Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

Ogólnym celem niniejszej procedury jest klonowanie i ekspresja przeciwciał produkowanych przez limfocyty B. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację limfocytów B z odpowiedniej tkanki źródłowej, takiej jak krew lub grasica. Drugim krokiem jest przeprowadzenie sortowania FACS i wyselekcjonowanie populacji limfocytów B wykazujących pozytywny wynik w kierunku produkcji IgG.

Następnie komórki są unieśmiertelniane poprzez infekcję wirusem Epstein-Barr wraz z aktywacją receptora toll-like 9 za pomocą C-P-G-O-D-N 2006 i utrzymywane w hodowli. Końcowe etapy polegają na izolacji RNA z klonów, które w teście ELISA wykazano jako dodatnie pod kątem produkcji IgG, oraz na generowaniu cDNA z lekkich i ciężkich łańcuchów IgG. Ostatecznie sekwencje IgG mogą zostać sklonowane w ssaczych wektorach ekspresyjnych w celu uzyskania wysokich ilości monoklonalnego ludzkiego IgG.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak technologia phage display, jest fakt, że oryginalne parowanie ciężkich i lekkich łańcuchów IgG nie zostaje utracone. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie autoimmunologii, takie jak wykrywanie i charakterystyka funkcjonalna patogennych autoprzeciwciał. Należy pamiętać, że praca z materiałem pochodzącym od pacjentów oraz wirusem EBV może wiązać się z ryzykiem.

Wirus EB jest patogenem ludzkim, dlatego podczas wykonywania tych czynności należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie procedur BSL-2 oraz noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej. Przed barwieniem PBMC należy wysiać je do kolby o pojemności 25 cm² z 6 mL kompletnego medium RPMI 1640 i pozostawić do regeneracji przez noc. Po zablokowaniu i przemyciu komórek, należy zebrać PBMC do probówki z 0,5 mL medium i odwirować. Następnie komórki należy resuspender w buforze do znakowania i policzyć.

Następnie przygotuj dwie probówki do FACS zawierające po 5 milionów komórek w 200 µL buforu. Do probówek dodaj 10 µL przeciwciał anty-CD22 P-E-R-C-P lub 40 µL przeciwciał anty-IgG PE i inkubuj przez 30 minut w lodzie i w ciemności, a następnie przemyj, przefiltruj i posortuj komórki. Celem jest policzenie komórek podwójnie dodatnich.

Rozpocznij od rozcieńczenia posortowanych P BMCs do stężenia jednej komórki na mikrolitr w pożywce RPMI 1640, kompletnej z dodatkiem C PG 2006 i EBV. Następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza nanieś 110 µL rozcieńczenia komórek z EBV i CPG 2006 do dwóch dołków płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym, w których wcześniej wysiano napromieniowane komórki WI 38. Zoptymalizowana liczba 50 komórek na dołek zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania przeciwciała monoklonalnego.

Zalecamy jednak potwierdzenie tego wyniku za pomocą PCR. Po tygodniu inkubacji należy sprawdzić pod mikroskopem, czy nastąpił wzrost komórek B. Po dwóch tygodniach należy wymienić pożywkę, powoli odsyłając 90 µL medium z każdej studni i przenosząc je na nową płytkę.

Następnie należy przeprowadzić test produkcji IgG metodą ELISA. Do każdej studzienki dodać 100 µL świeżej pożywki z suplementami, zawierającej IL-2. Należy kontynuować monitorowanie wzrostu klonów w trzecim i czwartym tygodniu hodowli.

Powtarzaj wymianę pożywki w każdym tygodniu. Metody ekspansji klonalnej opisano w protokole tekstowym. Sprawdź produkcję IgG w nadsączach pozyskanych z wymian pożywki, wykorzystując test immunoenzymatyczny (ELISA).

Najpierw należy przygotować płytki ELISA, do każdego dołka dozując 50 µL przeciwciał kozich przeciwko ludzkiemu fragmentowi Fc, rozcieńczonych w buforze kodującym w stosunku 1:200. Po inkubacji i przemyciu płytki należy zablokować dołki, dodając 100 µL buforu blokującego na dołek, a następnie ponownie inkubować płytkę. Po zakończeniu inkubacji blokującej należy usunąć ciecz z płytki, odwracając ją nad ręcznikiem papierowym.

Po przygotowaniu płytki rozcieńczyć nadsączkami czterokrotnie w pożywce RPMI. Następnie, w celu przygotowania kontroli standardowych, wykonać rozcieńczenia szeregowe roztworu ludzkiego IgG w RPMI w zakresie od 1000 nanogramów na mililitr do 15,6 nanogramów na mililitr.

