Name: Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Poznaj nowe zastosowanie techniki EPG do rejestracji sygnałów elektrycznych w elementach sitowych roślin podczas żerowania mszyc. Ta metoda pozwala badać dalekodystansową komunikację elektrofizjologiczną roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VSR był wspierany przez IIF Marie Curie Grant (WOUND IN EARTH, akronim od: Sygnały elektryczne indukowane ranami u Arabidopsis thaliana).

1. Hodowla mszyc
Uwaga: Wybór gatunku rośliny i mszycy do rejestracji EPG zależy od celu badań. W przypadku badań nad Arabidopsis thaliana odpowiednim gatunkiem mszycy jest Brevicoryne brassicae.
<ol>
	<li>Hoduj mszyce B. brassicae w szklarni na Brassica oleracea. Rośliny wykorzystywane do hodowli mszyc należy trzymać w klatkach, aby uniknąć zanieczyszczenia innych roślin. Rośliny do hodowli mszyc oraz rośliny eksperymentalne (w naszym przypadku B. oleracea i A. thaliana) należy przechowywać w oddzielnych pomieszczeniach, aby zapobiec przypadkowemu przeniesieniu mszyc na rośliny eksperymentalne.</li>
	<li>Przenoś mszyce na świeże rośliny mniej więcej co 2 tygodnie, zanim spowodują one znaczne uszkodzenia rośliny lub osiągną nadmierną populację. W celu zainicjowania nowej kolonii przenieś 10-20 dorosłych mszyc na świeżą roślinę hodowlaną.</li>
	<li>Regularnie monitoruj rośliny hodowlane pod kątem zanieczyszczenia niepożądanymi gatunkami mszyc, innymi owadami roślinożernymi, pasożytnikami mszyc oraz grzybami, które mogą wpływać na kondycję kolonii mszyc.</li>
	<li>Do rejestracji EPG zbieraj dorosłe, bezskrzydłe mszyce do jednego tygodnia po ich ostatnim linieniu.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentów niewykorzystane rośliny eksperymentalne należy zwrócić do komory wzrostu, ponieważ często znajdują się na nich potomstwo powstałe podczas rejestracji, które mogłoby nieumyślnie zanieczyścić inne rośliny.</li>
</ol>
2. Okablowanie owadów do rejestracji EPG
<ol>
	<li>Aby wykonać elektrody dla owadów, należy przygotować mosiężne piny łączące (gwoździe, Ø 1,2 mm), cienki drut miedziany (Ø 0,2 mm), bardzo cienki drut złoty (Ø ok. 20 µm), klej srebrowy na bazie wody, prostą małą lutownicę z topnikiem i drutem lutowniczym z rdzeniem kalafoniowym, stereomikroskop z powiększeniem 10X, małe nożyczki lub skalpel, dwie precyzyjne pęsety oraz arkusz lub pudełko ze styropianu. Uwaga: użyteczny może być mikser wirowkowy (vortex). Uwaga: protokół krok po kroku dotyczący wykonania elektrod przedstawiono na Rysunku 2.</li>
	<li>Do manipulacji z mszycami i nakładania kleju należy przygotować: mały i miękki pędzelek akwarelowy z włosia wielbłąda (rozmiar 2 lub mniejszy) oraz szpilki entomologiczne, takie jak te stosowane w kolekcjach owadów, choć równie dobrze sprawdzi się cienka igła do szycia lub wykałaczka. Krok 4 pokazuje, jak rozpocząć pomiar EPG.</li>
	<li>Krok 1. 
	​Uwaga: kroki 1 i 2 poniżej opisują sposób przygotowania elektrod dla owadów bez udziału mszycy. Krok 3 pokazuje, jak podłączyć mszycę do elektrody. Podczas montażu drutów zaleca się próżniową unieruchomienie mszycy, choć nie zawsze jest to wymagane w przypadku gatunków wolno poruszających się (np. B. brassicae).
	<ol>
		<li>Włączyć lutownicę i roztopić niewielką ilość drutu lutowniczego na jej grocie (Rysunek 2A). Zwilżyć głowicę mosiężnego pinu łączącego topnikiem lutowniczym (Rysunek 2B) i zanurzyć ją w roztopionym spoiwie lutowniczym (Rysunek 2C).</li>
		<li>Na jednym końcu kawałka cienkiego drutu miedzianego o długości 1-2 cm nałożyć warstwę roztopionego spoiwa lutowniczego (Rysunek 2D). Następnie przyłożyć pin i drut miedziany do gorącego grota lutownicy (Rysunek 2E), a potem odsunąć je, aby ostygły i zastygły (Rysunek 2F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krok 2.
	<ol>
		<li>Fiolkę z klejem srebrowym energicznie wstrząsać (lub mieszać w vortexie) przez kilka minut, aż powstanie gładka emulsja. Na przedmiotowym stoliku stereomikroskopu wyciąć (nożyczkami lub skalpelem) kilka kawałków złotego drutu (o długości około 1,5 cm) (Rysunek 2G).</li>
		<li>Wziąć mosiężny pin z przylutowanym drutem miedzianym (wykonany w sekcji 2.3) i zanurzyć wolny koniec drutu miedzianego w małym zbiorniczku kleju srebrowego, który zgromadził się pod nakrętką fiolki po jej otwarciu (Rysunek 2H). Uwaga: potrzebna jest tylko mała kropla.</li>
		<li>Przesunąć zanurzony w kleju koniec drutu miedzianego do kawałka złotego drutu, lekko go unosząc, aby uniknąć rozmazania kleju na stoliku stereomikroskopu. Należy doprowadzić do nałożenia się drutu miedzianego i złotego na odcinku kilku mm (Rysunek 2I), rozprowadzając klej wzdłuż miejsca styku obu drutów.</li>
		<li>Odczekać, aż klej wyschnie na tyle, by utrzymać druty razem. Po wyschnięciu sprawdzić kontakt kleju i w razie stwierdzenia miejsc wolnych od kleju w miejscu połączenia drutów, dodać świeży klej za pomocą małego pinu lub innego kawałka drutu miedzianego.</li>
		<li>Po przygotowaniu elektrody dla owada należy ją przechowywać, na przykład włożoną w kawałek styropianu. 
		Uwaga: długość złotego drutu determinuje swobodę ruchów mszycy: jeśli jest zbyt krótki (mniej niż 5 mm), mszyca może czuć się ograniczona i nie będzie zachowywać się naturalnie; jeśli jest zbyt długi (&gt;2 cm), mszyca będzie poruszać się swobodnie. Mszyce mają tendencję do przemieszczania się na stronę adaksjalną liści, jeśli mają taką możliwość. Jeśli złoty drut dotknie liścia, nastąpi zwarcie sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krok 3.
	<ol>
		<li>Mszyca może być utrzymywana w miejscu za pomocą lekkiego ssania próżniowego; w tym przypadku należy zainstalować urządzenie ssące pod stereomikroskopem. Otwór ssący należy umieścić w centrum pola widzenia.</li>
		<li>Fiolkę z klejem srebrowym energicznie wstrząsać przez kilka minut (lub mieszać w vortexie), aż powstanie gładka emulsja. Chwycić mszycę za pomocą małego pędzelka.</li>
		<li>Włączyć urządzenie ssące i umieścić mszycę na otworze ssącym (Rysunek 2J), tak aby grzbiet odwłoka był zwrócony w stronę eksperymentatora. Za pomocą precyzyjnego pędzelka usunąć wosk powierzchniowy z odwłoka (obfity u mszyc kapuśnianych).</li>
