Name: Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę enkapsulacji pluripotencjalnych komórek macierzystych w kapsułki alginianowe przy użyciu dyszy współosiowej. Technika ta minimalizuje agregację komórek i naprężenia ścinające podczas hodowli zawiesinowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez projekt S-Innovation Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST), Graduate Program for Leaders in Life Innovation (GPLLI) Uniwersytetu Tokijskiego oraz Research Fellowship for Young Scientists of Japan Society for the Promotion of Science. Dziękujemy firmie nac Image Technology Inc. za robienie filmów za pomocą kamery o dużej szybkości.

1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotuj 10 mM bufor HEPES. Dostosuj pH do 7,0 przy RT i dodaj NaCl do 0,9%.</li>
	<li>Przygotować 5% roztwór alginianu i 10 mM roztwór EDTA, mieszając sól fizjologiczną buforowaną przez HEPS przygotowaną w 1.1. Dostosuj pH do 7,0 przy RT.</li>
	<li>Odczynniki (1.1, 1.2) należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Przygotować żelatynowe szalki o średnicy 60 mm wyłożone 1,2 − 2,0 × 106 mysich komórek fibroblastów zarodkowych (MEF), które traktuje się jako komórki żywicielskie przez inkubację w DMEM zawierającym 10% FBS kwalifikowanego przez ES i 10 μg/ml mitomycyny C przez 90 - 120 min.</li>
	<li>Utrzymuj indukowane przez myszy pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) na naczyniu z komórkami zasilającymi w obecności 5 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 20% FBS kwalifikowanego przez ES, 50 μM 2-merkaptoetanolu, aminokwasów endogennych i antybiotyków (100 jednostek/ml sodu penicyliny G, 100 μg/ml siarczanu streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B).</li>
	<li>Wysiewać 4 × 105 komórek iPS na pokrytej żelatyną szalce o średnicy 60 mm i inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę hodowlaną codziennie podczas inkubacji. Po 3 – 4 dniach hodowli trypsynizować komórki przez 1 minutę za pomocą 500 μl 0,05% trypsyny zawierającej 0,02% EDTA w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnie odłącz komórki, stukając dziesięć razy w naczynie hodowlane.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml DMEM z 10% FBS kwalifikowanym przez ES i antybiotykami (po dysocjacji mysich komórek iPS na pojedyncze komórki przez trzykrotne pipetowanie mikropipetą 1 000 μl), odwirować zawiesinę komórek przy 160 × g przez 3 minuty, usunąć supernatant i policzyć komórki. Po zliczeniu komórek ponownie wysiewaj zebrane komórki na naczyniu pokrytym żelatyną i inkubuj przez 30 minut, aby wyizolować komórki iPS od komórek MEF. Po zliczeniu komórek (zwykle można zebrać 1 – 3 × 106 komórek/szalkę), ponownie zasiej 4 × 105 komórek iPS na szalce.</li>
</ol>
2. Enkapsulacja komórek w kapsułkach hydrożelowych alginianowych
<ol>
	<li>Zebrać komórki zgodnie z tą samą procedurą, opisaną w ppkt 1.5 i 1.6. Po odwirowaniu w stężeniu 160 × g przez 3 minuty, trzykrotnie przepłukać osad komórek iPS roztworem soli fizjologicznej buforowanym przez HEPES. Po ponownym zawieszeniu komórek w soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES, przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe o średnicy 40 μm w celu usunięcia dużych agregatów, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać dyszę.</li>
	<li>Wymieszać 2 ml zawiesiny komórkowej z solą fizjologiczną buforowaną przez HEPES i 3 ml 5% roztworu Alg-Na. Na koniec otrzymuje się 5 ml zawiesiny komórkowej w 3% roztworze Alg-Na. Gęstość komórek jest pożądana powyżej 106 komórek/ml.</li>
	<li>Po zebraniu zawiesiny komórek do strzykawki o pojemności 5 ml zainstalować współosiową dyszę (Rysunek 1A, B) na strzykawce i ustawić je na pompie strzykawkowej. Emitować przepływ gazu N2 (mniejszy niż 1 l/min) przez zewnętrzną igłę dyszy współosiowej i wyrzucić zawiesinę komórek przez dyszę wewnętrzną.</li>
	<li>Zebrać kropelki do 250 ml 0,5% roztworu CaCl2 i odczekać 10 – 20 minut na żelowanie, mieszając przy 60-90 obr./min.</li>
</ol>
3. Leczenie kapsułkami alginianowymi (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Kapsułki Alg-Ca inkubować w 0,05 % (w/v) roztworze poli-l-lizyny (PLL) przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po umyciu kapsułek solą fizjologiczną buforowaną przez HEPES należy je inkubować w DMEM zawierającym 10% FBS w celu zneutralizowania ładunku elektrycznego na ich powierzchni. Wykorzystaj je jako kapsułki powlekane (Rysunek 1C).</li>
	<li>Inkubować kapsułki w buforowanym przez HEPES roztworze soli fizjologicznej zawierającym 10 mM EDTA przez 5 minut. Kapsułki poddane działaniu EDTA są wykorzystywane jako puste kapsułki (ryc. 1C).</li>
</ol>
4. Hodowla i zbieranie komórek w kapsułkach alginianowych
<ol>
	<li>Inkubować zamknięte komórki przy prędkości 75 obr./min, wytrząsając w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 dni.</li>
	<li>Zebrać i inkubować kapsułki w 10 mM EDTA w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 minut. Zebrać komórki z kapsułek alginianowych bez poddawania działaniu PLL przez odwirowanie w temperaturze 1 000 × g przez 3 min.</li>
	<li>Jeśli kapsułki alginianowe są traktowane PLL, należy rozbić membranę Alg-PLL, pipetując około dziesięć razy w górę i w dół za pomocą igły dołączonej do strzykawki i odwirować ją przy 1000 - 5000 × g przez 5 minut. Średnica igły powinna być mniejsza niż rozmiar kapsułki, a w tym eksperymencie używa się igieł 25 G (260 μm) (600 μm)</li>
	<li>Po odwirowaniu zbierz osady komórkowe wyłącznie z uszkodzonych błon Alg-PLL, jeśli chcesz pobrać próbki mRNA z komórek. Pozostałe błony Alg-PLL mogą uniemożliwiać oczyszczanie mRNA.</li>
</ol>

