Name: Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania rekombinowanych ludzkich przeciwciał IgG z unieśmiertelnionych komórek B. Technika ta umożliwia zachowanie oryginalnego parowania łańcuchów ciężkich i lekkich, co jest kluczowe dla badań nad odpowiedzią immunologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kontrakt badawczy Miguel Servet (ISCIII CD14/00032) do (G.N.-G.). Stypendium Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych "Graduate School of Translational Neuroscience Program" (022005019) do (C.H.).
Granty od Prinses Beatrix Fonds (Projekt WAR08-12) i Association Française contre les Myopathies to (P.M.-M.); a także przez Veni Fellowship Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (916.10.148), stypendium Brain Foundation of the Netherlands (FS2008(1)-28) oraz Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (dla M.L.).
Dziękujemy Jozien Jaspers za pomoc w sortowaniu komórek B za pomocą cytometrii przepływowej.

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
<li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li>
<li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation%3A+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li>
<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszym manuskrypcie szczegółowo przedstawiono wszystkie etapy wytwarzania przeciwciał IgG z ludzkich PBMC. Protokół ten ma pewne zalety w porównaniu z poprzednio opublikowanymi technikami. Jedną z zalet jest to, że wytworzone przeciwciało utrzymuje ciężkie i lekkie łańcuchy odpowiadające oryginalnej parze w klonie limfocytów B. Identyfikacja przeciwciał IgG może być przeprowadzona u każdego rodzaju ludzkiego dawcy i nie ma potrzeby zaostrzenia odpowiedzi immunologicznej z powodu szczepienia5. Zastosowani...

Celem tego artykułu jest szczegółowe opisanie metodologii generowania i charakteryzowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG uzyskanych z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).
Zainteresowanie badaniem ludzkich przeciwciał wzrosło w wielu różnych dziedzinach badań. W szczególności wiele grup badawczych interesuje się patologią wywoływaną przez autoprzeciwciała1-3. Sklonowaliśmy i scharakteryzowaliśmy autoprzeciwciała chorobotwórcze1. Badanie autoprzeciwciał może pomóc w identyfikacji ich celów i opracowaniu strategii terapeutycznych, np. z wykorzystaniem przeciwciał konkurencyjnych4. Co więcej, badanie ludzkich przeciwciał może być również interesujące w innych dziedzinach badań, tj. w celu oceny odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu5, scharakteryzowania profilu przeciwciał osób, które były narażone i stały się odporne na określone patogeny6 lub w celu zbadania, które przeciwciała znajdują się w naturalnym repertuarze7,12.
Kilka technik zostało opracowanych do generowania rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych8-12; większość z nich wykorzystuje wyświetlanie fagów i unieśmiertelnianie komórek B. Wykorzystanie wyświetlania fagów jest szeroko stosowane do odkrywania nowych przeciwciał13. Ma jednak poważną wadę, a mianowicie, że pary łańcuchów ciężkich i lekkich ludzkiej immunoglobuliny ulegają dysocjacji w tym procesie. Produkcja hybrydomy z ludzkimi komórkami B lub transformacja EBV przezwycięża tę wadę.
Używamy zakażenia limfocytów B grasicy EBV w połączeniu ze stymulacją poliklonalnych komórek B za pomocą receptora Toll-like 9 (TLR-9)6,12.
W tym artykule szczegółowo opisujemy technologię, której używamy do rozwoju ludzkich przeciwciał IgG, z pełnym przeglądem wszystkich etapów od izolacji PBMC do wytworzenia przeciwciał in vitro. Protokół ten może być stosowany do analizy dowolnego rodzaju profilu IgG u ludzi. W naszym laboratorium limfocyty B wytwarzające przeciwciała IgG zostały pomyślnie oddzielone od reszty PBMC po sortowaniu. Pięćdziesiąt posortowanych limfocytów B8 można następnie posiać na płytkach wielodołkowych i unieśmiertelnić przez aktywację EBV i TLR-9 w celu klonalnej ekspansji pojedynczych komórek B. Jako komórki żywicielskie wykorzystano fibroblasty z ludzkiej embrionalnej tkanki płucnej, linii komórkowej wi38, która ułatwia wizualizację unieśmiertelnionych limfocytów B. Z tych limfocytów B sekwencje ciężkich i lekkich łańcuchów immunoglobuliny można uzyskać metodą PCR, a geny przeciwciał sklonować w wektorach ekspresyjnych immunoglobuliny G i wytworzyć in vitro. Za pomocą tej techniki można badać pojedyncze przeciwciała z dokładnie taką samą sekwencją przeciwciał, jaka znajduje się u dawcy.