		<li>Otworzyć fiolkę z klejem i zwilżyć pin bardzo małą kroplą kleju srebrowego (Rysunek 2K). Nanieść kroplę kleju srebrowego na grzbiet odwłoka mszycy (Rysunek 2L-M). Pozostawić tę kroplę do całkowitego wyschnięcia przez kilka minut, ponownie energicznie wstrząsnąć fiolką z klejem i dodać drugą kroplę kleju srebrowego na pierwszą. Uwaga: mimo że klej srebrowy jest przewodnikiem elektrycznym, nie powoduje on znaczących uszkodzeń kutykuli owada.</li>
		<li>Po zamknięciu fiolki z klejem wsunąć wolny koniec złotego drutu w mokrą kroplę i trzymać drut nieruchomo do całkowitego wyschnięcia kleju (Rysunek 2N). Unikać rozmazania kleju na odnóżach lub czułkach; w takim przypadku należy odrzucić daną mszycę.</li>
		<li>Wyłączyć urządzenie do unieruchomienia próżniowego i ostrożnie podnieść owada (Rysunek 2O). W razie potrzeby użyć precyzyjnego pędzelka, aby pomóc w podniesieniu mszycy z urządzenia ssącego. 
		​Uwaga: montaż drutów u B. brassicae nie wymaga próżni, ponieważ można to wykonać na kawałku precyzyjnej chusteczki laboratoryjnej, której chropowata powierzchnia zapewnia mszycy wystarczającą przyczepność, dzięki czemu nie zostanie ona podniesiona po naniesieniu kropli mokrego kleju na odwłok. Po wyschnięciu kleju mszycę można podnieść z chusteczki za pomocą precyzyjnego pędzelka.</li>
		<li>Włożyć mosiężny pin z podłączonym owadem do styropianu i w razie potrzeby kontynuować montaż drutów u wszystkich pozostałych owadów, które mają zostać użyte w sesji pomiarowej EPG. 
		Uwaga: opisane protokoły montażu drutów u mszyc sprawdzają się w naszej praktyce. Użytkownik może opracować własną metodę montażu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krok 4.
	<ol>
		<li>Umieścić rośliny w klatce Faradaya (Rysunek 2P) na nieprzewodzącym podłożu: należy użyć szalek Petriego lub płyty szklanej lub plastikowej.</li>
		<li>Włożyć elektrodę roślinną do gleby w każdej doniczce. Wsunąć mosiężny pin owada z drutami do wejścia przedwzmacniacza EPG (Rysunek 2Q). Uwaga: elektroda glebowa nie odpowiada elektrodzie uziemiającej stosowanej w innych technikach elektrofizjologicznych. Posiada ona napięcie przesunięcia niezbędne do regulacji i kompensacji napięć polaryzacji elektrod.</li>
		<li>W interfejsie oprogramowania akwizycyjnego Stylet+, przy stałej częstotliwości próbkowania 100 Hz, wpisać nazwę pliku, określić czas pomiaru i wpisać szczegóły eksperymentu (zabieg, gatunek rośliny/owada, itp.) w liniach komentarza 2 i 3.</li>
		<li>Opuścić owady na odpowiednią powierzchnię lądowania na roślinie i rozpocząć sesję pomiarową, klikając przycisk Start w interfejsie oprogramowania akwizycyjnego (Stylet+). 
		Uwaga 1: w układzie EPG można jednocześnie używać maksymalnie 8 kanałów. Można zastosować jedną lub kilka elektrod EPG na roślinę. 
		Uwaga 2: gdy celem badania jest zachowanie mszyc, należy rozpocząć pomiar przed dostępem mszyc do rośliny, aby nie pominąć pierwszych aktywności związanych z penetracją rośliny.</li>
		<li>W celu badania odpowiedzi elektrofizjologicznych SE na bodźce, należy odczekać co najmniej 10 min po wejściu mszycy w fazę floemu, aby upewnić się, że mszyca znajduje się w fazie trwałego pobierania treści floemu, a linia bazowa sygnału jest stabilna. Dopiero wtedy należy rozpocząć jakikolwiek eksperyment z pobudzaniem rośliny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ aparatury do respiracji gleby, schemat eksperymentu z roślinami, pomiar uwalniania CO2, badanie naukowe." src="/files/ftp_upload/52826/52826fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wykonanie elektrod EPG z mszycami lub innymi owadami z rzędu półskrzydłych do rejestracji elektrycznego wykresu penetracji (EPG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Panele A-I, kroki niezbędne do przygotowania elektrod EPG bez mszycy. Najpierw roztopić kawałek spoiwa na grocie lutownicy (A). Następnie zanurzyć główkę mosiężnej pinezki w kropli topnika (B) i dotknąć nią roztopionego metalu na grocie lutownicy (C). Bezpośrednio po tym kroku przyłożyć koniec miedzianego drutu do grotu lutownicy, aby przytwierdzić go do główki mosiężnej pinezki (E-F). Za pomocą skalpela lub ostrza odciąć kawałek złotego drutu (G). Zanurzyć wolny koniec miedzianego drutu (połączonego drugim końcem z mosiężną pinezką) w srebrnym kleju (H) i szybko przyłączyć do niego złoty drut (I), zanim srebro wyschnie. Złoty drut jest doskonałym przewodnikiem i może ulec polaryzacji. W rzeczywistości w większości przypadków polaryzacja jest zbyt mała, aby można ją było wykryć, a jeśli tak jest, można ją skompensować za pomocą napięcia offsetu (V).
Panele J-O, etapy niezbędne do połączenia mszycy (lub innego owada z rzędu półskrzydłych) z elektrodą. Najpierw ostrożnie podnieś mszycę za pomocą cienkiego pędzla akwarelowego i umieść ją na wlocie urządzenia do ssania próżniowego (J). Włącz pompę próżniową i zakryj otwór zaworu powietrznego kawałkiem papieru, aby wytworzyć ssanie. Zanurz końcówkę szpilki entomologicznej w srebrnym kleju (K), a następnie, korzystając ze stereomikroskopu (L-M), nanieś małą kroplę kleju na górną część odwłoka mszycy. W ciągu kolejnych ~20 s, zanim kropla srebrnego kleju na mszycy wyschnie, wprowadź koniec złotego drutu elektrody do mokrej kropli srebrnego kleju i przytrzymaj go przez 1-3 min, aż srebrny klej całkowicie wyschnie na powietrzu (N). W tym momencie wyłącz ssanie, usuwając kawałek papieru zakrywający otwór zaworu powietrznego urządzenia ssącego, i ostrożnie zdejmij mszycę z urządzenia: podniesienie mszycy po zamocowaniu elektrody często wymaga pomocy cienkiego pędzla (O).
Panel P przedstawia ogólny widok całej konfiguracji EPG wewnątrz klatki Faradaya, a panel Q przedstawia ogólny widok kombinacji roślina-mszyca do EPG. Szczegółniejsze wyjaśnienie tego procesu znajduje się w powyższej sekcji 2.
Małe litery to etykiety odnoszące się do elementów niezbędnych do wykonania elektrod EPG: a: lutownica; b: stopiony metal lutowniczy; c: topnik do lutowania; d: mosiężny pin łączący (gwóźdź); e: miedziany drut; f: złoty drut Ø 18µm; g: urządzenie ssące; h: mszyca; i: wodny klej srebrowy; j: klatka Faradaya; k: elektroda roślinna; l: złącze wejściowe (BNC) przedwzmacniacza EPG.

