Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie sygnałów elektrycznych przesyłanych na duże odległości przez elementy sita przepływowego z obszaru zjadanego przez gąsienicę do nienaruszonego obszaru w roślinie. Osiąga się to poprzez zmontowanie wykresu penetracji elektrycznej lub obwodu EPG, który integruje owada heminowego, takiego jak mszyca i roślina. Mszyca wprowadza go do rośliny, zamykając w ten sposób obwód i rozpoczyna się nagrywanie EPG.

W końcu mszyca wkłada ją do elementu sitowego i ślini się do niego przez kilka minut, po czym następuje długotrwała faza spożycia, zarówno ślinotok lub jedna faza E, jak i spożycie lub E dwie fazy zawierają małe i rytmiczne potencjały strumieniowania. Następnie gąsienicę umieszcza się na liściu i pozostawia do karmienia z liścia. Podczas gdy mszyca zarejestrowana przez EPG nadal żywi się przepływem w sąsiednim liściu, uszkodzenie spowodowane przez gąsienicę środkowej żyły rozpocznie sygnał elektryczny, który zostanie przesłany przez phem do innych liści, w tym liścia, z którego żeruje mszyca przewodowa EPG.

Wielkość sygnału można zmierzyć przez porównanie z impulsem kalibracyjnym o znanej wielkości, który został wcześniej zastosowany podczas fazy E dwa lub połknięcia. Wyniki pokazują, że uszkodzenie liścia za pośrednictwem gąsienicy konsekwentnie indukuje złożony i znacznie duży sygnał elektryczny w przepływie sąsiedniego liścia z pierwszym powolnym składnikiem i drugim nałożonym na pierwszy szybki składnik. Technika wykresu penetracji elektrycznej została wprowadzona w latach 60. XX wieku.

Monitoring EPG znacząco przyczynił się do poszerzenia naszej wiedzy na temat penetracji roślin przez mszyce i inne owady hematofelkowe. Głównym zainteresowaniem gospodarczym jest badanie mechanizmów odporności roślin żywicielskich, a także mechanizmów przenoszenia wirusów roślinnych. Wpadłem więc na pomysł wykorzystania EPG jako metody elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej u roślin, tworząc powiązanie między zapisami EPG a zapisami wewnątrzkomórkowymi, które są wykonane za pomocą konwencjonalnych elektrod szklanych, które są wypełnione chlorkiem potasu zarówno w nagraniach EPC, jak i konwencjonalnych nagraniach wykonanych za pomocą elektrod szklanych.

Istnieją dwa poziomy napięcia, stosunkowo wysoki poziom napięcia, który odpowiada wewnątrzkomórkowej pozycji końcówki elektrody szklanej lub końcówki typu AEs, oraz stosunkowo niski poziom napięcia, który odpowiada wewnątrzkomórkowej pozycji elektrody szklanej lub oczka AEs. W przypadku EPG. Podczas hodowli mszyc do nagrań PG wybór gatunków roślin i mszyc zależy od badań Cel badań nad szybką opaną, mszyca jest odpowiednia, hoduj je w szklarni na klatkach otaczających hodowlę.

Rośliny muszą być odporne na mszyce i parazytoidy za pomocą przesiewania o drobnych oczkach z otworami mniejszymi niż milimetr, ale wierzchołki klatek powinny być wykonane z przezroczystego materiału, aby umożliwić fotosyntezę. Co dwa tygodnie populacja mszyc musi być przenoszona na świeże rośliny. Wystarczy od 10 do 20 dorosłych mszyc, pozostałe mszyce można zutylizować.

W przypadku nagrań EPG owadów specjalistyczna elektroda musi być zbudowana z mosiężnych styków złącza, drutu miedzianego o długości od jednego do dwóch centymetrów, takiego jak włókna z przewodu elektrycznego, oraz kawałka bardzo cienkiego złotego drutu o długości około 1,5 centymetra. Użyj również srebrnego kleju na bazie wody i prostej małej lutowniczej z płynem lutowniczym i drutem lutowniczym z żywicy. Aby rozpocząć, stopij kawałek metalowego drutu do na końcówce lutowniczej.

Następnie zanurz główkę mosiężnego gwoździa w kropli płynu lutowniczego. Natychmiast przyłóż końcówkę drutu miedzianego do końcówki lutowniczej, topiąc go w ten sposób z mosiężnym kołkiem. Teraz dokładnie wstrząśnij lub zwiruj srebrny klej, aby emulsja nie osiadła.

