Name: Wywoływanie reaktywnej glejozy in vivo przez uraz kłuty przodomózgowia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę wywoływania reaktywnej glejozy u dorosłych myszy poprzez uraz kłuty przodomózgowia. Technika ta umożliwia badanie procesów komórkowych i molekularnych glejozy bez potrzeby stosowania specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Katherine Clark za pomoc techniczną. A.D.R.G. jest częściowo finansowany przez 5K01MH097957-03

Dorosłe (3-4 miesiące) samce myszy na mieszanym tle C57BL/6 zostały użyte w tym protokole. Zwierzęta były trzymane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i miały swobodny dostęp do jedzenia i wody. Wszystkie procedury wykonane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Drexel.
1. Przygotowanie pola operacyjnego
<ol>
	<li>Zdezynfekuj stół chirurgiczny 70% etanolem, następnie przykryj cały stół operacyjny wkładkami chłonnymi i ułóż narzędzia chirurgiczne w sąsiedztwie stereotaksji.</li>
	<li>Skonfiguruj sprzęt stereotaktyczny bez ramienia manipulatora. Ułóż poduszkę grzewczą na stereotaktycznym i ustaw na 37 °C. Unikaj przegrzania zwierzęcia, umieszczając mały kawałek ręcznika papierowego lub podkładki chirurgicznej między zwierzęciem a poduszką grzewczą.</li>
	<li>Za pomocą autoklawowanych nożyczek pokrój małe kawałki autoklawowanej pianki żelowej na sterylną szalkę Petriego zawierającą 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aż będą gotowe do użycia. 
	Uwaga: Utrzymuj sterylne środowisko pracy, używając autoklawowanych narzędzi i sterylnych materiałów chirurgicznych. Ponownie sterylizuj narzędzia chirurgiczne podczas zabiegu lub między zwierzętami, zanurzając je w sterylizatorze kulkowym na 10-15 sekund, w razie potrzeby. Utrzymuj rękawice w czystości przez cały czas trwania zabiegu, pocierając ręce 70% etanolem, w razie potrzeby, w celu dezynfekcji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy do operacji
<ol>
	<li>Wyjmij mysz z klatki domowej i zważ (g).</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej izofluranu i ustaw tlen na 2 l/min, a parownik izofluranu na 5, aby wywołać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, około 3-5 min. Monitoruj spowolniony oddech i unieruchomienie. Sprawdź, czy mysz jest w pełni uspokojona za pomocą odruchu szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Gdy mysz jest w pełni uspokojona, umieść ją w ramce stereotaktycznej, zabezpiecz nos w stożku nosowym, który jest przymocowany rurką do izofluranu. Włóż wkładki douszne do kanału słuchowego i dokręć, upewniając się, że głowa jest stabilna.</li>
	<li>Ogol głowę od ucha do ucha i od między oczami do tyłu uszu.</li>
	<li>Wysterylizuj skórę naprzemiennymi chusteczkami z alkoholem izopropylowym i roztworem jodu betadyny, 3 razy każda.</li>
	<li>Nałóż sztuczne łzy na oba oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu chirurgicznego.</li>
</ol>
3. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Monitoruj głębokość znieczulenia, ściskając palec u nogi lub ogon. Mysz znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie operacyjnej, gdy nie ma odpowiedzi, a oddech jest powolny i równomierny.</li>
	<li>Wykonaj przystrzałkowe nacięcie skóry od tuż za oczami do prawie między uszami jednym, zdecydowanym ruchem za pomocą ostrza skalpela nr 11. Odsuń skórę na bok i przytnij prawą stronę hemostatem.</li>
	<li>Oczyść czaszkę z leżącej membrany za pomocą matowej strony skalpela nr 11 i aplikatorów z bawełnianą końcówką. Opcjonalnie przetrzyj czaszkę aplikatorem z bawełnianą końcówką zamoczonym w 0,9% roztworze soli fizjologicznej. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Za pomocą małej linijki zaznacz przednią granicę kraniotomii na wysokości 1 mm ogonowej do szwu koronalnego, a lewą krawędź kraniotomii na 1 mm bocznie do szwu strzałkowego (ryc. 1) za pomocą trwałego markera. Następnie zaznacz prawe i ogonowe granice kraniotomii w odległości 4 mm od szwów strzałkowych i koronalnych odpowiednio (ryc. 1).</li>
	<li>Za pomocą wiertła 0,5 mm rozpocznij wykonywanie kraniotomii, wiercąc powoli zgodnie z konturem markera permanentnego. Pamiętaj, aby nie przebić się całkowicie przez czaszkę. Delikatnie dociśnij izolowany kawałek kości ciemieniowej kleszczami nr 5, obszary osłabienia ustąpią pod naciskiem. Gdy przerzedzona kość jest wystarczająco słaba na całym obwodzie, kawałek kości jest gotowy do usunięcia. 
	UWAGA: Jeśli badacz ma trudności z usunięciem kości w jednym kawałku, oznacza to, że kość nie została wystarczająco rozrzedzona podczas wiercenia. Rozważ dalsze wiercenie czaszki u kolejnych zwierząt, aby ułatwić łatwe usunięcie kawałka kości.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę o sile 23 g nanieść niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej, aby namoczyć izolowaną kość i wywiercony obszar.</li>