<ol><li>Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+in+vivo.+intracellular+recordings+of+caterpillar-induced+depolarization+waves+in+sieve+elements+using+aphid+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes.</a> New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).</li>
<li>Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Questions%29n+on+phloem+biology.+1.+Electropotential+waves%2C+Ca2%2B+fluxes+and+cellular+cascades+along+the+propagation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">(Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway.</a> Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).</li>
<li>Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathway+for+electrical+signal+conduction+in+the+wounded+tomato+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant.</a> Planta. 200, 50-57 (1996).</li>
<li>Fromm, J., Eschrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+ionic+movements+with+phloem+unloading+and+loading+in+barley+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).</li>
<li>Brette, R., Destexhe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Neural+Activity+Measurement%22%5BJournal%5D)">Intracellular Recordings.</a> Handbook of Neural Activity Measurement. Brette, R., Destexhe, A. , Cambridge University Press. 44-91 (2012).</li>
<li>Umrath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+Plasma+und+Plasamstromung+an+Characeen.+IV.+Potentialmessungen+an+Nitella+mucronata.+mit+besonderer+Ber%C3%BCcksichtingung+der+Erregungserscheinungen%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen.</a> Protoplasma. 9, 576-597 (1930).</li>
<li>Umrath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Erregungsvorgang+bei+Nitella+mucronata%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata.</a> Protoplasma. 17, 258-300 (1932).</li>
<li>Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+the+contribution+of+cytosolic+Na%2B+and+K%2B+to+salt+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance.</a> Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).</li>
<li>Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+two+species+of+aphid+ingest+food+through+an+open+stylet+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath.</a> Experientia. 20 (10), 582(1964).</li>
<li>McLean, D. L., Kinsey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+electronically+recording+aphid+feeding+and+salivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A technique for electronically recording aphid feeding and salivation.</a> Nature. 202, 1358-1359 (1965).</li>
<li>Tjallingii, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+recording+of+penetration+behaviour+by+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Electronic recording of penetration behaviour by aphids.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).</li>
<li>Tjallingii, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potentials+as+an+indication+for+plant+cell+penetration+by+aphid+stylets%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).</li>
<li>Alvarez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+Solanum+stoloniferum.+responses+to+probing+by+the+green+peach+aphid+Myzus+persicae.+and+the+potato+aphid+Macrosiphum+euphorbiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae.</a> Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).</li>
<li>Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-persistently+transmitted+virus+induces+a+pull-push+strategy+in+its+aphid+vector+to+optimize+transmission+and+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread.</a> Virus Research. 186, 38-46 (2014).</li>
<li>Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Penetration+Graph+studies+to+investigate+the+effects+of+cyantraniliprole+on+feeding+behavior+of+Myzus+persicae.+%28Hemiptera%3A+Aphididae%29+on+Capsicum+annuum%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum.</a> Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).</li>
<li>Morris, G., Foster, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duelling+aphids%3A+electrical+penetration+graphs+reveal+the+value+of+fighting+for+a+feeding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site.</a> Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).</li>
</ol>

WFT uruchomił EPG Systems jako działalność emerytalną i jest z nią powiązany finansowo.

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół wykonywania zapisów wykresu penetracji elektrycznej (EPG). Technika EPG jest dobrze znana, ma 100-200 aktywnych użytkowników na całym świecie i została wdrożona w wielu badaniach na różne tematy, na przykład: a) odporność roślin żywicielskich na mszyce i inne owady przenoszące stylety13; b) mechanizmy przenoszenia wirusów roślinnych i patogenów14; c) sposób działania insektycydów (toksyczność i zmiany zachowania)15; d) EPG były nawet przydatne do w...