Otwórz butelkę i zanurz wolny koniec drutu miedzianego w kleju na wieczku pod stereoskopem. Połącz złotą siatkę z zakładką co najmniej jednego milimetra i pozostaw srebrny klej do wyschnięcia. Staraj się nie rozmazywać kleju na płytce mikroskopu po wyschnięciu kleju, sprawdź kontakt między srebrnym klejem a złotym drutem, gdzie części drutów łączących nie są sklejone.

Dodaj świeży klej za pomocą małej szpilki lub drutu miedzianego, aż owad będzie gotowy. Gotową elektrodę można bezpiecznie przechowywać na styropianie. Aby naprawić mszycę, użyj prostego urządzenia próżniowego zbudowanego w domu.

Ssanie jest kontrolowane za pomocą małego kawałka papieru nad otworem wlotowym. Włącz urządzenie próżniowe i przesuń je po płytce mikroskopu stereoskopowego, aby wyśrodkować jego końcówkę ssącą. Zbierz mszycę na małym pędzlu akwarelowym o rozmiarze dwa lub mniejszym lub mniejszym i zamontuj mszycę na brzusznej stronie w kierunku końcówki ssącej, aby uzyskać łatwy dostęp do grzbietu.

Za pomocą pędzla usuń wosk powierzchniowy z brzucha, który jest obfity w mszycę kapuścianą. Teraz dokładnie wstrząśnij lub zwiruj srebrny klej i za pomocą cienkiej szpilki do owadów nałóż małą kroplę srebrnego kleju na grzbiet mszycy. Pozostaw do wyschnięcia na dwie do trzech minut.

Ponownie wstrząsnąć fiolką i nałożyć kroplę kleju na wysuszoną pierwszą kroplę. Następnie przymocuj złoty drut przygotowanej elektrody owadziej do drugiej kropli srebrnego kleju. Gdy jest jeszcze mokry, utrzymuj drut w miejscu, w którym nie ruszaj się, dopóki klej nie wyschnie.

Jeśli zdarzy się, że klej dostanie się na nogi lub do którejkolwiek z mszyc, zacznij od nowa z nowym zwierzęciem. Elektroda przeciw owadom może być poddana recyklingowi. Po wyschnięciu kleju.

Wyłącz ssanie i uwolnij mszycę z urządzenia próżniowego. Przewodowy owad jest teraz gotowy do użycia do nagrań EPG. Niektóre mszyce mogą być drutowane bez mocowania próżniowego.

W takim przypadku umieść mszycę na kawałku tkanki laboratoryjnej, który jest wystarczająco szorstki, aby mszyca mogła pozostać uchwycona. Podczas nakładania kleju do pierwszej kropli srebrnego kleju można włożyć złoty drut. Jeśli ta kropla jest zbyt mała lub wyschnie zbyt szybko, złoty drut nie przyczepi się prawidłowo.

W takim przypadku po prostu umieść małą kroplę srebrnego kleju na wierzchu pierwszej i włóż złoty drut, poczekaj, aż klej wyschnie. Następnie podnieś mszycę z bibuły za pomocą cienkiej szczotki. Przechowuj przewodowe mszyce, wkładając mosiężny gwóźdź w styropian, aż będzie potrzebny.

Na początek umieść eksperymentalne rośliny w klatce Faradaya na nieprzewodzącym podłożu, takim jak szalka Petriego. Teraz włóż elektrodę roślinną do gleby każdej doniczki. Elektroda roślinna nie jest elektrodą uziemiającą, którą należy zebrać do klatki Faradaya.

Następnie włóż mosiężny kołek elektrody do EPG. Wstępnie dostosuj pozycję rośliny i owada, aż wejdą w kontakt z owadem w żądanej pozycji na roślinie. Korzystając z oprogramowania interfejsu Style plus, które ma stałą częstotliwość próbkowania 100 Hz, wprowadź nazwę pliku, określ czas nagrywania i wpisz tekst, aby określić szczegóły eksperymentu w wierszach komentarza.

