Name: Leczenie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV: skuteczność w walce z wysokim mianem bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę redukcji patogenów w produktach płytkowych krwi za pomocą rybo flawiny i światła UV. Technika skutecznie eliminuje bakterie przy zachowaniu jakości składników krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej:
<ol>
	<li>Z posiewu na płytce, w warunkach aseptycznych, zaszczep pojedynczą kolonię do sterylnej butelki o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej (Tabela 1), używając sterylnej pętli do szczepienia.</li>
	<li>Umieść butelkę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w odpowiednich warunkach (Tabela 1) na 1-2 dni, okresowo sprawdzając wzrost. Ustaw prędkość wytrząsania na 140 RPM.</li>
	<li>Aseptycznie przenieś zawiesinę bakteryjną do dwóch sterylnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml i wiruj probówki przy 3,000 x g przez 20 min w temperaturze 23 °C.</li>
	<li>Odsącz nadsącz i resuspenduj każdy osad bakteryjny w 15 ml sterylnej wody peptonowej. W razie potrzeby wymieszaj na wirówce typu Vortex. Połącz zawiesinę kultury bakterii w jednej probówce/pojemniku.</li>
	<li>Wyznacz miano kultury wyjściowej w trzech powtórzeniach zgodnie z sekcją 4, aby określić miano kultury wyjściowej.</li>
	<li>Przechowuj w lodówce do 2 tygodni w temperaturze 4 ± 2 °C do czasu użycia. Ponownie wyznacz miano kultury w momencie użycia, patrz krok 4.8.</li>
</ol>
2. Przygotowanie produktu płytkowego:
<ol>
	<li>Pobrać standardowy produkt płytek krwi człowieka z aferezy w akredytowanym banku krwi. Produkt płytek musi spełniać następujące specyfikacje pobrania: objętość 90–360 ml oraz stężenie 0,8–3,8 x 106 platelets/µl.
	<ol>
		<li>Upewnić się, że produkt płytek odpoczywał przez minimum 2 hr przed przetworzeniem w celu redukcji patogenów. Przechowywać produkty w temperaturze 22 ± 2 °C w inkubatorze do płytek bez agitacji przez te 2 hr. Po dwóch godzinach zapewnić agitację produktu płytek w temperaturze 22 ± 2 °C w inkubatorze do płytek. Wykorzystać produkt do 22 hr po pobraniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą strzykawki 3 ml pobrać próbkę 2 ml w celu pomiaru pH22C produktu płytek. Użyć analizatora gazometrii krwi, aby upewnić się, że produkt ma pH &gt;6,6. Tą samą próbkę wykorzystać do pomiaru stężenia płytek w produkcie za pomocą analizatora hematologicznego. Upewnić się, że produkt spełnia wymóg stężenia pobrania 0,80–3,8 x 106 platelets/µl.</li>
	<li>Wizualnie ocenić efekt wirowania (swirl) produktu płytek. Jeśli produkt wykaże wirowanie „0”, zostanie on odrzucony.</li>
	<li>Przytrzymać worek z płytkami pod bezpośrednim źródłem białego światła i krótko go ścisnąć. Wizualnie zaobserwować wzór wirowania próbki płytek. Ocenić produkt w następującej skali. 
	UWAGA: 2 – Wirowanie pozytywne: niejednorodność wirowania widoczna w całym worku z silnym kontrastem. 1 – Wirowanie pośrednie: pewna niejednorodność widoczna, ale tylko w kilku miejscach i z słabym kontrastem. 0 – Wirowanie negatywne: mętna jednorodność utrzymująca się przed i po ścisnięciu worka z płytkami.</li>
</ol>
3. Proces z użyciem ryboflawiny i światła UV:
<ol>
	<li>Przenieść produkt płytkowy do worka do naświetlania UV i przechowywania z ryboflawiną, używając sterylnego urządzenia do łączenia przewodów. Po transferze odciąć pusty worek do pobierania jednostek płytek za pomocą zgrzewarki do przewodów i zutylizować pusty worek jako odpad biologiczny.</li>
	<li>Wyjąć 35 ml woreczek z roztworem stokowym ryboflawiny o stężeniu 500 μM z ochronnej osłony przed światłem. Sterylnie połączyć zestaw do podawania ryboflawiny z linią wlotową worka do obróbki i przechowywania. Pozostawić zawartość do spłynięcia do jednostki płytek.</li>
	<li>Zawiesić zestaw składający się z woreczka z ryboflawiną oraz worka do obróbki i przechowywania za woreczek z ryboflawiną i delikatnie wypchnąć resztki powietrza z worka do obróbki i przechowywania do woreczka z ryboflawiną. Upewnić się, że niewielka ilość produktu płytkowego została również wypchnięta do woreczka z ryboflawiną, aby wypłukać pozostałą ryboflawinę do produktu płytkowego. Pozwolić roztworowi ryboflawiny i płytek spłynąć z powrotem do worka do obróbki i przechowywania, a następnie zacisnąć linię wlotową. Usunąć pusty worek z ryboflawiną za pomocą zgrzewarki do przewodów i zutylizować pusty worek jako odpad biologiczny.</li>
	<li>Sterylnie połączyć 6-calowy przewód z żeleźnym łącznikiem do strzykawki z linią wlotową worka do naświetlania i przechowywania. Przymocować korpus strzykawki o pojemności 10 ml (po usunięciu tłoka) do żeleźnego łącznika do strzykawki.</li>
	<li>Aseptycznie dodać 5 ml zawiesiny bakterii do korpusu strzykawki za pomocą pipety. Otworzyć zacisk na linii wlotowej i pozwolić bakteriom spłynąć do produktu płytkowego. Wypłukać korpus strzykawki, pozwalając części produktu płytkowego spłynąć z powrotem do korpusu strzykawki 10 ml. Usunąć korpus strzykawki 10 ml.</li>
	<li>Aseptycznie podłączyć strzykawkę 30 ml i przepłukać port wlotowy co najmniej dwa razy, aby upewnić się, że zawiesina bakterii została wymieszana z produktem płytkowym. Po dokładnym wymieszaniu produktu użyć czystej strzykawki 5-10 ml i pobrać 2 ml próbki przed obróbką. Używając nowej strzykawki, upewnić się, że usunięto wszelkie powietrze wprowadzone podczas etapu inokulacji lub pobierania próbek.
	<ol>
		<li>Wyznaczyć miano próbki przed obróbką zgodnie z sekcją 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odłączyć linię wlotową od worka do obróbki i przechowywania i zważyć produkt.</li>
	<li>Umieścić produkt w naświetlarzu i postępować zgodnie z poleceniami na ekranie, aby rozpocząć standardową obróbkę płytek.
	<ol>
		<li>Wprowadzić ID operatora.</li>
		<li>Zabezpieczyć i zamocować worek do płyty naświetlarza.</li>
		<li>Wprowadzić ID próbki do naświetlarza za pomocą czytnika kodów kreskowych lub klawiatury wprowadzania ręcznego.</li>
		<li>Zeskanować typ produktu.</li>
		<li>Zamknąć zacisk kwarcowy.</li>
		<li>Urządzenie naświetlające automatycznie dostarczy energię o wartości 6.24 J/ml. Typowy czas obróbki wynosi 5-10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po obróbce sterylnie połączyć 6-calowy przewód z żeleźnym łącznikiem do strzykawki z linią cebulki do pobierania próbek worka do obróbki i przechowywania. Upewnić się, że produkt jest dobrze wymieszany, a następnie podłączyć strzykawkę 5 ml i pobrać 2 ml próbki po obróbce.
	<ol>
		<li>Wyznaczyć miano próbki po obróbce zgodnie z sekcją 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Miano bakterii
<ol>
	<li>Oszacuj miano próbek przed i po zabiegu, a następnie przygotuj odpowiednią liczbę probówek do rozcieńczeń o pojemności 5 ml, niezbędnych do wykonania seryjnych rozcieńczeń końcowych dla każdej próbki. W sposób aseptyczny napełnij wymagane probówki 1,8 ml wody peptonowej.</li>
	<li>Wyznacz miano każdej próbki, stosując schemat dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych. W sposób aseptyczny przenieś 0,2 ml nierozcieńczonej próbki do pierwszej probówki z rozcieńczeniem (10-1). Wymieszaj zawartość probówki wirówką typu vortex, a następnie przenieś 0,2 ml do kolejnej probówki. Kontynuuj rozcieńczanie seryjne do osiągnięcia wymaganej liczby rozcieńczeń.
	<ol>
		<li>W sposób aseptyczny przenieś 100 µl każdego rozcieńczenia przeznaczonego do wysiewu na odpowiednią płytkę z agarem (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą sterylnego rozpylacza równomiernie rozprowadź próbkę na każdej płytce z agarem.</li>
	<li>Odwróć płytki do góry dnem i inkubuj w odpowiednich warunkach (Tabela 1) przez 1–2 dni, okresowo sprawdzając występowanie wzrostu.</li>
	<li>Olicz płytki zawierające od 30 do 300 kolonii. Płytki zawierające więcej niż 300 kolonii uznaje się za zbyt gęste do zliczenia (TNTC). Płytki zawierające mniej niż 30 kolonii uznaje się za znajdujące się poniżej granicy oznaczalności (LOQ).</li>
	<li>Oblicz miano każdej badanej próbki i zapisz wyniki jako CFU/ml.
	<ol>
		<li>Do obliczenia CFU/ml użyj następującego równania: 
		<img alt="Wzór na liczenie kolonii, metoda obliczania CFU, analiza mikrobiologiczna, schemat równania." fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Jeśli na płytce z najniższym rozcieńczeniem nie ma kolonii, użyj następującego równania do obliczenia granicy wykrywalności (LOD): 
		<img alt="Równanie N=log(P)/log(1-(v/V)); równowaga statyczna; wzór do analizy ciśnienia i objętości." fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
		oraz 
		<img alt="Wzór na granicę wykrywalności LOD=log(N/V), stosowany w równaniach chemii analitycznej." fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> 
		Gdzie: 
		N = najniższa liczba cząstek (CFU) w produkcie, która może zostać wykryta z pewnością. 
		P = prawdopodobieństwo, że mikroorganizm nie zostanie wykryty; dla 95% pewności wykrycia mikroorganizmu P = ,05. 
		V = całkowita objętość produktu w ml 
		v = objętość wysiana (ml) x stopień rozcieńczenia płytki</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku kontroli negatywnej wysiej 0,5 ml wody peptonowej użytej do rozcieńczeń seryjnych na każdą z dwóch płytek z agarem. Użyj tego samego rodzaju płytek co w przypadku badanych próbek. Odwróć płytki do góry dnem i inkubuj w odpowiednich warunkach przez 1–2 dni, okresowo sprawdzając występowanie wzrostu.
	<ol>
		<li>Jeśli na którejkolwiek z płytek z agarem zaobserwowany zostanie wzrost, użyta butelka wody peptonowej musi zostać utylizowana; wyniki badania zostają uznane za nieważne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku kontroli pozytywnej ponownie wyznacz miano użytej kultury bakterii. Odwróć płytki do góry dnem i inkubuj w odpowiednich warunkach przez 1–2 dni, okresowo sprawdzając występowanie wzrostu. Aby badanie zostało uznane za ważne, miano powinno wynosić ± 1,0 log CFU/ml w stosunku do zapisanego miana kultury wyjściowej (patrz sekcja 1.5).</li>
</ol>