Zdolność do generowania dalekosiężnych sygnałów elektrycznych jest korzystną cechą organizmów wielokomórkowych, która umożliwia efektywne reagowanie na bodźce zewnętrzne. Cecha ta ewoluowała niezależnie u roślin i zwierząt, stanowiąc tym samym przykład ewolucji konwergentnej. Biorąc pod uwagę, że sygnały elektryczne są sprzężone z istotnymi funkcjami u zwierząt, takimi jak przekazywanie impulsów nerwowych i skurcze mięśni, molekularne podstawy, mechanizm przekazywania oraz funkcja indukowanych bodźcami sygnałów elektrycznych u zwierząt są przedmiotem intensywnych badań. W przeciwieństwie do tego, indukowana bodźcami sygnalizacja elektryczna u roślin była rzadziej przedmiotem zainteresowania badawczego. Chociaż rośliny nie posiadają nerwów ani mięśni, wydaje się, że istnieje wystarczająco dużo dowodów, aby założyć, że indukowane bodźcami sygnały elektryczne u roślin odgrywają kluczową rolę w ich reakcjach na czynniki środowiskowe.
Floem, żywy komponent układu przewodzącego roślin, został uznany za główny substrat dla transmisji indukowanych bodźcem sygnałów elektrycznych, przesyłanych z obszarów stymulowanych/uszkodzonych do obszarów niestymulowanych/nieuszkodzonych2. Głównymi komórkami floemu są elementy sitowe (SEs) – stosunkowo proste, wydłużone komórki. Końce SEs są połączone z innymi SEs, tworząc ciągły, niskooporowy system rurek sitowych rozprzestrzeniony w całej roślinie. Istnieje jednak bardzo niewiele badań nad właściwościami elektrycznymi tych wysoce wyspecjalizowanych komórek. W tych wcześniejszych badaniach naukowcy uzyskiwali dostęp do SEs za pomocą szklanych mikroelektrod3 lub szklanych elektrod sprzężonych z wprowadzonymi do rośliny stylletami mszyc, po przeprowadzeniu stylektomii (odcięcia)4. Szklane mikroelektrody wykonuje się z kapilar szklanych, których jeden koniec jest rozciągany pod wpływem ciepła do postaci cienkiej końcówki o średnicy mniejszej niż 1 µm, a następnie napełnia się je roztworem KCl. Przewód Ag/AgCl lub platynowy, wprowadzony do szklanej elektrody wypełnionej KCl, jest następnie podłączany do wejścia wzmacniacza, a elektrodę odniesienia umieszcza się w kąpieli otaczającej badaną komórkę, zamykając obwód. Taki układ rejestruje różnicę potencjałów między zewnątrzkomórkową elektrodą odniesienia a wewnątrzkomórkową elektrodą pomiarową, tj. potencjał błonowy komórki5. Za pomocą tej metody Umrath wykonał pierwszy zapis wewnątrzkomórkowy z komórki roślinnej, wykorzystując algi Nitella6,7. Nitella jest stosunkowo prostym organizmem o dużych komórkach, a zatem podatnym na eksperymenty z zakresu elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej. W przeciwieństwie do tego, wprowadzenie wewnątrzkomórkowych elektrod szklanych do małych komórek wielokomórkowych, trójwymiarowych roślin lądowych jest technicznie wymagające, wymaga wysoko wykwalifikowanego badacza, a także zaawansowanego sprzętu do wizualizacji, mikromanipulacji i antywibracyjnego. Chociaż elektrody szklane nadają się do rejestracji sygnałów z komórek powierzchniowych roślin, takich jak komórki epidermy korzenia8, zapisy wewnątrzkomórkowe z komórek głęboko osadzonych w tkance roślinnej, takich jak SEs, najprawdopodobniej wywołują odpowiedzi indukowane uszkodzeniem, co zafałszowuje wyniki. W 1989 roku Fromm i Eschrich zgłosili zastosowanie alternatywnej metody, zwanej „metodą mszycą”, w której elektrody szklane są sprzężone ze stylletami mszyc po stylektomii4. Metoda mszyca jest małoinwazyjna, ponieważ elastyczne styllety nie powodują uszkodzeń tkanek ani komórek, w przeciwieństwie do elektrod szklanych. Styllety mszyc są genialnym naturalnym rozwiązaniem do penetracji roślin, a mszyce są znacznie sprawniejsze od ludzi w odnajdywaniu SEs. Niestety, ta metoda mszyca jest również bardzo wymagająca pod względem wiedzy technicznej i wyposażenia. Ponadto sukces każdego eksperymentu z zastosowaniem tej techniki zależy całkowicie od tego, czy mszyca w momencie stylektomii znajduje się w trybie żerowania – ze stylletem stabilnie wprowadzonym do SE. Patrząc wstecz, można zauważyć, że szanse na sukces tej techniki można by zwiększyć, dodając do układu eksperymentalnego instrument pozwalający zidentyfikować, czy styllet mszycy znajduje się w SE w momencie przeprowadzania stylektomii.
W 1964 roku McLean i Kinsey opisali „elektroniczny system monitorowania” do badania zachowań żerowania mszyc w czasie rzeczywistym9,10. W systemie tym mszyca i roślina przebita stylitem zostały włączone do obwodu elektrycznego. Później, w 1978 roku, Tjallingii opracował zmodyfikowaną wersję tego systemu, zwaną systemem „elektrycznego wykresu penetracji” (Electrical Penetration Graph – EPG)11,12. Podczas gdy pierwotny elektroniczny system monitorowania był czuły jedynie na potencjały wynikające z rezystancji, w systemie EPG, oprócz potencjałów wynikających z rezystancji (R) owada, można było rejestrować potencjały siły elektromotorycznej (sem), t.j. generowane w roślinie lub w owadzie. Stanowi to istotną poprawę, ponieważ oba komponenty sygnału, sem i R, dostarczają biologicznie istotnych informacji o zdarzeniach podczas penetracji rośliny przez mszyce. To, co czyni przedwzmacniacz EPG czułym na komponenty R, to jego stosunkowo niska rezystancja wejściowa wynosząca 1 GΩ, która jest bliska średniej rezystancji układu roślina/mszyca. Do rośliny przyłożone jest niewielkie napięcie przesunięcia (Rysunek 1, V) wynoszące około +100 mV, które następnie dzieli się pomiędzy roślinę i owada z jednej strony, a rezystancję wejściową z drugiej. Napięcia i ich zmiany są mierzone w punkcie (Rysunek 1A,B) między owadem a rezystorem wejściowym. Zatem komponenty R reprezentują modulacje napięcia przesunięcia wynikające z rezystancji roślina-mszyca, podczas gdy komponenty sem stanowią pewną część potencjałów roślinnych na końcówce stylitu oraz potencjałów wywołanych w owadzie. Potencjały roślinne — tutaj najistotniejsze — to głównie potencjały błonowe komórek roślinnych przebitych stylitami mszycy. Potencjały owada wydają się być głównie potencjałami strumieniowymi wywołanymi ruchami płynów w dwóch kanałach stylitu, t.j. kanale pokarmowym i ślinowym; w EPG nie rejestruje się wewnętrznych potencjałów nerwowych ani mięśniowych. W praktyce końcówka stylitu pełni funkcję końcówki elektrody. Wszystkie komórki roślinne są naładowane ujemnie wewnątrz w stosunku do dodatniego zewnętrza komórki. Prąd elektryczny (t.j. ruch naładowanych jonów w roztworze wodnym) płynący z wnętrza na zewnątrz i vice versa jest bardzo ograniczony ze względu na wysoką rezystancję błony komórkowej. Normalnie potencjał spoczynkowy pozostaje stały. Jednak gdy jony ujemne przemieszczają się na zewnątrz lub jony dodatnie do wnętrza poprzez błonę komórkową, potencjał błonowy ulega zmniejszeniu, t.j. następuje „depolaryzacja”. Depolaryzacja zachodzi w przypadku pobudzenia komórki. Jony przemieszczają się wtedy do wewnątrz lub na zewnątrz, gdy otwierają się specyficzne kanały jonowe w błonie lub gdy błona zostanie uszkodzona i jony wyciekają na zewnątrz i do wewnątrz. Wszystkie komórki posiadają w błonie plazmatycznej kanały jonowe i pompy, które przywracają potencjał błonowy do poziomu spoczynkowego poprzez odtworzenie pierwotnego stężenia różnych jonów wewnątrz komórki. Potencjał spoczynkowy i jego zmiany są komponentami sem, w związku z czym technika EPG nadaje się do ich pomiaru.
<img alt="Pomiar potencjału elektrochemicznego w stylcie mszycy, schemat układu EPG, wykres napięcie-czas." src="/files/ftp_upload/52826/52826fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Elektrody-EPG. Elektrodą-EPG jest żywa mszyca zintegrowana z obwodem elektrycznego grafu penetracji (EPG), której stylcie jest wprowadzony do elementu sitowego (SE) w stabilnym trybie żerowania. Jeśli przebity stylctem SE jest w stanie spoczynku (panel A), napięcie w obwodzie rejestrowane przez EPG jest stabilne i znajduje się na poziomie potencjału spoczynkowego (panel C, Rest). Jeśli SE zostanie pobudzony, jego błona ulega depolaryzacji (panel B), co w EPG objawia się jako stopniowy wzrost napięcia (panel C, Depolarization). W miarę jak równowaga jonowa w SE powraca do stanu spoczynku, tzn. gdy następuje repolaryzacja, napięcie rejestrowane przez EPG stopniowo spada do poziomu potencjału spoczynkowego (panel C, Repolarization). W panelu C oznaczenia „A” i „B” odnoszą się odpowiednio do scenariuszy przedstawionych w panelach A i B. V = regulowane źródło napięcia offsetowego. Ri = rezystor wejściowy. Równolegle do zewnętrznego rezystora 1 GΩ, wzmacniacz posiada wewnętrzny (w wzmacniaczu operacyjnym) rezystor o wysokiej wartości 1.5 TΩ (panele A i B, kolor szary). Poprzez zdalne sterowanie przełącznikiem można zmienić przedwzmacniacz EPG z trybu normalnego na tryb emf, co pozwala na uzyskanie bardzo dokładnych wartości napięcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
W następnej sekcji przedstawiamy czytelnikowi podstawowy protokół przeprowadzania eksperymentów EPG, który jest aktualny zarówno dla badań koncentrujących się na owadach, jak i na roślinach.