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>roztwór zawierający polisarozę i ditrizoan sodu</td></tr><tr><td>Sorter komórek FACSAria II&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Płytki mikrodołkowe z dnem w kształcie litery U&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 średni&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>30% v/v Supernatant linii komórkowej B95-8 zawierający EBV&nbsp; &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3,4 x 108 kopii/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Ogniwa Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina-2</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>10799068001</tr><tr><td>Płytki ELISA</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment kozy anty-ludzki IgG, Fc&gamma; Fragment specyficzny (niesprzężony)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% beztłuszczowe mleko w proszku (Blotting Grade Blocker)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>IgG Człowiek&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>LUDZKA IgG oczyszczona immunoglobulina, 5,6 mg / ml</td></tr><tr><td>Kozia F(ab)2 antyludzka IgG Fc&gamma; (sprzężone z peroksydazą (PO))</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik ELISA (Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw-ludzka IgM, przeciw-ludzka IgM, Fc5&mikro sprzężona peroksydazą; &nbsp; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III System bezpośredniej syntezy cDNA komórek&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw systemu odwrotnej transkrypcji&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana polimeraza DNA Taq</td><td>Startery TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>(2 &mu; l)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta Agaroza&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp</td><td>drabinka Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Ilość Jeden 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td>Zestaw do oczyszczania <td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zestaw do sekwencjonowania</td> cyklu <td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>0,1 ml płytka reakcyjna (MicroAMP Optical 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Analizator genetyczny ABI300&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; kompetentne komórki (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 pz)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 pz)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 pz)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 pz)&nbsp;</td><td>Pożywka SOC Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka agarowa na bazie LB uzupełniona o Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)</td><td>Płynne</td> podłoże na bazie <td>Invivogen fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) uzupełnione Zeocyną (Fast-Media Zeo TB)</td><td>Zestaw Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep kit&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (spektrofotometr ND1000)</td><td>Pożywka</td> agarowa na bazie Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>LB uzupełniona blastycydyną (Fast-Media Blast Agar)</td>Płynne podłoże na bazie <td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) uzupełnione blastycydyną (Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20,000 U/ml, w 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10,000 U/ml, w 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA drabinka New</td><td>England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0,1-10,0 kb, 1,000 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10 000 U/ml, w 10x buforze CutSmart&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10 000 U/ml, w 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5 000 U/ml, w 10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Termoczuła fosfataza alkaliczna</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&mikro; l, w 10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha; kompetentne komórki&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz Anti-Human IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych igg z unieśmiertelnionych sortowanych komórek b

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Znalezienie nowych metod generowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych to aktywna dziedzina badań, która jest ważna zarówno dla nauk podstawowych, jak i stosowanych, w tym dla rozwoju immunoterapeutyków. Jednak techniki identyfikacji i wytwarzania takich przeciwciał są zwykle żmudne, a czasami para łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciał ulega dysocjacji. Tutaj opisujemy stosunkowo prosty, nieskomplikowany protokół wytwarzania ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu unieśmiertelnienia wirusem Epsteina-Barr (EBV) i aktywacji receptora Toll-podobnego 9. Przy odpowiednim barwieniu limfocyty B wytwarzające przeciwciała mogą być izolowane w celu późniejszego unieśmiertelnienia i ekspansji klonalnej. Transkrypty przeciwciał wytwarzane przez unieśmiertelnione klony komórek B mogą być amplifikowane metodą PCR, sekwencjonowane jako odpowiadające im pary łańcuchów ciężkich i lekkich i klonowane do wektorów ekspresyjnych immunoglobulin. Przeciwciała uzyskane za pomocą tej techniki mogą być potężnymi narzędziami do badania odpowiednich ludzkich odpowiedzi immunologicznych, w tym autoimmunizacji, i stworzyć podstawę dla nowych terapii.