<ol><li>Brecher, M. E., Hay, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+contamination+of+blood+components%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial contamination of blood components.</a> Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).</li>
<li>Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+bacteria+in+inoculated+platelets%3A+implications+for+bacteria+detection+and+the+extension+of+platelet+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage.</a> Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).</li>
<li>Cardo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+inactivation+of+Leishmania+donovani+infantum+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).</li>
<li>Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+inactivation+of+Trypanosoma+cruzi+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Apher.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).</li>
<li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+viral+risks+of+blood+and+blood+products%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Med%22%5BJournal%5D)">Current viral risks of blood and blood products.</a> Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).</li>
<li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+contamination+and+transfusion+safety%3A+experience+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Clin.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States.</a> Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).</li>
<li>Dumont, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+single-donor+apheresis+platelets+for+bacterial+contamination%3A+the+PASSPORT+study+results%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results.</a> Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).</li>
<li>Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laboratory+comparison+of+pathogen+reduction+technology+treatment+and+culture+of+platelet+products+for+addressing+bacterial+contamination+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns.</a> Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).</li>
<li>Greco-Stewart, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serratia+marcescens+strains+implicated+in+adverse+transfusion+reactions+form+biofilms+in+platelet+concentrates+and+demonstrate+reduced+detection+by+automated+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture.</a> Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).</li>
<li>Keil, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Plasmodium+spp.+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).</li>
<li>Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+transfusion+of+cellular+blood+components+in+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada.</a> Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).</li>
<li>Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+years%27+experience+of+using+the+BacT%2FALERT+system+to+screen+all+platelet+concentrates%2C+and+additional+testing+of+outdated+platelet+concentrates+to+estimate+the+frequency+of+false-negative+results%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Six years' experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results.</a> Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).</li>
<li>Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+Biological+Mechanisms+of+Pathogen+Reduction+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies.</a> Photochem. Photobiol. , (2014).</li>
<li>Murphy, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+platelet+concentrates+for+bacterial+contamination%3A+low+numbers+of+bacteria+and+slow+growth+in+contaminated+units+mandate+an+alternative+approach+to+product+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety.</a> Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).</li>
<li>Brien, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+incidence+and+residual+risk+of+HIV%2C+HBV+and+HCV+at+Canadian+Blood+Services%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services.</a> Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).</li>
<li>Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+platelets+for+bacterial+contamination+at+the+Welsh+Blood+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med%22%5BJournal%5D)">Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service.</a> Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).</li>
<li>Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+universal+point-of-issue+assay+for+bacterial+detection+in+buffy+coat+platelet+components%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components.</a> Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).</li>
<li>Reddy, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+testing+of+a+novel+riboflavin-based+technology+for+pathogen+reduction+and+white+blood+cell+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation.</a> Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).</li>
<li>Ruane, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+inactivation+of+selected+viruses+and+bacteria+in+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+light%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light.</a> Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).</li>
<li>Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system+against+Babesia+microti+in+apheresis+platelets+and+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma.</a> Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).</li>
<li>Vanlandingham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+inactivation+of+chikungunya+virus+in+plasma+and+platelets+using+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system.</a> Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).</li>
<li>Walther-Wenke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+bacterial+contamination+of+blood+components+in+Germany%3A+effect+of+contamination+reduction+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures.</a> Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy tego artykułu są obecnie zatrudnieni przez Terumo BCT, twórcę i producenta systemu Mirasol PRT. Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez Terumo BCT.