<table><tbody><tr><td>Mosiężne kołki łącznikowe</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>&Phi; 1,2 mm</td></tr><tr><td>Cienki drut miedziany</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>ok. &Phi; 0,2 mm</td></tr><tr><td>Cienki drut złoty</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>&Phi; 18 &micro; m</td></tr><tr><td>Sklep</td><td></td> z<td>płynami lutowniczymi</td><td>pasującymi do drutu lutowniczego</td></tr><tr><td>Drut lutowniczy z rdzeniem żywicznym</td><td>Sklep</td><td></td><td></td>z narzędziami</tr><tr><td>Styropian</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klej srebrny na bazie wody</td><td>EPG Systems</td><td></td><td><a href="http://www.epgsystems.eu/">przepis w: www.epgsystems.eu</a></td></tr><tr><td>Chusteczki papierowe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Śruba lutownicza</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>Hund Wetzlar</td><td></td><td>minimalne powiększenie to 10X</td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>A. Hartenstein</td><td>L46</td><td></td></tr><tr><td>Pędzle akwarelowe</td><td>dowolny</td><td></td><td>Numer 1 lub 2</td></tr><tr><td>Urządzenie</td><td></td><td></td> do zasysania powietrza <td>patrz opis w: www.epgsystems.eu</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>dowolne</td><td></td><td>nr 1 lub 2</td></tr><tr><td>Solidny stół</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klatka</td><td></td><td></td> Faradaya <td>Ręcznie robiony</td></tr><tr><td>komputer</td><td>Fujitsu Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>Stylet+d</td></tr><tr><td>Giga-4 (-8) Kompletny system</td><td>EPG Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zawiera:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Główna skrzynka sterownicza z wyjściem</td><td></td> USB <td>Di155/Di710</td><td>12/14 bit, szybkość 100&nbsp; Sondy EPG Hz (softw. fixed)</td></tr> <tr><td>4 (8)</td><td></td><td></td><td>50x przedwzmacniacz DC</td></tr><tr><td>Zaciski obrotowe na pręcie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td></td><td></td> prądu stałego <td>bipolarny, 230/115 VAC do -/+8 VDC</td></tr><tr><td>Elektrody i</td><td></td><td></td><td></td>zakładowe</tr><tr><td>Dodatkowe testowe i uziemiające&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (epg) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Właściwości elektrofizjologiczne komórek są często badane in vitro, po oddzieleniu ich od ich rodzimego środowiska. Jednak badanie transmisji elektrycznej między odległymi komórkami w organizmie wymaga nagrań in vivo, wolnych od artefaktów komórek osadzonych w ich naturalnym środowisku. Przesyłanie sygnałów elektrycznych z uszkodzonych do niezranionych obszarów w roślinie od dawna wzbudza zainteresowanie botaników. Łyko, żywa część układu krwionośnego rośliny, która jest rozsiana po całej roślinie, została postulowana jako główna tkanka w transmisji elektrycznej u roślin. Brak odpowiednich metod elektrofizjologicznych stwarza wiele wyzwań dla badania właściwości elektrycznych komórek łyka in vivo. W tym miejscu przedstawiamy nowatorskie podejście do elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej elementów sitowych (SE), które wykorzystuje żywe mszyce lub inne owady żywiące się łykiem pluskwiak, zintegrowane w obwodzie wykresu penetracji elektrycznej (EPG). Wszechstronność, solidność i dokładność tej metody umożliwiły rejestrowanie i szczegółowe badanie sygnałów elektrycznych indukowanych raną w SE żył centralnych rośliny Arabidopsis thaliana1. Tutaj pokazujemy, że elektrody EPG można łatwo wdrożyć do wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologicznych SE w żyłach brzeżnych, a także do badania zdolności SE do reagowania sygnałami elektrycznymi na kilka bodźców zewnętrznych. Podejście EPG zastosowane do elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej SE może być zastosowane do wielu różnych gatunków roślin, w dużej liczbie kombinacji roślina/owad i w wielu celach badawczych.

