Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Ogólnym celem tej procedury jest bezpieczne i skuteczne osadzenie komórek macierzystych w alginianowych, hydrożelowych kapsułkach oraz hodowla ich w kapsułkach w celu kontroli agregacji i mikrośrodowiska odbywa się to poprzez zmieszanie przefiltrowanej zawiesiny komórek macierzystych i roztworu alginianu sodu. Mieszanina jest następnie przenoszona do strzykawki, a dysza współosiowa jest instalowana na strzykawce przed umieszczeniem ich na pompie strzykawkowej. Następnie kropelki są przygotowywane przez wydalenie zawiesiny komórek z co płynącym azotem gazowym, a następnie zbieranie i sporządzanie roztworu chlorku wapnia.

Kapsułki są następnie traktowane poli-L-lizyną, aby zapobiec wyciekom komórkowym, i EDTA w celu upłynnienia wewnętrznych kapsułek przed hodowlą zamkniętych komórek w stanie obrotowego wstrząsania. Na koniec komórki są zbierane z kapsułek przez EDTA i fizyczne zniszczenie błony. Ostatecznie, enkapsulacja alginianów pluripotencjalnych komórek macierzystych zapobiega nadmiernej agregacji komórek i ogranicza czysty stres doświadczany przez komórki w hodowli zawiesinowej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii i biomedycyny, takie jak duża ekspansja transplantacji komórek i badania nad niszą komórek macierzystych. Enkapsulację komórek należy rozpocząć od zebrania komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym po odwirowaniu w temperaturze 160 razy G przez trzy minuty. Przemyć indukowaną pluripotencjalną osadę macierzystą lub osad komórek IPS za pomocą Resus, zawieszając w stosach buforowaną sól fizjologiczną i trzykrotnie odwirowując po resus, zawieszając komórki i nasypując zbuforowaną sól fizjologiczną.

Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 mikronów, aby usunąć duże agregaty, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać dyszę. Następnie wymieszaj dwa mililitry przefiltrowanej zawiesiny komórkowej i trzy mililitry 5% roztworu alginianu sodu. Aby uzyskać pięciomililitrową zawiesinę komórek w 3% gęstości komórek alginianu sodu wynosi DIR: ponad 1 milion komórek na mililitr.

Po zebraniu zawiesiny komórek do pięciomililitrowej strzykawki, zainstaluj dyszę współosiową na strzykawce i ustaw je na pompie strzykawkowej, emituj przepływ azotu przez zewnętrzną igłę dyszy koncentrycznej i wyrzuć zawiesinę komórek przez dyszę wewnętrzną. Zbierz kropelki do 250 mililitrów 0,5% roztworu chlorku wapnia i odczekaj 10 do 20 minut na datowanie, mieszając przy 60 do 90 obr./min. Po umyciu zbuforowaną solą fizjologiczną, zebrane kapsułki są wykorzystywane jako nagie kapsułki do traktowania kapsułek inkubujących kapsułki z alginianu wapnia w 0,05% wagowo na objętość.

Roztwór poli-lizyny przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z wstrząsaniem. Po zebraniu kapsułek do probówki i przemyciu stertami buforowanej soli fizjologicznej, należy je inkubować w DMEM zawierającym 10% FBS. Aby zneutralizować ładunek elektryczny na ich powierzchni, wykorzystaj powstałe kapsułki jako kapsułki powlekane do wytworzenia pustych kapsułek.

Inkubować kapsułki w stosach buforowanego roztworu soli fizjologicznej zawierającego 10 milimolowy EDTA przez pięć minut. Kapsułki poddane działaniu EDTA są wykorzystywane jako puste kapsułki. Inkubować kapsułkowane komórki z prędkością 75 obr./min z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 10 dni po inkubacji, zebrać i inkubować kapsułki w 10 milimolowym EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 10 minut.

Zebrać komórki z kapsułek alginianowych bez traktowania poli licyną przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Jeśli kapsułki alginianowe są traktowane poli-lizyną, należy przełamać membranę poli-lizynową alginianu, pipetując w górę i w dół około 10 razy za pomocą igły dołączonej do strzykawki. Średnica igły powinna być mniejsza niż rozmiar kapsułki, a w tym eksperymencie używa się igieł o rozmiarze 25.

Po odwirowaniu w temperaturze od 1000 do 5 000 razy G przez pięć minut, należy zebrać osad komórkowy ściśle z uszkodzonych błon poli licyny alginianowej Jeśli próbki mRNA są pobierane z komórek, należy pamiętać, że pozostałe błony poli lityny alginianowej mogą uniemożliwić oczyszczanie mRNA, jak widać za pomocą szybkiej kamery. Wydalony roztwór alginianu natychmiast po wydaleniu tworzy kulisty kształt. Jeśli zawiesina jest wydalana z natężeniem przepływu azotu mniejszym niż jeden litr na minutę, wielkość kropel jest jednolita.

Jeśli jednak przepływ azotu jest większy niż jeden litr na minutę, kropla rozpada się, a wielkość kropelek staje się niejednorodna. Biorąc to pod uwagę, trudno jest przygotować kropelki mniejsze niż 500 mikronów tą metodą. W procesie żelowania kropelki alginianu sodu tworzą kuliste kapsułki z alginianu wapnia w roztworze chlorku wapnia.

Jeśli jednak stężenie alginianu sodu jest wystarczająco wysokie, niskie stężenie alginianu sodu powoduje niekulisty i niekulisty kształt kapsułek, które mają problem w procesie kodowania. Nawet jeśli stężenie alginianu sodu nie jest wystarczające, poprzez zwiększenie stężenia wapnia można utworzyć kuliste kapsułki. Jednak około 50 milimoli chlorku wapnia jest odpowiednie do kapsułkowania, ponieważ zbyt wysokie stężenie chlorku wapnia zmniejsza wzrost i żywotność komórek.

Zamknięte komórki mogą rosnąć w kapsułkach, ale wyciek komórkowy może wystąpić w kapsułkach bez powłoki z poli lizyny alginianowej. W przypadku mysich komórek IPS komórki tworzą agregaty w kształcie dysku w każdej kapsułce z alginianu wapnia, podczas gdy komórki zlepiają się ze sobą i tworzą pojedyncze kuliste agregaty w każdej pustej kapsułce. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hermetyzować i hodować komórki w celu kontroli rozmiaru.

Wodór wychwytuje się bez specjalnego sprzętu, bez absorbentu organicznego.