Badania przesiewowe na obecność bakterii stały się powszechną praktyką w bankach krwi, a w wielu miejscach służą jako podstawowa metoda zapobiegania transfuzji płytek krwi skażonych bakteriami. Chociaż badania przesiewowe bakterii zazwyczaj blokują większość szybko rosnących bakterii Gram-ujemnych, takich jak S. marcescens, E. coli i E. cloacae, mają trudności z wykryciem wolno rosnących bakterii Gram-dodatnich, takich jak S. aureus, Streptococcus spp. i S. epidermidis8. Niestety, te trzy bakterie Gram-dodatnie są zaangażowane w ponad 50% wszystkich skażonych jednostek płytek krwi, a transfuzja produktów płytkowych zawierających te trzy organizmy doprowadziła do śmiertelności pacjentów1.
Badania przesiewowe bakterii opierają się na tym, że miano bakterii w produkcie płytkowym jest wystarczająco wysokie, aby co najmniej jeden organizm znajdował się w typowej próbce przesiewowej o objętości 4-8 ml. Jeśli miano bakterii nie jest wystarczająco wysokie, aby bakteria mogła zostać wychwycona w próbce o objętości 4-8 ml, urządzenie jest nieprawidłowo oznaczane jako ujemne i jest zwalniane do transfuzji. Alternatywnym podejściem do badań przesiewowych bakterii może być zastosowanie proaktywnego procesu, który można przeprowadzić na wszystkich jednostkach płytek krwi i który może spowodować, że organizmy zanieczyszczające staną się niefunkcjonalne.
W tym badaniu wysokie miana bakterii zostały celowo dodane do jednostek płytek krwi, aby przetestować całkowitą zdolność redukcji procesu redukcji ryboflawiny i patogenów światłem UV. Chociaż obciążenia bakteryjne testowane w tym badaniu znacznie przewyższają te, które normalnie występują w produktach krwiopochodnych w momencie dawstwa, badanie to pomaga wykazać, że proces ryboflawiny i światła UV jest w stanie znacznie obniżyć miano żywych bakterii w zanieczyszczonej jednostce płytek krwi o 2,6 do 5,4 log (99,7-99,9996% redukcja bakterii skażających) (Rysunek 2). Aby uzyskać dokładną wartość redukcji logarytmu, niezwykle ważne jest, aby operator posiadał dobrą technikę aseptyczną oraz precyzyjne umiejętności pipetowania podczas wykonywania etapów miana bakterii. Nieprecyzyjne pipetowanie podczas seryjnych rozcieńczeń może prowadzić do nawarstwiania się błędów, a tym samym do niedokładnego pomiaru miana.
Dane zebrane w tym badaniu potwierdzają wcześniejsze prace nad ryboflawiną i światłem UV, które stanowiły wyzwanie dla systemu w walce z bakteriemią o niskim poziomie, klinicznie istotną (<20 CFU/jednostkę). Poprzednie badanie miało na celu naśladowanie rzeczywistego zdarzenia zanieczyszczenia klinicznego, a wyniki wykazały, że ryboflawina i światło UV skutecznie zapobiegały rozwojowi bakterii w ciągu 7-dniowego okresu przechowywania płytek krwi. Modelowanie oparte na danych z poprzedniego badania sugeruje, że obecne szacunki ryzyka zanieczyszczenia bakteryjnego produktów płytkowych mogą zostać zmniejszone nawet o 98% w stosunku do obecnych poziomów8. Proces leczenia ryboflawiną i światłem UV wypada korzystnie w porównaniu z badaniami przesiewowymi bakterii, które wykazały jedynie 66% skuteczność w wykrywaniu zanieczyszczeń bakteryjnych w jednostkach płytek krwi w przypadku wyzwania z klinicznie istotnym obciążeniem bakteryjnym8.
Podobnie jak w przypadku wszystkich technologii, leczenie PRT produktów płytkowych w celu zapobiegania powikłaniom związanym z zanieczyszczonymi bakteryjnie jednostkami płytkowymi ma swoje ograniczenia. Systemy PRT nie są skuteczne przeciwko przetrwalnikom bakterii i nie dezaktywują endotoksyny, więc nawet jeśli system PRT może dezaktywować wysokie miana bakterii Gram-ujemnych, pozostała endotoksyna może nadal powodować wstrząs septyczny u biorcy. PRT najlepiej wykonywać na wczesnym etapie przechowywania, zanim bakterie będą mogły rozprzestrzenić się do wysokich mian.
Podsumowując, jak wykazano w połączeniu tych dwóch badań, proces ryboflawiny i światła UV skutecznie zmniejsza obciążenie bakteryjne zarówno organizmów Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich i może stanowić realną alternatywę dla badań przesiewowych bakterii. Rutynowe traktowanie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV ma również dodatkową zaletę w postaci zmniejszenia potencjalnej transmisji innych czynników przenoszonych przez krew, takich jak wirusy i pasożyty.