W poprzednim badaniu zastosowaliśmy technikę elektrod EPG w celu charakterystyki sygnałów elektrycznych generowanych w SE żyłki głównej podczas ataku gąsienic1. Żyłka główna jest preferowanym miejscem insercji konwencjonalnych elektrod szklanych, jak również elektrod ze szklanym styletem, ponieważ charakteryzuje się dużym zagęszczeniem SE i jest stosunkowo wytrzymała, co ułatwia unieruchomienie niezbędne do zastosowania tych technik. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy wszechstronność elektrod EPG w celu zebran...

Wykres penetracji elektrycznej (EPG) jest dobrze znaną techniką badania zachowań żywieniowych owadów noszących stylet. W tym artykule przedstawiamy nowe zastosowanie EPG jako nieinwazyjnego narzędzia do pozyskiwania wewnątrzkomórkowych zapisów elektrofizjologii elementów sitowych (SE), komórek tworzących naczynia krwionośne łyka u roślin.

Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie dalekosiężnych sygnałów elektrycznych przesyłanych za pośrednictwem elementów sitowych od obszaru podgryzanego przez gąsienicę do nieuszkodzonego obszaru rośliny. Osiąga się to poprzez zbudowanie układu do rejestracji elektrycznego grafu penetracji (elektrycznego grafu penetracyjnego) lub układu EPG, który integruje owada ssącego, takiego jak mszyca, oraz roślinę. Mszyca wprowadza swój styllet do rośliny, zamykając tym samym obwód, co rozpoczyna rejestrację EPG.Ostatecznie mszyca wprowadza swój styllet do elementu sitowego i przez kilka minut wydziela do niego ślinę, po czym następuje długotrwała faza pobierania pokarmu; zarówno faza saliwacji (E1), jak i faza pobierania (E2) charakteryzują się niewielkimi i rytmicznymi potencjałami strumieniowymi. Następnie gąsienicę umieszcza się na liściu i pozostawia do żerowania. Podczas gdy mszyca podłączona do EPG nadal pobiera pokarm z kwiatostanu na sąsiednim liściu, uszkodzenie nerwu głównego zadane przez gąsienicę zainicjuje sygnał elektryczny, który zostanie przesłany poprzez floem do pozostałych liści, w tym do liścia, z którego żywi się mszyca podłączona do EPG.Wielkość sygnału można zmierzyć poprzez porównanie go z impulsem kalibracyjnym o znanej wielkości, który został zastosowany wcześniej podczas fazy E2 lub fazy pobierania pokarmu. Wyniki pokazują, że uszkodzenie liścia spowodowane przez gąsienicę konsekwentnie indukuje złożony i znacząco duży sygnał elektryczny w przepływie liścia sąsiedniego, składający się z pierwszej komponenty wolnej oraz drugiej, nałożonej na pierwszą komponenty szybkiej. Technika elektrycznego wykresu penetracji została wprowadzona w latach 60. XX wieku.Monitorowanie EPG w znacznym stopniu przyczyniło się do naszej wiedzy na temat penetracji roślin przez mszyce i inne owady hemipteryczne. Głównym interesem ekonomicznym jest badanie mechanizmów odporności roślin gospodarzy, a także mechanizmów przenoszenia wirusów roślinnych. W związku z tym opracowałem koncepcję wykorzystania EPG jako metody elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej u roślin poprzez zestawienie zapisów EPG z pomiarami wewnątrzkomórkowymi wykonywanymi za pomocą konwencjonalnych elektrod szklanych wypełnionych chlorkiem potasu, zarówno w przypadku zapisów EPC, jak i standardowych pomiarów przeprowadzanych elektrodami szklanymi.Występują dwa poziomy napięcia: stosunkowo wysoki poziom napięcia, który odpowiada wewnątrzkomórkowemu położeniu końcówki elektrody szklanej lub końcówki stylu AEs, oraz stosunkowo niski poziom napięcia, który odpowiada wewnątrzkomórkowemu położeniu elektrody szklanej lub oczka AEs. Ma to miejsce w przypadku EPG. Podczas hodowli mszyc do pomiarów EPG wybór rośliny i gatunku mszycy zależy od celu badań; w badaniach nad szybką opaną odpowiednie są mszyce hodowane w szklarni w klatkach otaczających rośliny hodowlane.Rośliny należy zabezpieczyć przed mszycami i parasitoidami, stosując gęstą siatkę o oczkach mniejszych niż 1 mm, natomiast górne części klatek powinny być wykonane z materiału przezroczystego, aby umożliwić fotosyntezę. Co dwa tygodnie populację mszyc należy przenieść na świeże rośliny. Wystarczy od 10 do 20 osobników dorosłych, a pozostałe mszyce można zutylizować.Do rejestracji EPG u owadów należy skonstruować specjalistyczną elektrodę z mosiężnych pinów złączy, odcinka drutu miedzianego o długości od jednego do dwóch centymetrów (np. włókien z przewodu elektrycznego) oraz kawałka bardzo cienkiego złotego drutu o długości około 1,5 centymetra. Należy również użyć wodnego kleju srebrowego oraz zwykłej małej lutownicy z topnikiem i cyną w formie rurki. W celu rozpoczęcia prac należy roztopić odrobinę spoiwa lutowniczego na grocie lutownicy.Następnie zanurz łeb mosiężnego gwoździa w kropli topnika do lutowania. Bezzwłocznie dotknij końcem miedzianego drutu końcówki śruby lutowniczej, aby przylutować go do mosiężnego pinu. Teraz dokładnie wstrząśnij lub wymieszaj klej srebrowy na wirówce, aby emulsja nie była osadzona.Otwórz buteleczkę i pod stereomikroskopem zanurz wolny koniec miedzianego drutu w kleju znajdującym się na zakrętce. Połącz złotą siatkę z zakładką o długości co najmniej jednego milimetra i pozostaw srebrny klej do wyschnięcia. Staraj się nie rozmazać kleju na płytce mikroskopowej; po wyschnięciu kleju sprawdź kontakt między srebrnym klejem a złotym drutem w miejscach, gdzie części złączonych drutów nie są sklejone.Nakładaj świeży klej za pomocą małej szpilki lub miedzianego drutu, aż owad będzie odpowiednio przygotowany. Gotową elektrodę można bezpiecznie przechowywać na styropianie. Do unieruchomienia mszycy należy użyć prostego, domowej roboty urządzenia próżniowego.Ssanie jest regulowane za pomocą małego kawałka papieru umieszczonego nad otworem wlotowym. Włącz urządzenie próżniowe i przesuń je na stoliku stereomikroskopu, aby wycentrować końcówkę ssącą. Chwyć mszycę za pomocą małego pędzla akwarelowego rozmiaru dwa lub mniejszego, a następnie umieść mszycę stroną brzuszną w stronę końcówki ssącej, aby zapewnić łatwy dostęp do strony grzbietowej.Za pomocą pędzelka usuń wosk z powierzchni odwłoka, który występuje w dużych ilościach u mszycy kapuścianej. Następnie dokładnie wstrząśnij lub wymieszaj na wirówce srebrny klej i za pomocą cienkiej szpilki entomologicznej nanieś małą kroplę srebrnego kleju na grzbiet mszycy. Pozostaw do wyschnięcia