	<li>Przymocuj ramię manipulatora do sprzętu stereotaktycznego. Przymocuj nowe ostrze skalpela nr 11 do uchwytu sondy tak, aby ostra strona ostrza była skierowana do przodu. 
	UWAGA: Chociaż tkanki rostralne i ogonowe doświadczają odpowiednio ostrych i krawędzi ostrza, uszkodzenia mechaniczne wywołane urazem penetrującym są porównywalne na całym obszarze zmiany. Nie obserwujemy znaczących różnic w głównych cechach glejozy reaktywnej, w tym w regulacji w górę ekspresji lub proliferacji GFAP, między odcinkami rostralnymi i ogonowymi.</li>
	<li>Trzymając ramię manipulatora z dala od drogi, ostrożnie podnieś izolowaną kość za pomocą kleszczy ustawionych pod kątem 5/45. Włóż końcówkę kleszczy z boku izolowanej kości i podnieś, używając dźwigni, aby jednym pełnym ruchem oderwać pozostawiony kawałek kości. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie dźgnąć mózgu ani nie naruszyć opony twardej pod czaszką.</li>
	<li>Weź mały kawałek nasączonej wchłanialnej pianki żelowej i umieść na odkrytym mózgu, aby zapobiec jego wysychaniu i wchłonąć wszelką krew, która może być obecna.</li>
	<li>Gdy pianka żelowa znajdzie się na miejscu, odchyl ramię manipulatora na miejsce i dostosuj ostrze do środka kraniotomii nad pianką żelową. Usuń piankę żelową i opuść ostrze, aż końcówka dotknie opony twardej bez nakłuwania opony twardej. Zaznacz współrzędne grzbietowe/brzuszne za pomocą skali noniusza na pionowym ramieniu stereotaktycznego.</li>
	<li>Za pomocą ramienia manipulatora powoli opuść ostrze dokładnie 3 mm w głąb mózgu. Osiąga się to za pomocą oznaczeń skali noniusza na ramieniu manipulatora. Pozostaw ostrze na miejscu przez 5-10 sekund. Przesuń ramię stereotaktyczne z mocowaniem ostrza rostralnego do ogona trzy razy, pozwalając ostrzu dotrzeć do rostralnych i ogonowych granic kraniotomii przed przejściem na przeciwległy koniec. 
	UWAGA: Opona twarda nie jest usuwana przed włożeniem ostrza. W przeciwieństwie do opony twardej szczura, która ma grubość ~80 μm7, opona twarda myszy jest znacznie cieńsza (tylko kilka warstw komórek) i nie wytwarza znacznego oporu na ostrze skalpela podczas wkładania. Użyj nowego ostrza skalpela dla każdej myszy, aby upewnić się, że każde zwierzę otrzymuje stałe obrażenia.</li>
	<li>Powoli podnieś ramię stereotaktyczne, wyjmując ostrze z mózgu. Po wyjęciu ostrza natychmiast umieść kolejny kawałek pianki żelowej na powierzchni mózgu, aby wchłonąć nadmiar krwi lub płynu.</li>
	<li>W międzyczasie zdejmij ramię stereotaktyczne i wyrzuć ostrze skalpela nr 11. Po ustaniu krwawienia usuń piankę żelową.</li>
	<li>Zamknij ranę, zszywając skórę niewchłanialnym szwem, takim jak etylon lub prolen. Szwy należy usunąć 9-10 dni po zabiegu.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce domowej i pozwól myszy powoli dojść do siebie na poduszce grzewczej i monitoruj, czy nie ma oznak niepokoju. Rekonwalescencja po znieczuleniu wywołanym izofluoranem następuje zwykle w ciągu 2-5 minut po usunięciu z izofluoranu. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska pozycji mostka.</li>
	<li>Podawać podskórnie 0,5-1 ml roztworu Ringera z mleczanami, aby zapewnić nawilżenie.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Ściśle monitoruj zwierzęta po operacji, aż do wyzdrowienia ze znieczulenia przed powrotem do kolonii.
	<ol>
		<li>W celu zmniejszenia bólu i dyskomfortu pooperacyjnego należy podać 0,05-0,1 mg/kg buprenorfiny we wstrzyknięciu dożylnym bezpośrednio po zabiegu.</li>
		<li>Obserwuj zwierzęta przez 2-3 dni po operacji pod kątem poważnych objawów stresu, takich jak ograniczenie ruchów, brak pielęgnacji lub utrata wagi. Poddać eutanazji zwierzęta wykazujące którekolwiek z tych objawów niepokoju i usunąć z badania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zbadać histopatologię uszkodzonych tkanek, należy poddać zwierzęta eutanazji za pomocą standardowej perfuzji wewnątrzsercowej.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, znieczulij zwierzęta przedawkowaniem ketaminy/ksylazyny, a następnie perfuzją dosercową 15-20 ml 0,9% NaCl lub do momentu oczyszczenia wątroby z krwi, a następnie 60 ml 4% paraformaldehydu na zakończenie eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj mózgi i post-fix przez 2-4 godziny w 4% paraformaldehydzie przed przeniesieniem do 30% roztworu sacharozy. Wycina mózgi na kriostacie pod ciśnieniem 40-60 μm i przetwarza za pomocą standardowych procedur histologicznych lub immunohistochemicznych, lub jak opisano w Garcia8,9.</li>
</ol>