Transfuzja płytek krwi, osocza, krwinek czerwonych i produktów z krwi pełnej odgrywa ważną rolę w nowoczesnej medycynie i może być stosowana do leczenia różnych schorzeń, zastępowania płynów niezbędnych do życia i ostatecznie ratowania życia. Płytki krwi są produktem komórkowym, który jest izolowany z krwi pełnej i łączony w dawkę nadającą się do transfuzji lub jest pobierany w procesie aferezy płytek krwi. Główną rolą płytek krwi w organizmie jest zatrzymanie krwawienia w miejscach ran i pomoc w utrzymaniu hemostazy. Pacjenci cierpiący na małą liczbę komórek płytkowych (małopłytkowość) są podatni na spontaniczne krwawienia i przetacza się im płytki krwi w celu przywrócenia liczby komórek krwiowych do normalnego zakresu. Pobrane płytki krwi są przechowywane maksymalnie przez 5-7 dni i są przechowywane w temperaturze 22 ± 2 °C w ciągłym mieszaniu.
Pomimo ratujących życie właściwości transfuzji płytek krwi, nadal istnieje niewielkie ryzyko dla osób otrzymujących transfuzję z powodu zanieczyszczenia tych produktów przez pasożyty, bakterie i wirusy11. Wdrożenie testów na obecność wirusowych kwasów nukleinowych (NAT) znacznie zmniejszyło ryzyko przenoszenia głównych czynników przenoszonych przez krew, takich jak wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) i ludzki wirus niedoboru odporności (HIV)5. Niedawna publikacja Kanadyjskiej Służby Krwi szacuje, że ryzyko szczątkowe dla tych czynników wynosi 1 na 8 milionów donacji w przypadku HIV, 1 na 6,7 miliona donacji w przypadku HCV i 1 na 1,7 miliona donacji w przypadku HBV15.
Chociaż bakterie zazwyczaj przyciągają mniej uwagi ogółu społeczeństwa, częstotliwość skażenia bakteryjnego w produktach płytkowych została oszacowana na tak wysoką jak 1:1,0007 i ponieważ miliony produktów płytkowych są przetaczane każdego roku, wielu biorców jest narażonych na potencjalnie zagrażające życiu powikłania, takie jak sepsa6. Badania sugerują, że obciążenie bakteryjne w momencie zanieczyszczenia jest niskie, <100 jednostek tworzących kolonie (CFU)/produkt2,16, jednak bogate w składniki odżywcze środowisko i przechowywanie w temperaturze pokojowej pozwala zanieczyszczającym bakteriom namnażać się do niebezpiecznie wysokich mian przed transfuzją. Obecnie jedynymi zatwierdzonymi dostępnymi metodami zapobiegania przedostawaniu się produktów skażonych bakteryjnie do biorcy płytek krwi jest stosowanie systemów opartych na hodowlach i szybkich testów w miejscu opieki nad pacjentem. Krótko mówiąc, w przypadku systemów opartych na hodowlach produkty płytkowe są przechowywane na mieszadle w temperaturze 22 °C przez 12-24 godziny, aby umożliwić namnażanie się bakterii w produkcie, po czym z produktu płytkowego usuwa się próbkę o objętości 4-8 ml i zaszczepia się w butelce zawierającej pożywkę. Butelkę umieszcza się w urządzeniu, które monitoruje butelkę pod kątem rozwoju bakterii. Jeśli przyrząd wykryje wzrost bakterii w butelce, zostanie on oznaczony, a odpowiednia jednostka płytek krwi zostanie wyrzucona. Chociaż proces ten jest dość skuteczny w wykrywaniu szybko rosnących organizmów, wiele wolno rosnących gatunków nie osiąga wystarczająco wysokiego miana, aby można je było wykryć, co stwarza możliwość uwolnienia jednostek fałszywie ujemnych do transfuzji7,12,14,16,22. W przeciwieństwie do systemów wykrywania opartych na hodowlach, szybkie testy w miejscu opieki nad pacjentem są zwykle wykonywane w późniejszym okresie przechowywania płytek krwi, gdy obciążenie bakteryjne znacznie wzrosło. Wyższe miana są wymagane, ponieważ testy przyłóżkowe są mniej czułe niż systemy oparte na hodowlach i niezawodnie wykrywają bakterie dopiero po osiągnięciu miana ≥1 x 103 jtk/ml17. Jednak takie testy mogą dostarczyć wyniki w ciągu 1 godziny od pobrania próbki. Zmienność w wykonywaniu tych testów doprowadziła do uwolnienia fałszywie ujemnego produktu, powodując śmiertelną reakcję septyczną u biorcy9.
Alternatywnym sposobem walki z problemem zanieczyszczenia bakteryjnego produktów płytkowych jest rutynowe stosowanie procesu redukcji patogenów, który może dezaktywować bakterie skażające zamiast próbować je wykryć. Wykazano, że stosowanie ryboflawiny jako fotouczulacza w połączeniu ze światłem UV zmniejsza zakaźność szerokiej gamy patogennych zanieczyszczeń przenoszonych przez krew, w tym bakterii3,4,8,10,19-21. Stosowanie ryboflawiny i światła UV do redukcji patogenów jest nietoksyczne i niemutagenne, a wykazano, że składniki poddane działaniu ryboflawiny i światła UV są bezpieczne dla biorców transfuzji, a także dla osób mających do czynienia z produktami krwiopochodnymi18. Krótko mówiąc, cząsteczki ryboflawiny mogą łączyć się z kwasami nukleinowymi (DNA i RNA) bakterii, pasożytów, wirusów i wszelkich komórek jądrzastych (np. białych krwinek). Ekspozycja na światło UV aktywuje ryboflawinę, powodując chemiczną zmianę grup funkcyjnych kwasów nukleinowych (głównie zasad guaninowych), zapobiegając w ten sposób replikacji i/lub transkrypcji kwasów nukleinowych i pozostawiając organizm w stanie inaktywowanym13. Komórki jądrzaste, takie jak płytki krwi i czerwone krwinki, nie są dotknięte chemią ryboflawiny z powodu braku kwasu nukleinowego.
Poprzednia praca z technologią ryboflawiny i światła UV oceniała wybraną grupę bakterii za pomocą eksperymentalnego projektu mającego na celu naśladowanie produktu płytkowego zanieczyszczonego klinicznie istotnym obciążeniem bakteryjnym (<20 CFU/produkt)8. Celem tego badania była ocena procesu leczenia ryboflawiną i światłem UV w odniesieniu do zanieczyszczenia bakteryjnego o wysokim mianie (>1,0 x 105 CFU/ml) w produktach płytkowych traktowanych osoczem w celu zmierzenia całkowitej zdolności redukcyjnej bakterii w systemie. Na podstawie danych zebranych w badaniach hemovigilance1 do oceny w tym badaniu wybrano panel powszechnie występujących organizmów Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, który obejmował następujące gatunki: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica, Brucella neotomae, Bacillus cereus (forma wegetatywna), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae. Wszystkie organizmy, z wyjątkiem B. cereus, uzyskano z ATCC, a priorytetem było uzyskanie szczepów bakteryjnych, które zostały zidentyfikowane jako wyizolowane ze składników krwi. B. cereus testowany w tym badaniu jest szczepem klinicznym wyizolowanym wewnętrznie z zanieczyszczonego produktu płytkowego.