Bramkowanie sortowania po barwieniu komórek pozytywnych dla CD22 i IgG przedstawiono na Rysunku 1. Na tym obrazie wybrano obszar komórek podwójnie pozytywnych – limfocytów B produkujących przeciwciała IgG – aby posortować wszystkie te komórki do oddzielnej probówki. W analizie około 1% całkowitej liczby PBMC odpowiada tej populacji podwójnie pozytywnej. Liczba uzyskanych posortowanych komórek będzie zależeć od liczby komórek uzyskanych w sekcji 1.
Różne wyniki po 5 tygodniach ...

Synteza ludzkich przeciwciał monoklonalnych jest pierwszym krokiem w badaniach mających na celu rozwikłanie patofizjologicznych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem autoprzeciwciał. Opracowaliśmy protokół wytwarzania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) z komórek B posortowanych krwią, w tym izolację komórek B, klonowanie przeciwciał i syntezę in vitro.

Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest klonowanie i ekspresja przeciwciał produkowanych przez limfocyty B. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację limfocytów B z odpowiedniej tkanki źródłowej, takiej jak krew lub grasica. Drugim krokiem jest przeprowadzenie sortowania FACS i wyselekcjonowanie populacji limfocytów B wykazujących pozytywny wynik w kierunku produkcji IgG.Następnie komórki są unieśmiertelniane poprzez infekcję wirusem Epstein-Barr wraz z aktywacją receptora toll-like 9 za pomocą C-P-G-O-D-N 2006 i utrzymywane w hodowli. Końcowe etapy polegają na izolacji RNA z klonów, które w teście ELISA wykazano jako dodatnie pod kątem produkcji IgG, oraz na generowaniu cDNA z lekkich i ciężkich łańcuchów IgG. Ostatecznie sekwencje IgG mogą zostać sklonowane w ssaczych wektorach ekspresyjnych w celu uzyskania wysokich ilości monoklonalnego ludzkiego IgG.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak technologia phage display, jest fakt, że oryginalne parowanie ciężkich i lekkich łańcuchów IgG nie zostaje utracone. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie autoimmunologii, takie jak wykrywanie i charakterystyka funkcjonalna patogennych autoprzeciwciał. Należy pamiętać, że praca z materiałem pochodzącym od pacjentów oraz wirusem EBV może wiązać się z ryzykiem.Wirus EB jest patogenem ludzkim, dlatego podczas wykonywania tych czynności należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie procedur BSL-2 oraz noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej. Przed barwieniem PBMC należy wysiać je do kolby o pojemności 25 cm² z 6 mL kompletnego medium RPMI 1640 i pozostawić do regeneracji przez noc. Po zablokowaniu i przemyciu komórek, należy zebrać PBMC do probówki z 0,5 mL medium i odwirować. Następnie komórki należy resuspender w buforze do znakowania i policzyć.Następnie przygotuj dwie probówki do FACS zawierające po 5 milionów komórek w 200 µL buforu. Do probówek dodaj 10 µL przeciwciał anty-CD22 P-E-R-C-P lub 40 µL przeciwciał anty-IgG PE i inkubuj przez 30 minut w lodzie i w ciemności, a następnie przemyj, przefiltruj i posortuj komórki. Celem jest policzenie komórek podwójnie dodatnich.Rozpocznij od rozcieńczenia posortowanych P BMCs do stężenia jednej komórki na mikrolitr w pożywce RPMI 1640, kompletnej z dodatkiem C PG 2006 i EBV. Następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza nanieś 110 µL rozcieńczenia komórek z EBV i CPG 2006 do dwóch dołków płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym, w których wcześniej wysiano napromieniowane komórki WI 38. Zoptymalizowana liczba 50 komórek na dołek zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania przeciwciała monoklonalnego.Zalecamy jednak potwierdzenie tego wyniku za pomocą PCR. Po tygodniu inkubacji należy sprawdzić pod mikroskopem, czy nastąpił wzrost komórek B. Po dwóch tygodniach należy wymienić pożywkę, powoli odsyłając 90 µL medium z każdej studni i przenosząc je na nową płytkę.Następnie należy przeprowadzić test produkcji IgG metodą ELISA. Do każdej studzienki dodać 100 µL świeżej pożywki z suplementami, zawierającej IL-2. Należy kontynuować monitorowanie wzrostu klonów w trzecim i czwartym tygodniu hodowli.Powtarzaj wymianę pożywki w każdym tygodniu. Metody ekspansji klonalnej opisano w protokole tekstowym. Sprawdź produkcję IgG w nadsączach pozyskanych z wymian pożywki, wykorzystując test immunoenzymatyczny (ELISA).Najpierw należy przygotować płytki ELISA, do każdego dołka dozując 50 µL przeciwciał kozich przeciwko ludzkiemu fragmentowi Fc, rozcieńczonych w buforze kodującym w stosunku 1:200. Po inkubacji i przemyciu płytki należy zablokować dołki, dodając 100 µL buforu blokującego na dołek, a następnie ponownie inkubować