<ol><li>Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+as+therapeutic+targets+for+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders.</a> Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).</li>
<li>Bush, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+infiltration%2C+neuronal+degeneration%2C+and+neurite+outgrowth+after+ablation+of+scar-forming%2C+reactive+astrocytes+in+adult+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice.</a> Neuron. 23 (2), 297-308 (1999).</li>
<li>Faulkner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+protect+tissue+and+preserve+function+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).</li>
<li>Okada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+Stat3+or+Socs3+discloses+a+dual+role+for+reactive+astrocytes+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 12 (7), 829-834 (2006).</li>
<li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Astrocytes+Form+Scar-Like+Perivascular+Barriers+to+Leukocytes+during+Adaptive+Immune+Inflammation+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes during Adaptive Immune Inflammation of the CNS.</a> Journal of Neuroscience. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li>
<li>Burda, J. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Gliosis+and+the+Multicellular+Response+to+CNS+Damage+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reactive Gliosis and the Multicellular Response to CNS Damage and Disease.</a> Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).</li>
<li>Maikos, J. T., Elias, R. A., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+dura+mater+from+the+rat+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of dura mater from the rat brain and spinal cord.</a> Journal of neurotrauma. 25 (1), 38-51 (2008).</li>
<li>Garcia, A. D., Doan, N. B., Imura, T., Bush, T. G., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP-expressing+progenitors+are+the+principal+source+of+constitutive+neurogenesis+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GFAP-expressing progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain.</a> Nat Neurosci. 7 (11), 1233-1241 (2004).</li>
<li>Garcia, A. D., Petrova, R., Eng, L., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+discrete+populations+of+astrocytes+in+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates discrete populations of astrocytes in the adult mouse forebrain.</a> J Neurosci. 30 (41), 13597-13608 (2010).</li>
<li>Amat, J. A., Ishiguro, H., Nakamura, K., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+diversity+and+kinetics+of+proliferating+microglia+and+astrocytes+following+cortical+stab+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Phenotypic diversity and kinetics of proliferating microglia and astrocytes following cortical stab wounds.</a> Glia. 16 (4), 368-382 (1996).</li>
<li>Hozumi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+prosaposin+ameliorates+spatial+learning+disturbance+and+reduces+cavity+formation+following+stab+wounds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Administration of prosaposin ameliorates spatial learning disturbance and reduces cavity formation following stab wounds in rat brain.</a> Neuroscience letters. 267 (1), 73-76 (1999).</li>
<li>Ness, R., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+cells+modulate+the+neurite+growth+promoting+properties+of+astrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal cells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes in vitro.</a> Glia. 19 (1), 47-57 (1997).</li>
<li>Byrnes, K. R., Fricke, S. T., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+differences+between+rats+and+mice+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+magnetic+resonance+imaging+%3A+JMRI%22%5BJournal%5D)">Neuropathological differences between rats and mice after spinal cord injury.</a> Journal of magnetic resonance imaging : JMRI. 32 (4), 836-846 (2010).</li>
<li>Steward, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neurotrauma+research%3A+opportunities+and+potential+pitfalls+of+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neurotrauma research: opportunities and potential pitfalls of murine models.</a> Experimental neurology. 157 (1), 19-42 (1999).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Hanisch, U. -K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debris+clearance+by+microglia%3A+an+essential+link+between+degeneration+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration.</a> Brain. 132 (2), 288-295 (2008).</li>
<li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+Barrier+to+Regeneration+in+the+CNS%3A+Activated+Macrophages+Induce+Extensive+Retraction+of+Dystrophic+Axons+through+Direct+Physical+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Another Barrier to Regeneration in the CNS: Activated Macrophages Induce Extensive Retraction of Dystrophic Axons through Direct Physical Interactions.</a> Journal of Neuroscience. 28 (38), 9330-9341 (2008).</li>
<li>Ip, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Cells+Contribute+to+Myelin+Degeneration+and+Axonopathic+Changes+in+Mice+Overexpressing+Proteolipid+Protein+in+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immune Cells Contribute to Myelin Degeneration and Axonopathic Changes in Mice Overexpressing Proteolipid Protein in Oligodendrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 26 (31), 8206-8216 (2006).</li>
<li>Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+systemic+inflammation+to+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Contribution of systemic inflammation to chronic neurodegeneration.</a> Acta neuropathologica. 120 (3), 277-286 (2010).</li>
<li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> Journal of Neuroscience. 19 (24), 10778-10788 (1999).</li>
<li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+beyond+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Buffo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+progeny+of+reactive+gliosis%3A+A+source+of+multipotent+cells+in+the+injured+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3581-3586 (2008).</li>
<li>Sirko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+glia+in+the+injured+brain+acquire+stem+cell+properties+in+response+to+sonic+hedgehog.+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. [corrected].</a> Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bardzo ważne jest, aby czaszka lub leżąca pod nią opona twarda nie zostały uszkodzone podczas wiercenia. Podczas wiercenia należy lekko naciskać, aby upewnić się, że czaszka nie jest przebita. Ponadto należy zachować ostrożność podczas podnoszenia części czaszki, aby upewnić się, że opona twarda nie zostanie oderwana wraz z kością.
Opisany tutaj uraz kłuty przodomózgowia modeluje penetrujący uraz OUN. Chociaż mniej przekładalny klinicznie niż modele TBI, takie jak FPI lub CCI, model zmiany ukł...