<table><tbody><tr><td>Mirasol Illuminator</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mirasol Torba do leczenia/przechowywania</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Analizator hematologiczny</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Ac&bull; T różnica&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analizator parametrów krytycznych</td><td>Siemens</td><td>RapidLab 1265&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne urządzenie dokujące</td> Inkubator płytkowy <td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Helmer</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator orbitalny Shaker</td><td>Lab-Line</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>Suchy inkubator</td><td>Fisher</td><td>Iso-temp</td><td></td></tr><tr><td>Class II A/B3 Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo-forma</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz do rurek</td><td>Sebra</td><td></td> Wirówka stołowa Smart Sealer II <td></td></tr><tr><td></td><td>IEC</td><td>Centra GP8R</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do rozcieńczania 5 ml</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Rainin</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokrotna</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &micro; l Końcówka filtra</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 &micro; M Ryboflawina</td><td>Terumo BCT</td><td>35 ml 500 &mikro; M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brucella Agar z 5% krwią końską</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>Napar z serca mózgu</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>Woda peptonowa</td><td>BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>Tryptykaza Rosół sojowy</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>Tryptykaza Agar sojowy</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowane termicznie serum końskie</td><td>Gibco</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

leczenie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem uv: skuteczność w walce z wysokim mianem bakterii

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Zanieczyszczenie płytek krwi przez bakterie od dawna jest uznawane za poważne ryzyko transfuzji ze względu na warunki ich przechowywania po oddaniu krwi. Produkty są rutynowo przechowywane w temperaturze 22 °C na mieszającym wytrząsarce, co może sprzyjać rozwojowi bakterii. Chociaż całkowita liczba bakterii, które mogą zostać wprowadzone do produktu płytkowego, jest bardzo niska, bakterie te mogą namnażać się do bardzo wysokiego miana przed transfuzją, co może prowadzić do poważnych zdarzeń niepożądanych. Celem tego badania była ocena procesu redukcji patogenów opartego na ryboflawinie w odniesieniu do panelu bakterii, które zostały zidentyfikowane jako powszechne zanieczyszczenia produktów płytkowych. W skład panelu wchodziły następujące organizmy: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa i K. pneumoniae. Każda jednostka płytek krwi została zaszczepiona dużym ładunkiem bakteryjnym, a próbki pobrano zarówno przed, jak i po leczeniu. Test tworzenia kolonii, wykorzystujący schemat rozcieńczania punktu końcowego, zastosowano do określenia miana bakterii przed i po zabiegu. Redukcję logarytmiczną obliczono poprzez odjęcie miana po zabiegu od miana przed zabiegiem. Zaobserwowano następujące redukcje logarytmu: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) i K. pneumoniae 2,8 log (99,8%). Wyniki tego badania sugerują, że proces ten może pomóc w obniżeniu ryzyka poważnych niepożądanych zdarzeń transfuzji związanych z zanieczyszczeniem bakteryjnym.