na dwie do trzech minut.Ponownie wstrząśnij fiolką i nanieś kroplę kleju na wierzch pierwszej, wyschniętej kropli. Następnie wprowadź złoty drut przygotowanej elektrody owadziej do drugiej kropli kleju srebrowego. Dopóki klej jest jeszcze mokry, utrzymuj drut w nieruchomej pozycji do czasu jego wyschnięcia.Jeśli klej dostanie się na odnóża lub na dowolną część mszycy, należy powtórzyć procedurę z nowym zwierzęciem. Elektrodę owadzią można wykorzystać ponownie. Po wyschnięciu kleju.Wyłącz ssanie i uwolnij mszycę z urządzenia próżniowego. Owad z podłączonymi elektrodami jest teraz gotowy do rejestracji EPG. Niektóre mszyce można podłączyć do elektrod bez zastosowania fiksacji próżniowej.W tym przypadku należy umieścić mszycę na kawałku chusteczki laboratoryjnej, która jest wystarczająco szorstka, aby owad mógł się jej utrzymać. Podczas nakładania kleju do pierwszej kropli kleju srebrowego można wsunąć złoty drut. Jeśli kropla ta będzie zbyt mała lub wyschnie zbyt szybko, złoty drut nie zostanie prawidłowo przymocowany.W takim przypadku wystarczy nanieść małą kroplę kleju srebrowego na pierwszą kroplę i włożyć złoty drut, a następnie odczekać do wyschnięcia kleju. Następnie, przy pomocy cienkiego pędzla, podnieść mszycę z papieru chłonnego. Mszyce z zamocowanym drutem przechowywać, wbijając mosiężny gwóźdź w styropian do momentu ich wykorzystania.Na początek należy umieścić rośliny doświadczalne w klatce Faradaya na wsporniku nieprzewodzącym, np. na szalce Petriego. Następnie w glebę każdej doniczki należy wbić elektrodę roślinną. Elektroda roślinna nie jest elektrodą uziemiającą, która wymagałaby połączenia z klatką Faradaya.Następnie należy włożyć mosiężny pin elektrody do EPG. Wstępnie dostosuj położenie rośliny i owada, aż do momentu, gdy owad znajdzie się w pożądanym miejscu na roślinie. Używając oprogramowania interfejsu Style plus, które posiada stałą częstotliwość próbkowania 100 hertz, wprowadź nazwę pliku, określ czas rejestracji i wpisz w liniach komentarza tekst określający szczegóły eksperymentu.Następnie rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania, klikając przycisk start w lewym górnym rogu. Rozpocznij eksperyment, opuszczając okablowanego mszyca na roślinę; urządzenie obsługuje do ośmiu kanałów, co oznacza, że jeden zestaw EPG może jednocześnie rejestrować sygnały z ośmiu okablowanych owadów, przy czym może to być jeden owad na roślinę lub więcej mszyc na jednej roślinie. Obwód zostaje zamknięty w momencie, gdy mszyca wprowadza styl letnicy do wnętrza rośliny.Zmienne napięcia sygnału EPG będą wyświetlane na ekranie komputera; należy dostosować napięcie rośliny oraz wzmocnienie w celu uzyskania optymalnego zapisu. W większości przypadków mszyca potrzebuje co najmniej jednej godziny, aby przejść w fazę przepływu. O trwałym żerowaniu w fazie przepływu świadczy występowanie przebiegu fali E dwa przez co najmniej 10 minut.Na tym etapie elektroda jest gotowa do rejestrowania sygnałów elektrycznych z elementu sitowego, co powinno nastąpić dopiero po ustabilizowaniu się sygnału E dwa. Ważne jest podanie jednego lub więcej impulsów kalibracyjnych, które zostaną wykorzystane później do oszacowania wielkości sygnałów elektrycznych. Odcięcie fragmentu liścia nożyczkami konsekwentnie wywołuje dalekosiężny sygnał elektryczny, który jest rejestrowany przez system EPG u mszycy.W bardziej realistycznym eksperymencie jako czynnik powodujący uszkodzenia wykorzystuje się głodną gąsienicę. Uszkodzenia zadane przez gąsienicę konsekwentnie indukują wolne i szybkie sygnały elektryczne, które przemieszczają się do innych liści i mogą zostać zarejestrowane za pomocą elektrod EPG. Szum generowany przez wprowadzenie gąsienicy nie wpłynie na odpowiedź elektrofizjologiczną rośliny, ale może ją zamaskować, dlatego należy zminimalizować ten szum.Badacz powinien być uziemiony, aby sprawdzić, czy żerząca się gąsienica wywołuje sygnały elektryczne w zjadanym liściu. Głodną gąsienicę umieszcza się na liściu, na którym znajduje się również mszyca poddana rejestracji EPG, w sytuacji, gdy dwa różne liście zostały sekwencyjnie odcięte nożyczkami w miejscu złączenia blaszki liściowej. Elektroda EPG umieszczona na żyłce głównej nienaruszonego liścia, sąsiadującego z obydwoma odcinanymi liśćmi, wykryła podobne odpowiedzi elektrofizjologiczne z tego samego elementu sitowego w odpowiedzi na te uszkodzenia.Rejestracje elektrofizjologiczne te składały się z powolnej depolaryzacji oraz szybkiej depolaryzacji nałożonej na tę powolną. W innym eksperymencie wycięto również dwa liście, lecz w tym przypadku jeden był sąsiedni wobec liścia zawierającego elektrodę EPG, podczas gdy drugi nie był sąsiedni wobec liścia z elektrodą EPG. W tej sytuacji pojedynczy element sitowy reagował w odmienny sposób na zranienia.Zranienie liścia niesąsiadującego wykonane w pierwszej kolejności wywołało jedynie powolny sygnał elektryczny, podczas gdy zranienie liścia sąsiadującego wywołało złożony sygnał z komponentami powolnymi i szybkimi. Wyniki te sugerują, że elementy SIV są w stanie wykryć lokalizację uszkodzenia. Tutaj, przy użyciu mszycy podłączonej do systemu EPG, wykonano pomiary wewnątrzkomórkowe z marginalnego elementu sitowego w liściu rośliny arabidopsis. Odcięcie liścia sąsiadującego wywołało sygnał elektryczny, który został przesłany do elementu sitowego, w który wprowadzony był stylet mszycy.W przeciwieństwie do elementów sitowych w żyłach głównych, elementy sitowe w żyłach marginalnych zareagowały na zdalne uszkodzenie jedynie pojedynczą, wolną falą depolaryzacji, która może odpowiadać wolnej fali depolaryzacji w centralnych elementach sitowych. Elektryczny wykres penetracji (EPG) jest metodą, która może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii i fizjologii roślin, takie jak na przykład: jakie kanały leżą u podstaw długodystansowych sygnałów elektrycznych przemieszczających się z liścia do liścia oraz, co najważniejsze, jakie jest znaczenie tych sygnałów w adaptacji roślin do środowiska? Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak przygotować rośliny i owady do badania EPG.Rejestracja połączeń neuronalnych u owadów wydaje się skomplikowana, jednak wykazaliśmy, że jest ona dość prosta, co może zachęcić Państwa do wdrożenia tej metody we własnych badaniach.