płytkę. Po zakończeniu inkubacji blokującej należy usunąć ciecz z płytki, odwracając ją nad ręcznikiem papierowym.Po przygotowaniu płytki rozcieńczyć nadsączkami czterokrotnie w pożywce RPMI. Następnie, w celu przygotowania kontroli standardowych, wykonać rozcieńczenia szeregowe roztworu ludzkiego IgG w RPMI w zakresie od 1000 nanogramów na mililitr do 15,6 nanogramów na mililitr.Należy również uwzględnić próbę ślepą. Do każdego dołka nanieś 50 µL supernatantu lub standardu i inkubuj płytkę ELISA przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w ten sam sposób; można przygotować dodatkowe płytki ELISA w celu analizy dalszych rozcieńczeń supernatantów, aby przetestować powinowactwo przeciwciał. Po inkubacji wypłucz płytkę.Następnie do każdej studni nanieś 50 µL buforu inkubacyjnego z peroksydazą sprzężoną z fab 2. Po kolejnej godzinie inkubacji i ponownym przemyciu, dodaj do każdej studni 100 µL roztworu substratu z TMB. Następnie inkubuj płytkę do 10 minut, aż pojawi się i ustabilizuje niebieskie zabarwienie.Następnie należy zatrzymać reakcję i zmierzyć absorbancję. Nadnadczniki klonów, w których zmierzona absorbancja przekracza wartość tła o trzy odchylenia standardowe, uznaje się za pozytywne.W przypadku ludzkich przeciwciał IgG specyficzność antygenową można wykryć za pomocą dalszych testów. Aby rozpocząć, należy postępować zgodnie z protokołem tekstowym w celu syntezy kopii DNA z pozytywnych klonów. Następnie należy przeprowadzić reakcje PCR dla ciężkiego łańcucha IgG oraz łańcuchów kappa i lambda.W wynikach należy zidentyfikować ciężki łańcuch w zakresie od 400 do 550 par zasad oraz lekki łańcuch w zakresie od 300 do 400 par zasad. Jeśli nie są one obecne, należy wykorzystać jeden mikrolitr produktów jako matrycę do kolejnej reakcji PCR.Nowe produkty powinny mieścić się w odpowiednim zakresie. Następnie należy przystąpić do klonowania najlepszych produktów. W pierwszej kolejności należy je zsekwencjonować. Ich elektroferogramy powinny być czyste i odpowiadać pojedynczej sekwencji immunoglobuliny.Postępując zgodnie z protokołem tekstowym, należy sklonować oczyszczony produkt PCR do mikrogama plazmidowego DNA. Należy pamiętać o przeprowadzeniu ligacji przez noc w temperaturze 16 °C.Używając T4 DNA Ligazy, przygotuj komórki HX w uzupełnionym DMEM i hoduj je do 75% konfluencji w kolbach hodowlanych o powierzchni 75 cm². Dla każdej transfekcji ciężkiego i lekkiego łańcucha przygotuj mieszaninę zawierającą 1,75 ml DMEM bez surowicy, 4,5 µg wektora ciężkiego łańcucha, 3 µg wektora lekkiego łańcucha oraz 50 µl roztworu polietylenu. Delikatnie dodaj tę mieszaninę do płytki z komórkami HX i wymieszaj roztwór poprzez delikatne kołysanie płytki.Inkubować płytkę przez noc, a następnie rozpocząć codzienne pobieranie pożywki hodowlanej, zastępując ją pożywką bezzserową. Pożywka zawiera przeciwciała i może być pobierana codziennie przez cztery dni po barwieniu, a CD 22 i IgG dodatnie p BMCs zostały wyselekcjonowane metodą FACS.Obszar komórek podwójnie dodatnich, czyli limfocytów B produkujących przeciwciała IgG, został zebrany osobno w celu ekspansji. Około 1% pbmc należało do tej populacji podwójnie dodatniej. Po pięciu tygodniach stymulacji EBV i CPG 2006 wyizolowano klony unieśmiertelnione.Komórki karmidła WI 30 mają bardziej wydłużony kształt fibroblastyczny, natomiast klony limfocytów B występują jako bardzo małe, okrągłe komórki rosnące w skupiskach w środku okrągłodennej płytki wielodołkowej. Nadpłyn z rosnących klonów przebadano za pomocą testu ELISA w kierunku IgG. Za klon pozytywny uznawano taki, którego wartośćELI była o trzy odchylenia standardowe wyższa od wartości tła.Przynajmniej trzy nadsączone z pozytywnego klonu dały wynik dodatni w teście ELISA. Przeciwciała z pozytywnego klonu zostały zsekwencjonowane; po sklonowaniu ciężkiego łańcucha immunoglobulin oraz lekkiego łańcucha lambda możliwe było scharakteryzowanie regionów zmiennych i stałych obu łańcuchów. Zastosowano następującą procedurę.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wykorzystanie przeciwciał i genów, różnorodność genetyczna itp., można zastosować inne metody, np. sekwencjonowanie. Po swoim opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie autoimmunologii do eksploracji przyczyn chorób, patologii oraz odpowiednich strategii terapeutycznych dla schorzeń autoimmunologicznych, takich jak miastenia gravis. Znaczenie tej techniki rozciąga się na diagnostykę i terapię chorób takich jak miastenia gravis, ponieważ odkrycie przeciwciał patogennych może prowadzić do opracowania nowych metod leczenia, np. przeciwciał konkurencyjnych, pozbawionych aktywności zapalnej.