Redukcję jedenastu różnych gatunków bakterii oceniono przy użyciu procesu PRT opartego na ryboflawinie i świetle UV. Agenci ci reprezentują niektóre z najczęstszych zanieczyszczeń produktów płytkowych i obejmują pięć organizmów Gram-dodatnich oraz sześć Gram-ujemnych. Dla każdego organizmu oceniono co najmniej sześć produktów płytkowych, a każdy produkt zaszczepiono taką ilością bakterii, aby uzyskać końcowy miano bakterii w produkcie płytkowym &gt;1.0 x 105 CFU/ml. Przed zabiegiem pobrano próbkę w celu określenia miana przed zabiegiem, po czym produkt płytkowy niezwłocznie poddano procesowi z użyciem ryboflawiny i UV. Po potraktowaniu produktów płytkowych zaobserwowano następujące redukcje logarytmiczne: S. epidermidis 4.7 log (99.998%), S. aureus 4.8 log (99.998%), S. mitis 3.7 log (99.98%), S. pyogenes 2.6 log (99.7%), S. marcescens 4.0 log (99.99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99.95%), B. neotomae 5.4 log (99.9996%), B. cereus 2.6 log (99.7%), E. coli ≥ 5.4 log (99.9996%), P. aeruginosa 4.7 log (99.998%) oraz K. pneumoniae 2.8 log (99.8%) (Rycina 2). Wszystkie jednostki spełniły specyfikacje systemu określone powyżej dla procesu z użyciem ryboflawiny i UV. Dodatkowe testy redukcji przeprowadzono z S. pyogenes przy użyciu płytek pochodzących z warstwy leukocytarnej (buffy coat). Nie zaobserwowano istotnej różnicy w redukcji S. pyogenes w płytkach pochodzących z warstwy leukocytarnej w porównaniu z płytkami z aferezy (dane nie przedstawiono).
<img alt="Tabela warunków wzrostu drobnoustrojów; zawiera organizm, numer ATCC, typ Grama, pożywkę i inkubację." src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Warunki wzrostu gatunków bakterii ocenianych z wykorzystaniem ryboflawiny i światła UV. Do badania wybrano panel bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, o których wykazano, że zanieczyszczają produkty płytkowe. Przedstawiono warunki wzrostu (temperaturę i rodzaj pożywki) zastosowane do namnażania i miareczkowania organizmów.
<img alt="Schemat procesu sterylizacji krwi; traktowanie ryboflawiną i UV; etapy przygotowania do transfuzji." src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Proces redukcji patogenów za pomocą ryboflawiny i światła UV. Ryboflawinę rozpuszczono w 0,9% soli fizjologicznej do nominalnego stężenia 500 µM. Roztwór wprowadzono sterylnie do każdego produktu płytkowego. Do każdej jednostki płytek aseptycznie dodano bakterie, a następnie poddano je działaniu energii UV o wartości 6,2 J/ml (około 6–10 min). W tym badaniu in vitro pobrano próbki z jednostki płytek po traktowaniu w celu określenia końcowego miana bakterii.
<img alt="Wykres redukcji bakterii; traktowanie ryboflawiną i promieniowaniem UV, dane dotyczące redukcji log10, porównanie różnych gatunków." src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Redukcja różnych gatunków bakterii po traktowaniu ryboflawiną i światłem UV. Ryboflawiny i światła UV użyto do redukcji ładunku bakteryjnego typowych zanieczyszczeń bakteryjnych produktów płytkowych. Redukcja log10 to różnica między średnim mianem przed traktowaniem a średnim mianem po traktowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Warunki przechowywania produktów płytkowych tworzą idealne środowisko do namnażania się zanieczyszczeń bakteryjnych do niebezpiecznych poziomów. Celem tego badania było wykorzystanie testu tworzenia kolonii do oceny procesu redukcji patogenów opartego na ryboflawinie w stosunku do zanieczyszczenia bakteryjnego o wysokim mianie w ludzkich produktach płytkowych.

Leczenie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV: skuteczność w walce z wysokim mianem bakterii