<ol><li>Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+production+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large scale production of stem cells and their derivatives.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).</li>
<li>Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+microcarrier+properties+affecting+the+expansion+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+Res%22%5BJournal%5D)">Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).</li>
<li>Schroeder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+lineage+selection+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+stirred+bench+scale+bioreactor+with+automated+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control.</a> Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).</li>
<li>Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agitation+can+induce+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+microcarrier+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%22%5BJournal%5D)">Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures.</a> Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+for+testing+controlled+%C3%9F-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments.</a> Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+morphology%2C+and+pluripotency+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+in+three+different+types+of+alginate+beads+for+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production.</a> Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).</li>
<li>Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vascular+endothelial+growth+factor+functionalized+agarose+to+guide+pluripotent+stem+cell+aggregates+toward+blood+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells.</a> Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Production+of+Embryoid+Bodies+in+Microbeads%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).</li>
<li>Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+Preparation+of+Monodispersed+Calcium+Alginate+Microbeads+in+a+Novel+Microfluidic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Technol%22%5BJournal%5D)">Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System.</a> Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).</li>
<li>Sakai, M. P., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Bioactive+Hydrogel+Capsules+for+The+3D+Expansion+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors.</a> Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+effects+of+secreted+soluble+factor+preserve+better+pluripotent+state+of+embry-+onic+stem+cell+culture+in+a+membrane-based+compartmentalized+micro-bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor.</a> Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alternative+fate+other+than+default+neuronal+fate+of+embryonic+stem+cells+in+a+membrane-based+two-chambered+micro-+bioreactor+by+cell-secreted+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kulturę enkapsulacyjną można porównać z kulturami w zawiesinie bezpośredniej. Hodowla zawiesinowa jest prostszą metodą pozyskiwania dużych ilości pluripotencjalnych komórek macierzystych niż metody enkapsulacji. Jednak kontrolowanie agregacji komórek w hodowli zawiesinowej jest nadal trudne. W metodzie enkapsulacji agregacja komórek jest ograniczona w kapsułkach i dlatego może być dobrze kontrolowana. Poprzednia publikacja wykazała, że otorbione komórki tworzyły agregaty o jednolitej wielkości, podczas gdy duże skupiska ...

