniowane bramkowanie w celu przeanalizowania próbek kontrolnych i badawczych. Należy zebrać 10 000 żywych zdarzeń na próbkę, a następnie wykorzystać oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej do przetworzenia danych. Należy znormalizować intensywność fluorescencji komórek traktowanych białkiem względem komórek traktowanych surowicą kontrolną.Białka fuzyjne Zif MGFP otrzymano w Escherichia coli, a następnie oczyszczono i przeanalizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Wyniki te wykazują, że białko fuzyjne ZIF MG FP z dwoma palcami zostało oczyszczone do jednorodności przekraczającej 95%. W przypadku poddania komórek HeLa działaniu zwiększających się stężeń białka fuzyjnego ZIFF MG FP.Wykazały one zależny od dawki wzrost średniej intensywności fluorescencji, zmierzonej za pomocą cytometrii przepływowej; kolejne traktowania białkiem fuzyjnym Z MG FP w stężeniu 2 µM doprowadziły do uzyskania niemal 100% komórek z fluorescencją MGFP. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać domeny transfekcyjne białek do dostarczania funkcjonalnych białek do komórek.

direct-protein-delivery-to-mammalian-cells-using-cell-permeable-cys2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezpośrednia dostawa białka do komórek ssaków za pomocą przenikających przez błony komórkowe domen Cys2-His2 z palcami cynkowymi

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

Opisujemy, jak dostarczać białka i nieprzepuszczalne dla komórek małe cząsteczki do hodowanych komórek ssaków za pomocą prostego protokołu koinkubacji z odczynnikiem, który powoduje nieszczelność organelli endocytarnych.

Dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dfTAT

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.

Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

To jest protokół do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko oparty na systemie pull-down biotyna-awidyna z nowością łączenia sekwencji penetrujących komórki. Główną zaletą jest to, że sekwencja docelowa jest inkubowana z żywymi komórkami, a nie z lizatami komórkowymi, a zatem interakcje będą zachodzić w kontekście komórkowym.

Biotynylowane peptydy penetrujące komórki do badania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko

Poznaj metodę dostarczania białek do komórek ssaków za pomocą domen palców cynkowych Cys2-His2. Technika ta umożliwia efektywną transdukcję białek fluorescencyjnych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys_2-his ₂ palców cynkowych

Przeglądaj więcej filmów