a-new-application-electrical-penetration-graph-epg-for-acquiring

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do pozyskiwania i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych floemu

Mikrourządzenie o wysokim potencjale przepustowości jest używane do demonstracji trójwymiarowej (3D) dielektroforezy (DEP) z wykorzystaniem nowych materiałów. Papier z nanopłytek grafenu i taśma dwustronna były na przemian układane w stosy; Wykonano mikrostudnię o średnicy 700 μm w kierunku poprzecznym do warstw. W mikrostudzience wykazano zachowanie DEP kulek polistyrenowych.

Opracowanie urządzenia dielektroforetycznego do elektrod grafenowych 3D

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Artykuł opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia żywotnych wycinków tkanki mózgowo-przysadkowej, przy użyciu teleost fish medaka (Oryzias latipes), a następnie elektrofizjologiczne zapisy komórek przysadki mózgowej przy użyciu techniki patch-clamp z konfiguracją perforowanej łatki.

Zdrowe plastry mózgowo-przysadkowe do badań elektrofizjologicznych komórek przysadki mózgowej u ryb teleost

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Przedstawiono połączone użycie technologii matryc mikroelektrod i stymulacji chemicznej indukowanej 4-aminopirydyną do badania aktywności nocyceptywnej na poziomie sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego.

Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Opisano procedury badania zachowań komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach za pomocą elektropenetracji AC-DC.

Elektropenetrografia AC-DC do badania zachowań sondujących i połykanych komarów Culex tarsalis na ludzkich rękach

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Poznaj nowe zastosowanie techniki EPG do rejestracji sygnałów elektrycznych w elementach sitowych roślin podczas żerowania mszyc. Ta metoda pozwala badać dalekodystansową komunikację elektrofizjologiczną roślin.

Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka (Wideo) | JoVE Journal

Nowe zastosowanie wykresu penetracji elektrycznej (EPG) do akwizycji i pomiaru sygnałów elektrycznych w elementach sitowych łyka

Przeglądaj więcej filmów