Następnie rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania, klikając przycisk Start w lewym górnym rogu. Rozpocznij eksperyment od opuszczenia przewodowej mszycy na roślinę do ośmiu kanałów, co oznacza, że osiem przewodowych owadów może być zarejestrowanych jednocześnie za pomocą jednej konfiguracji EPG, po jednym na roślinę lub więcej mszyc na jednej roślinie. Kiedy mszyca włoży swój styl do rośliny, obwód jest zakończony.

Wahania napięcia sygnału EPG pojawią się na ekranie komputera, dokonają regulacji napięcia i wzmocnienia instalacji w celu optymalnego nagrywania. W większości przypadków mszyca potrzebuje co najmniej godziny, aby wejść w fazę przepływu. Zasilanie o stałym przepływie jest sygnalizowane przez co najmniej 10 minut przebiegu E dwa.

W tym momencie elektroda jest gotowa do odbioru sygnałów elektrycznych z elementu sitowego, które powinny być indukowane tylko wtedy, gdy sygnał E dwa jest stabilny. Ważne jest, aby dostarczyć jeden lub więcej impulsów kalibracyjnych, które zostaną później wykorzystane do oszacowania wielkości sygnałów elektrycznych. Cięcie liścia nożyczkami konsekwentnie indukuje sygnał elektryczny na duże odległości, który jest odbierany przez mszycę zarejestrowaną przez EPG.

W bardziej realistycznym eksperymencie głodna gąsienica jest używana jako środek raniący. Uszkodzenia zadane przez gąsienicę konsekwentnie indukują powolne i szybkie sygnały elektryczne, które przemieszczają się do innych liści i mogą być uzyskane za pomocą elektrod EPG. Hałas generowany przez wprowadzenie gąsienicy nie wpłynie na reakcję elektrofizjologiczną rośliny, ale może go zamaskować, aby zminimalizować ten hałas.

Eksperymentator powinien być uziemiony, aby sprawdzić, czy żerująca gąsienica indukuje sygnały elektryczne w jedzonym liściu. Głodną gąsienicę umieszcza się na liściu, na którym znajduje się również mszyca zarejestrowana przez EPG, gdy dwa różne liście zostały kolejno przecięte nożyczkami na styku blaszki grzbietowej. Elektroda EPG umieszczona na środkowej nerwie nienaruszonego liścia, który sąsiadował z obydwoma ścinanymi liśćmi, wykryła podobne reakcje elektrofizjologiczne tego samego elementu sita na te rany.

Te elektrofizjologiczne składały się z powolnej depolaryzacji i szybkiej depolaryzacji nałożonej na wolną. W innym eksperymencie również przecięto dwa liście, ale w tym przypadku jeden był sąsiadem liścia zawierającego elektrodę EPG, podczas gdy drugi nie był sąsiadem liścia z elektrodą EPG. W tym przypadku pojedynczy element sitowy inaczej reagował na rany.

Rana na liściu, który nie jest sąsiadem, najpierw indukowała tylko powolny sygnał elektryczny, podczas gdy rana na sąsiednim liściu indukowała sygnał złożony z powolnymi i szybkimi składnikami. Wyniki te sugerują, że elementy SIV są w stanie wykryć lokalizację uszkodzeń w tym miejscu za pomocą mszycy podłączonej do systemu EPG, zapisy wewnątrzkomórkowe wykonano z marginalnego elementu sitowego w liściu rzodkiewnika. Ścięcie sąsiedniego liścia wywołało sygnał elektryczny, który był przesyłany do elementu sitowego, w który włożony był sztyft mszycy.

W przeciwieństwie do elementów sita w żyłach głównych, elementy sita w żyłach brzeżnych reagowały na zdalne uszkodzenia tylko jedną falą powolnej depolaryzacji, która może odpowiadać fali powolnej depolaryzacji w elementach sita centralnego. Wykres penetracji elektrycznej lub powtórzenie to metoda, która może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii roślin i fizjologii roślin, takie jak na przykład, które znajdują się w kanałach, leżą u podstaw sygnałów elektrycznych na duże odległości, które przemieszczają się od liścia do liścia, a co najważniejsze, jaka jest rola tych sygnałów w adaptacji roślin do ich środowiska? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć pomysł, jak przygotować rośliny i owady do EPG.

Nagrywanie okablowania owadów wydaje się skomplikowane, ale wykazaliśmy, że jest to dość proste i może zachęcić Cię do wdrożenia go we własnych badaniach.