generation-recombinant-human-igg-monoclonal-antibodies-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Ten film demonstruje metodę generowania przeciwciał z komórek ssaków poprzez wprowadzenie wektorów plazmidowych z ciężkimi i lekkimi genami łańcuchowymi. Wektory te oddziałują z polietyleneniną i wnikają do komórek, tworząc polipleksy; Później są one przekształcane w pojedyncze białka i składane w kompletne przeciwciała, które są wydzielane do podłoża zewnątrzkomórkowego.

Wytwarzanie rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych z kultur komórkowych ssaków

Film demonstruje technikę generowania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu. Eukariotyczne wektory ekspresyjne kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciał, sklonowane z izolowanych komórek B specyficznych dla antygenu, wprowadza się do komórek ssaków za pomocą polipleksów. Po wejściu do komórek wektory te ulegają translacji, a powstałe peptydy o ciężkich i lekkich łańcuchach łączą się w przeciwciała, które są następnie wydzielane przez komórki.

Technika wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Opisano wydajny system analizy struktury i funkcji genu w kulturze ex vivo limfocytów B śledziony. Metoda ta wykorzystuje produkcję rekombinowanych retrowirusów w wolnej od komórek pomocniczych (helper-free), ekotropowej linii komórkowej pakującej. Osiągnięto stabilną, dziedziczną ekspresję badanego genu w pierwotnych limfocytach, co prowadzi do generowania przeciwciał powierzchniowych na komórkach B przechodzących rekombinację zmiany klasy.

Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B

Do badania patogenezy Hc wykorzystano myszy C57BL/6, które stanowią najlepszy model. Badamy potencjalne korzyści z odporności humoralnej przeciwko temu grzybowi i wytworzyliśmy kilka przeciwciał monoklonalnych (mAbs) [przeciwko histonie H2B oraz białku szoku termicznego 60kDa], których skuteczność ochronną przetestowano po podaniu domięśniowym.

Pasywna administracja przeciwciał monoklonalnych przeciwko H. capsulatum oraz innym patogenom grzybiczym

Poznaj metodę wytwarzania rekombinowanych ludzkich przeciwciał IgG z unieśmiertelnionych komórek B. Technika ta umożliwia zachowanie oryginalnego parowania łańcuchów ciężkich i lekkich, co jest kluczowe dla badań nad odpowiedzią immunologiczną.

Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

Przeglądaj więcej filmów