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena redukcji powszechnych zanieczyszczeń bakteryjnych w produktach płytkowych przy użyciu procesu redukcji patogenów opartego na ryboflawinie i promieniowaniu UV. Cel ten realizowany jest poprzez przygotowanie zapasu bakterii o wysokim mianie, a w drugim kroku poprzez pozyskanie ludzkiego produktu płytkowego i ocenę jakości komórek w jednostce.Następnie jednostkę płytek krwi podaje się ryboflawinę i inokuluje znanym stężeniem bakterii. Ostatnim krokiem jest naświetlanie jednostki światłem UV. Ostatecznie redukcję bakterii mierzy się poprzez porównanie próbek sprzed i po traktowaniu pod kątem liczby żywych bakterii, wyznaczanej za pomocą końcowego testu siewu metodą rozcieńczeń.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przesiewowe badania bakteriologiczne, jest fakt, że ryboflawina i światło UV mogą inaktywować inne patogeny, takie jak H-I-V-H-C-V, malarię i Babesia. Znaczenie tej technologii wykracza poza patogeny przenoszone przez krew, ponieważ jest ona również zdolna do inaktywacji leukocytów oraz donowanych produktów krwi. Są one powiązane z niepożądanymi zdarzeniami potransfuzyjnymi, takimi jak transfuzyjna choroba przeszczep przeciw gospodarzowi.Pomysł wykorzystania tej metody do inaktywacji patogenów we krwi pojawił się u mnie podczas badań nad oddziaływaniem związków, a konkretnie związków fotochemicznych, z kwasami nukleinowymi. Technika ta wykorzystuje fakt, że patogeny, w przeciwieństwie do erytrocytów, płytek krwi i białek osocza, zawierają genomowe kwasy nukleinowe, które są niezbędne do replikacji i przenoszenia choroby. Dzięki zatem celowaniu w chemię kwasów nukleinowych w środowisku obecnych produktów krwi, możemy w sposób bardziej selektywny inaktywować patogeny, zachowując jednocześnie jakość składników erytrocytów, płytek krwi i białek osocza. Prezentacja procedury.Dzisiaj wystąpią Nick HOA, naukowiec laboratoryjny oraz Denise Gilmore, technik laboratoryjny. Najpierw przygotuj sterylną butelkę o pojemności 250 ml zawierającą 100 ml pożywki wzrostowej specyficznej dla badanej bakterii. Używając sterylnej pętli do szczepienia, przenieś pojedynczą kolonię bakteryjną z płytki z posiewem kreskowym do pożywki.Następnie umieść butelkę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną. Ustaw prędkość wytrząsania na 140 RPM i inkubuj kulturę przez jeden do dwóch dni. Okresowo sprawdzaj kulturę pod kątem wzrostu bakterii.Po inkubacji przenieś zawiesinę bakteryjną do dwóch sterylnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Wirowarkuj probówki z prędkością 3000 ×g przez 20 minut w temperaturze 23 °C. Następnie odessaj nadsącz i resuspenduj osad bakteryjny w 15 ml sterylnej wody peptydowej.Wymieszaj probówki na wortexie, aby wspomóc resuspensję, a następnie połącz resuspensowane kultury bakterii w celu zagęszczenia kultury wyjściowej. Napełnij probówki do rozcieńczeń o pojemności pięciu mililitrów 1,8 mililitrami wody peptydowej. Przenieś 200 µL nierozcieńczonej próbki do pierwszej probówki, wymieszaj ją na wortexie, a następnie przenieś 200 µL do kolejnej probówki.Powtarzać do momentu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia. Przenieść 100 µL każdego rozcieńczenia na odpowiednią płytkę agarową. Za pomocą sterylnego rozpylacza równomiernie rozprowadzić próbkę po całej powierzchni agaru. W przypadku płytki do kontroli negatywnej postąpić analogicznie.Nanieś 500 µL wody peptydowej na dwie płytki z agarem. Używając sterylnego rozpylacza do komórek, równomiernie rozprowadź próbkę po całej powierzchni agaru, odwróć wszystkie płytki i inkubuj je w odpowiedniej temperaturze przez jeden do dwóch dni. Jeśli na którejkolwiek z płytek kontroli negatywnej zaobserwowano wzrost, oznacza to, że woda peptydowa jest zanieczyszczona, a miano jest nieważne.Jeśli płytki kontroli negatywnej są ujemne, należy zliczyć kolonie na wszystkich płytkach, na których znajduje się od 30 do 300 kolonii. Następnie oblicza się miano każdej próbki badawczej i zapisuje wyniki w postaci liczby jednostek na mililitr. Kultury bakterii należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.W celu zapewnienia dokładności należy ponownie oznaczyć miano hodowli przed użyciem. Należy pozyskać standardowy preparat płytek krwi ludzkich z aferezy o objętości od 90 do 360 ml i stężeniu od 0,80 do 3,8 mln płytek na µL. Worki należy pozostawić na co najmniej dwie godziny w inkubatorze do płytek krwi w temperaturze 22 °C, a następnie delikatnie mieszać przy 60 RPM aż do momentu użycia.Pobierz próbkę 2 mL produktu płytkowego i za pomocą analizatora gazometrii krwi w temperaturze 22 °C upewnij się, że pH wynosi powyżej 6,6. Z tej samej próbki zmierz stężenie płytek za pomocą analizatora hematologicznego, aby upewnić się, że mieści się ono w pożądanym zakresie. Następnie dokonaj oceny wizualnej worka z płytkami, trzymając go pod bezpośrednim białym źródłem światła.Krótko ściśnij worek i zaobserwuj wirowy wzór próbki. Jeśli przed i po ściśnięciu worka utrzymuje się mętna homogeniczność, nie należy używać tych płytek krwi z urządzeniem do dokowania cewki. Przenieś płytki krwi do worka przeznaczonego do naświetlania światłem UV i ryboflawiną oraz do przechowywania.Usuń pusty worek z płytkami krwi za pomocą zgrzewarki do drenów i zutylizuj go jako odpad biologiczny. Następnie zdejmij ochronną osłonę chroniącą przed światłem ze sterylnego roztworu stokowego ryboflawiny o stężeniu 500 micromolar. Połącz woreczek z ryboflawiną z linią wlotową worka do traktowania i przechowywania, a następnie przelej jego zawartość do jednostki z płytkami krwi.Następnie zawieś zestaw obejmujący worek i torbę do zabiegu na worku z ryboflawiną. Delikatnie wypchnij resztki powietrza z torby do zabiegu do worka z ryboflawiną. Przepłucz pozostałości ryboflawiny do worka z płytkami, używając niewielkiej ilości produktu płytkowego.Pozwolić roztworowi ryboflawiny i płytek krwi spłynąć z powrotem do worka z preparatem. Następnie zakleszczyć linię doprowadzającą. Usunąć pusty worek z ryboflawiną za pomocą zgrzewarki do drenów i zutylizować pusty worek w odpowiedni sposób. Sterylnie.Podłącz sześciocalową linię rurkową z żeleźnym złączem do strzykawki do linii wlotowej worka do oświetlania i przechowywania. Do linii rurkowej przymocuj cylinder strzykawki o pojemności 10 ml. Następnie do cylindra strzykawki dodaj 5 ml zawiesiny łodyżek bakteryjnych.Następnie otwórz zacisk linii wlotowej i pozwól bakteriom spłynąć do produktu płytkowego. Przepłucz cylinder strzykawki, dopuszczając do zwrotnego przepływu niewielkiej ilości produktu płytkowego. Po przepłukaniu zdejmij cylinder strzykawki.Podłącz strzykawkę o pojemności 30 ml i przemyj port wlotowy co najmniej dwukrotnie po dokładnym wymieszaniu produktu. Używając czystej strzykawki o pojemności 5 ml, pobierz 2 ml próbki do wstępnego przygotowania. Użyj nowej strzykawki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza wprowadzone do worka.Następnie usuń linię wlotową z worka z preparatem i zważ roztwór płytek krwi. Rozpocznij proces traktowania płytek, wprowadzając najpierw identyfikator operatora, a następnie zamocuj worek na platformie iluminatora. Następnie wprowadź identyfikator próbki za pomocą czytnika kodów kreskowych.Wprowadź typ produktu oraz jego wagę do oprogramowania. Następnie zamknij zacisk kwarcowy, aby automatycznie dostarczyć 6,24 joules per milliliter energii ultrafioletowej. Typowa obróbka trwa od pięciu do 10 minut.W międzyczasie należy oznaczyć miano próbki przed obróbką po naświetlaniu UV, oznaczyć miano próbki po obróbce w celu oceny przeżywalności bakterii, a następnie oznaczyć miano zapasowej kultury bakterii jako kontrolę dodatnią. Miano kultury zapasowej powinno mieścić się w granicach jednej jednostki logarytmicznej CFU na mililitr w stosunku do jego zarejestrowanego miana. Redukcję 11 różnych gatunków bakterii oceniono przy użyciu ryboflawiny oraz procesu technologii redukcji patogenów opartej na świetle UV.W przypadku każdego organizmu oceniono co najmniej sześć produktów płytkowych, z których każdy został zaszczepiony. Przy zastosowaniu odpowiedniej ilości bakterii, przy końcowym mianie przekraczającym 10 000 CFU na mililitr, pobrano próbki przed zabiegiem, a także bezpośrednio po zastosowaniu ryboflawiny i promieniowania UV w porównaniu z roztworami przed zabiegiem. Wszystkie obciążenia bakteryjne zostały zredukowane o co najmniej 2,6 jednostki logarytmicznej, co odpowiada około 400-krotnemu zmniejszeniu, w wyniku zastosowania ryboflawiny i światła UV.Po przeprowadzeniu tych badań z użyciem bakterii o wysokim mianie, można przeprowadzić dodatkowe badania z wykorzystaniem mian białka spike bardziej istotnych klinicznie. Odzwierciedlają one rzeczywiste poziomy bakterii, które mogą występować w produktach w momencie donacji. Celem tych badań z niskim mianem zaszczepienia jest ocena zdolności metody do zapobiegania wzrostowi bakterii i utrzymania ich ujemnego wyniku hodowli podczas okresu przechowywania, w tym przedłużonych okresów przechowywania w temperaturze pokojowej.Wprowadzenie tej technologii umożliwiło badaczom i specjalistom medycznym ocenę zdolności do inaktywacji szerokiego spektrum patogenów oraz wykorzystanie tej metody w celu zapobiegania rozprzestrzenianiu się chorób przenoszonych przez transfuzję. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu pomiaru redukcji logarytmicznej bakterii w silnie zanieczyszczonym produkcie płytkowym poddanym działaniu ryboflawiny i światła UV.