Głównym wyzwaniem dla opracowania skutecznych terapii leczenia uszkodzonego OUN jest niepełne zrozumienie złożonych zdarzeń wielokomórkowych, które są wywoływane przez uraz. Reaktywne astrocyty zyskują coraz większe uznanie jako obiecujący cel dla nowych terapii1. Chociaż historycznie uważane za wrogie naprawie neuronów, reaktywne astrocyty są obecnie uznawane za krytyczne składniki złożonej, wielokomórkowej odpowiedzi neuroprotekcyjnej, która obejmuje tłumienie procesów zapalnych i ograniczanie wtórnych uszkodzeń i neurodegeneracji2-6. Chociaż neuropatologiczne cechy glejozy reaktywnej są już dawno dobrze zdefiniowane, mechanizmy komórkowe i molekularne regulujące glejozę reaktywną oraz różnorodny wachlarz dalszych konsekwencji pozostają słabo poznane. Zrozumienie mechanizmów, które napędzają glejozę reaktywną, a także następujące po niej zdarzenia komórkowe i molekularne, jest ważnym krokiem w kierunku opracowania strategii mających na celu promowanie neuroprotekcyjnych właściwości glejozy reaktywnej, przy jednoczesnym łagodzeniu szkodliwych skutków. 
Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania ciężkiej astroglejozy reaktywnej w przodomózgowiu u dorosłych myszy za pomocą urazu kłutego. W przeciwieństwie do innych modeli urazowego uszkodzenia mózgu (TBI), takich jak kontrolowane uderzenie korowe (CCI) lub uraz spowodowany płynną urazem perkusyjnej (FPI), które wymagają specjalistycznego sprzętu do spowodowania urazu, ukłucie przodomózgowia wymaga jedynie urządzenia stereotaktycznego do ustabilizowania głowy i ostrza skalpela nr 11. W związku z tym model zmiany ukłucia przodomózgowia jest szerzej dostępny dla szerokiego grona laboratoriów, które nie mają dostępu do specjalistycznych urządzeń niezbędnych do powstania urazu FPI lub CCI. Opisana tutaj metoda umożliwia badaczom niezawodne i powtarzalne wywołanie silnej odpowiedzi glejozy w celu zbadania kolejnych zdarzeń komórkowych i molekularnych. Po powrocie do zdrowia po operacji zwierzęta, które doznały urazu kłutego przodomózgowia, mogą przetrwać przez dłuższy czas bez potrzeby specjalistycznej opieki i mogą zostać zwrócone do kolonii w celu przeprowadzenia ostrych, pośrednich lub przewlekłych badań. Chociaż mniej przekładalne klinicznie niż modele FPI lub CCI TBI, zmiana w przodomózgowiu spowodowana urazem kłutym służy jako prosty, ale użyteczny model eksperymentalny do badania podstawowych mechanizmów biologicznych leżących u podstaw reaktywnej glejozy i innych zdarzeń neuropatologicznych po urazie OUN.