Należy również uwzględnić próbę ślepą. Do każdego dołka nanieś 50 µL supernatantu lub standardu i inkubuj płytkę ELISA przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w ten sam sposób; można przygotować dodatkowe płytki ELISA w celu analizy dalszych rozcieńczeń supernatantów, aby przetestować powinowactwo przeciwciał. Po inkubacji wypłucz płytkę.

Następnie do każdej studni nanieś 50 µL buforu inkubacyjnego z peroksydazą sprzężoną z fab 2. Po kolejnej godzinie inkubacji i ponownym przemyciu, dodaj do każdej studni 100 µL roztworu substratu z TMB. Następnie inkubuj płytkę do 10 minut, aż pojawi się i ustabilizuje niebieskie zabarwienie.

Następnie należy zatrzymać reakcję i zmierzyć absorbancję. Nadnadczniki klonów, w których zmierzona absorbancja przekracza wartość tła o trzy odchylenia standardowe, uznaje się za pozytywne.

W przypadku ludzkich przeciwciał IgG specyficzność antygenową można wykryć za pomocą dalszych testów. Aby rozpocząć, należy postępować zgodnie z protokołem tekstowym w celu syntezy kopii DNA z pozytywnych klonów. Następnie należy przeprowadzić reakcje PCR dla ciężkiego łańcucha IgG oraz łańcuchów kappa i lambda.

W wynikach należy zidentyfikować ciężki łańcuch w zakresie od 400 do 550 par zasad oraz lekki łańcuch w zakresie od 300 do 400 par zasad. Jeśli nie są one obecne, należy wykorzystać jeden mikrolitr produktów jako matrycę do kolejnej reakcji PCR.

Nowe produkty powinny mieścić się w odpowiednim zakresie. Następnie należy przystąpić do klonowania najlepszych produktów. W pierwszej kolejności należy je zsekwencjonować. Ich elektroferogramy powinny być czyste i odpowiadać pojedynczej sekwencji immunoglobuliny.

Postępując zgodnie z protokołem tekstowym, należy sklonować oczyszczony produkt PCR do mikrogama plazmidowego DNA. Należy pamiętać o przeprowadzeniu ligacji przez noc w temperaturze 16 °C.

Używając T4 DNA Ligazy, przygotuj komórki HX w uzupełnionym DMEM i hoduj je do 75% konfluencji w kolbach hodowlanych o powierzchni 75 cm². Dla każdej transfekcji ciężkiego i lekkiego łańcucha przygotuj mieszaninę zawierającą 1,75 ml DMEM bez surowicy, 4,5 µg wektora ciężkiego łańcucha, 3 µg wektora lekkiego łańcucha oraz 50 µl roztworu polietylenu. Delikatnie dodaj tę mieszaninę do płytki z komórkami HX i wymieszaj roztwór poprzez delikatne kołysanie płytki.

Inkubować płytkę przez noc, a następnie rozpocząć codzienne pobieranie pożywki hodowlanej, zastępując ją pożywką bezzserową. Pożywka zawiera przeciwciała i może być pobierana codziennie przez cztery dni po barwieniu, a CD 22 i IgG dodatnie p BMCs zostały wyselekcjonowane metodą FACS.

Obszar komórek podwójnie dodatnich, czyli limfocytów B produkujących przeciwciała IgG, został zebrany osobno w celu ekspansji. Około 1% pbmc należało do tej populacji podwójnie dodatniej. Po pięciu tygodniach stymulacji EBV i CPG 2006 wyizolowano klony unieśmiertelnione.

Komórki karmidła WI 30 mają bardziej wydłużony kształt fibroblastyczny, natomiast klony limfocytów B występują jako bardzo małe, okrągłe komórki rosnące w skupiskach w środku okrągłodennej płytki wielodołkowej. Nadpłyn z rosnących klonów przebadano za pomocą testu ELISA w kierunku IgG. Za klon pozytywny uznawano taki, którego wartośćELI była o trzy odchylenia standardowe wyższa od wartości tła.

Przynajmniej trzy nadsączone z pozytywnego klonu dały wynik dodatni w teście ELISA. Przeciwciała z pozytywnego klonu zostały zsekwencjonowane; po sklonowaniu ciężkiego łańcucha immunoglobulin oraz lekkiego łańcucha lambda możliwe było scharakteryzowanie regionów zmiennych i stałych obu łańcuchów. Zastosowano następującą procedurę.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wykorzystanie przeciwciał i genów, różnorodność genetyczna itp., można zastosować inne metody, np. sekwencjonowanie. Po swoim opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie autoimmunologii do eksploracji przyczyn chorób, patologii oraz odpowiednich strategii terapeutycznych dla schorzeń autoimmunologicznych, takich jak miastenia gravis. Znaczenie tej techniki rozciąga się na diagnostykę i terapię chorób takich jak miastenia gravis, ponieważ odkrycie przeciwciał patogennych może prowadzić do opracowania nowych metod leczenia, np. przeciwciał konkurencyjnych, pozbawionych aktywności zapalnej.