treatment-platelet-products-with-riboflavin-uv-light-effectiveness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Leczenie produktów płytkowych za pomocą ryboflawiny i światła UV: Skuteczność wobec wysokiej tytułu bakterii zanieczyszczenia

W niniejszym artykule opisano proces stosowany w Szpitalu Uniwersyteckim w Örebro do otrzymywania koncentratów płytkowych z warstwy leukocytarnej o podwójnej dawce, przygotowywanych z donacji krwi pełnej i poddawanych inaktywacji patogenów za pomocą systemu INTERCEPT Blood System. Jakość jednostek płytkowych in vitro oceniano w ciągu 7 dni przechowywania.

Przygotowanie i inaktywacja patogenów w koncentratach płytek krwi z podwójnej dawki warstwy leukocytowej z wykorzystaniem systemu INTERCEPT Blood System

Źródło: Cheng, C., et al. Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawiny-5′-fosforanu w świetle widzialnym. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę oceny fototoksycznego wpływu mononukleotydu flawinowego (FMN) na bakterie chorobotwórcze. Kultury bakteryjne są wystawione na działanie rosnących stężeń FMN i oświetlone światłem widzialnym w celu wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS), które uszkadzają składniki komórkowe. Bakterie, które przeżyły, są następnie oznaczane ilościowo w...

Inaktywacja bakterii za pomocą aktywowanego światłem mononukleotydu flawinowego

Źródło: Cheng, C., et al. Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawiny-5′-fosforanu w świetle widzialnym. J. Vis. Exp. (2022).Na tym filmie zbuforowana mieszanina reakcyjna zawierająca L-metioninę, błękit nitro tetrazolium (NBT) i mononukleotyd flawinowy (FMN) jest naświetlana światłem fioletowym w celu wywołania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS). Prowadzi to do inaktywacji bakterii i powstania wykrywalnego spektrometrycznie formazanu.

Kwantyfikacja inaktywacji bakterii wywołanej światłem poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu

Źródło: Zhao, K. i in. Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej pośredniczonej kwasem 5-aminolewulinowym na biofilm gronkowca aureus . J. Vis. Exp. (2018)Film prezentuje protokół terapii fotodynamicznej mający na celu ocenę działania antybakteryjnego na biofilmy bakterii Gram-dodatnie. Biofilmy dzielą się na cztery grupy: dwie otrzymują prekursor fotosensyzatora, a dwie otrzymują bufor. Wszystkie są inkubowane w ciemności, po czym następuje ekspozycja na czerwone światło dla...

Aktywacja światłem biofilmów bakteryjnych z użyciem prekursora fotosensywnego

Ten film pokazuje proces redukcji patogenów oparty na ryboflawinie i świetle UV przeciwko skażeniu bakteryjnemu o wysokim mianie w produktach z płytek krwi u ludzi. Proces ten może przyczynić się do zmniejszenia ryzyka poważnych niepożądanych zdarzeń transfuzji związanych ze skażeniem bakteryjnym.

Leczenie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV w celu wyeliminowania bakterii

Zakażenie związane z implantem jest poważnym powikłaniem klinicznym. W niniejszym badaniu opisano podejście wykorzystujące osocze bogatopłytkowe (PRP) w celu zapobiegania zakażeniom związanym z implantami, przedstawiono protokół przygotowania PRP ze stałym stężeniem płytek krwi oraz opisano nowo zidentyfikowane właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP i powiązane protokoły badania takich właściwości przeciwdrobnoustrojowych in vitro.

PRP jako nowe podejście do zapobiegania infekcjom: przygotowanie i właściwości przeciwdrobnoustrojowe PRP in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu zastosowania czerwonego światła na wzrost biofilmu Candida albicans. Niekoherentne urządzenie do pomiaru światła czerwonego o długości fali 635 nm i gęstości energii 87,6 J·cm-2 stosowano przez cały okres wzrostu biofilmów Candida albicans przez 48 godzin.

Codzienna fototerapia czerwonym światłem regulująca wzrost biofilmu Candida albicans

Tutaj prezentujemy protokół inaktywacji bakterii chorobotwórczych za pomocą reaktywnych form tlenu wytwarzanych podczas fotolizy mononukleotydu flawinowego (FMN) pod wpływem światła niebieskiego i fioletowego o niskiej intensywności. Wykazano, że fotoliza FMN jest prostą i bezpieczną metodą w procesach sanitarnych.

Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu ryboflawiny w świetle widzialnym

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.

Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii

Poznaj metodę redukcji patogenów w produktach płytkowych krwi za pomocą rybo flawiny i światła UV. Technika skutecznie eliminuje bakterie przy zachowaniu jakości składników krwi.

Leczenie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV: skuteczność w walce z wysokim mianem bakterii

Przeglądaj więcej filmów