<table><tbody><tr><td>Stereotax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726049</td><td></td></tr><tr><td>Szybkobieżne mikrowiertło</td><td>Ostrze</td> skalpela ze stali nierdzewnej Harvard Apparatus <td>724950</td><td></td></tr>, kleszcze kątowe <tr><td>#11</td><td>MedVet</td><td>JOR581S</td><td></td></tr><tr><td>5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka żelpiankowa 12 cm x 7 mm</td><td>Fisher</td><td>NC9841478</td><td></td></tr><tr><td>Rb anty-GFAP</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; Z033429-2</td><td>Rozcieńczenie - 1:20 000 (jasne pole); 1:1,000 (fluorescencja)</td></tr><tr><td>Shp anty-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>Rozcieńczenie - 1:20,000 (jasne pole); 1:500 (fluorescencja)</td></tr><tr><td>Biotynylowany kozioł anty-królik</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&nbsp;</td><td>Rozcieńczenie - 1:400 (jasne pole)</td></tr><tr><td>Biotynylowany królik anty-owce</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-6000</td><td>Rozcieńczenie - 1:400 (jasne pole)</td></tr><tr><td>Alexafluor 488 koza anty-królik</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td>Rozcieńczenie - 1:400 (jasne pole)</td></tr><tr><td>Alexafluor 568 osły anty-owce</td><td>Life Technologies</td><td>A-21099</td><td>Rozcieńczenie - 1:1,000 (fluorescencja)</td></tr><tr><td>DAPI Kwas nukleinowy Stain</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>Rozcieńczenie - 1:1,000 (fluorescencja)</td></tr><tr><td>Octan fioletu krezylowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td>Rozcieńczenie - 1% (jasne pole)</td></tr></tbody></table>

wywoływanie reaktywnej glejozy in vivo przez uraz kłuty przodomózgowia

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Po uszkodzeniu OUN, astrocyty przechodzą szeroki zakres zmian biochemicznych, morfologicznych i molekularnych, określanych zbiorczo jako astroglejoza reaktywna. Reaktywne astrocyty wywierają zarówno działanie zapalne, jak i ochronne, które odpowiednio hamują i promują naprawę neuronów. Mechanizmy leżące u podstaw różnorodnych właściwości funkcjonalnych astroglejozy reaktywnej nie są dobrze poznane. Lepsze zrozumienie tych mechanizmów ma kluczowe znaczenie dla opracowania strategii terapeutycznych w leczeniu uszkodzonego OUN. Tutaj pokazujemy metodę wywoływania reaktywnej astroglejozy w przodomózgowiu dorosłej myszy za pomocą zmiany kłutej w przodomózgowiu. Ten model zmiany jest prosty, niezawodny i wymaga jedynie urządzenia stereotaktycznego i ostrza skalpela, aby spowodować uraz. Wykorzystanie zmian kłutych jako modelu urazu w przodomózgowiu jest dobrze ugruntowane i podatne na badania dotyczące szerokiego zakresu skutków neuropatologicznych, takich jak zwyrodnienie neuronów, zapalenie nerwów i zaburzenia bariery krew-mózg (BBB). W związku z tym model urazu kłutego przodomózgowia służy jako potężne narzędzie, które można zastosować w szerokim zakresie badań nad reakcją OUN na uraz.

Ponieważ zwierzęta poddawane tej procedurze nie wymagają specjalistycznej opieki pooperacyjnej, w badaniu można łatwo uwzględnić krótkie lub długie okresy przeżycia, w zależności od potrzeby zbadania patologii ostrej lub przewlekłej po urazie. Główne cechy glejozy reaktywnej, takie jak zwiększona ekspresja GFAP i hipertrofia somy, mogą być obserwowane już 2-3 dni po urazie. Szczytowa faza proliferacji astrocytów reaktywnych przypada na dni 3-5 po urazie10. Przedstawione poniżej reprezentatywne wyniki pochodzą ...

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół do wywołania urazu kłutym przodomózgowia u dorosłych myszy. Rana kłuta indukuje ciężką reaktywną glejozę i tworzenie się blizn glejowych, które można następnie zbadać za pomocą standardowych metod immunohistochemicznych.

Wywoływanie reaktywnej glejozy in vivo przez uraz kłuty przodomózgowia

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wywołanie reaktywnej astrogliozy w przedmózgowiu dorosłej myszy poprzez stworzenie uszkodzenia mechanicznego, w celu zbadania procesów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw reaktywnej gliozy. Cel ten osiąga się poprzez wykonanie kraniotomii, a następnie wprowadzenie sterylnego ostrza skalpela na głębokość i długość od trzech do czterech milimetrów do przedmózgowia w celu wywołania uszkodzenia. Zwierzęta mogą przeżyć do ostrych lub przewlekłych punktów czasowych, a ich tkanki są pobierane po zakończeniu eksperymentu.Kolejno tkankę można poddać analizom histologicznym, biochemicznym lub biologii molekularnej w celu zbadania procesów molekularnych i komórkowych napędzających reaktywną gliozę. Wyniki wskazują, że procedura ta wywołuje silną gliozę reaktywną, co objawia się gwałtownym wzrostem ekspresji GFAP oraz proliferacją reaktywnych astrocytów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak uraz przez uderzenie cieczą (fluid percussion injury) czy kontrolowany uraz kory mózgowej (controlled cortical impact), jest możliwość łatwego indukowania i badania gliozy reaktywnej bez konieczności stosowania dodatkoweg

triggering-reactive-gliosis-in-vivo-by-a-forebrain-stab-injury

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wyzwaniem reaktywnej gliozy in vivo poprzez uraz mózgu przedniego

Ten film pokazuje procedurę uszkodzenia kory mózgowej u myszy, obejmującą odsłonięcie czaszki i tworzenie uszkodzeń mózgu. Indukuje astroglejozę reaktywną, neuroprotekcyjną odpowiedź astrocytów, w celu zbadania urazu, stanu zapalnego i mechanizmów naprawczych OUN.

Generowanie urazu kłutego kory mózgowej w modelu myszy w celu wywołania astrogleju reaktywnego

Opisano paradygmat uszkodzeń wykorzystujący brzuszny rdzeń nerwowy larw Drosophila do badania regeneracji i naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Dźganie, a następnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna w próbkach poklatkowych i utrwalonych, w połączeniu z analizą ilościową za pomocą celowo opracowanego oprogramowania i genetyki, są wykorzystywane do badania molekularnych mechanizmów regeneracji i naprawy OUN.

Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe może być użyte do zbadania interakcji między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w ich naturalnym środowisku tkankowym u chimerycznego zwierzęcia szpiku kostnego z urazowym uszkodzeniem rdzenia kręgowego w kolumnie grzbietowej.

Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Ten systematyczny protokół opisuje nowy zwierzęcy model padaczki pourazowej po powtarzającym się łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu. Pierwsza część szczegółowo opisuje etapy indukcji urazowego uszkodzenia mózgu przy użyciu zmodyfikowanego modelu spadku masy ciała. Druga część zawiera instrukcje dotyczące podejścia chirurgicznego dla jedno- i wielokanałowych systemów akwizycji danych elektroencefalograficznych.

Wywoływanie padaczki pourazowej w mysim modelu powtarzalnego rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu

Opisujemy iniekcję domostkową, która wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, która może być stabilizowana do czaszki, eliminując w ten sposób ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Podejście to może być wykorzystane do genetycznego mapowania losów i manipulacji komórkami opon mózgowo-rdzeniowych oraz do śledzenia ruchów płynu mózgowo-rdzeniowego.

Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie domostkowe

Protokół opisuje łagodne urazowe uszkodzenie mózgu w modelu mysim. W szczególności w pełni wyjaśniony jest protokół krok po kroku mający na celu wywołanie łagodnego urazu głowy w linii środkowej oraz charakterystyka modelu zwierzęcego.

Elektromagnetycznie sterowany model zamkniętej głowy łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Uproszczone modele urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) ułatwiły rozwój podejść terapeutycznych. Protokół ten nakreśla tworzenie kory myszy z raną kłutą za pomocą igieł, umożliwiając analizę krwotoku i stanu zapalnego. Model myszy TBI z raną kłutą ma tę zaletę, że można go wykonać bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.

Mysi model rany kłutej do badania krwotoku i stanu zapalnego w urazowym uszkodzeniu mózgu

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj metodę wywoływania reaktywnej glejozy u dorosłych myszy poprzez uraz kłuty przodomózgowia. Technika ta umożliwia badanie procesów komórkowych i molekularnych glejozy bez potrzeby stosowania specjalistycznego sprzętu.

Wywoływanie reaktywnej glejozy in vivo przez uraz kłuty przodomózgowia

Przeglądaj więcej filmów