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (komórki iPS) są obecnie źródłem intensywnych badań ze względu na ich rolę w medycynie regeneracyjnej. Jednak do regeneracji tkanek potrzebne są ogromne ilości komórek. Na przykład około miliarda komórek trzustki potrzebnych pacjentowi z cukrzycą typu 11. Jednak konwencjonalna hodowla talerzowa jest w stanie uzyskać tylko 1 × 105 komórek/cm2, co wymaga 1 m2 powierzchni hodowli, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek trzustki pochodzących z komórek macierzystych do leczenia pacjenta z cukrzycą typu 1. W związku z tym w medycynie regeneracyjnej konieczne jest opracowanie systemu do masowej hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych, takiego jak mikronośnik2 i hodowla zawiesinowa. Hodowla zawiesinowa stanowi obiecującą metodę hodowli masowej, ale kontrolowanie agregacji komórek jest wyzwaniem w bezpośrednich hodowlach zawiesinowych ludzkich komórek iPS3. Rzeczywiście, zawieszone komórki są narażone na naprężenia ścinające, które powodują uszkodzenie komórek3 lub różnicowanie4.
Badania nad enkapsulacją na bazie hydrożelu zostały przeprowadzone w celu rozwiązania problemów związanych z hodowlą zawiesiny. W kapsułkach hydrożelowych komórki są chronione przed przepływem pożywki. Poprzednie doniesienia udokumentowały stosowanie różnych rodzajów hydrożelu, w tym agarozy5, PEG6 i alginianu (Alg), do enkapsulacji komórkowej. Hydrożel Alg-Ca jest jednym z najbardziej użytecznych hydrożeli do enkapsulacji komórek, ponieważ hydrożel Alg-Ca powstaje natychmiast po wrzuceniu roztworu alginianu do roztworu CaCl2 i jest również łatwo trawiony przez enzymy lub odczynniki chelatujące. 
Tutaj ustaliliśmy stabilny proces enkapsulacji alginianów dla komórek iPS za pomocą dyszy współosiowej. Wykorzystując przepływ gazuN2 do tworzenia kropel, możliwe jest zamknięcie komórek w jednolitych kapsułkach bez konieczności stosowania innych odczynników, takich jak olej. W tej metodzie natężenie przepływu N2 i stężenie zarówno CaCl2, jak i alginianu są głównymi warunkami pracy wpływającymi na rozmiar, kształt i jednorodność kapsułek. Niniejszy raport pokazuje optymalizację tych warunków pracy dzięki zastosowaniu kamery szybkoobrotowej i mikroskopu.

<table><tbody><tr><td>Fibroblasty zarodków myszy</td><td>Cell Biolabs</td><td>SNL 76/7</td><td></td></tr><tr><td>Mysia pluripotencjalna komórka macierzysta</td><td>RIKEN Bio centrum resorcyjne</td><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej stężeniu glukozy</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>ES kwalifikowany&nbsp; FBS</td><td>GIBCO</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki przeciwbakteryjne</td><td>GIBCO</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwas nieistotny</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>GIBCO</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę ESGRO Merck</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna / EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Igła 26 G/16 G</td><td>Hoshiseido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Sód&nbsp; Chlorek</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>Wako</td><td>194-09955</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Wako</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna (MW = 15 000 - 30 000)</td><td>SIGMA</td><td>P7890</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>DOJINDO</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Sylinge</td><td>JAKO JEDEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>Hispeed kamera</td><td>nac technologia obrazu</td><td>Memrecam HX-3</td><td></td></tr></tbody></table>

enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotencjalne komórki macierzyste (komórki PS) są przedmiotem intensywnych badań ze względu na ich rolę w medycynie regeneracyjnej i badaniach przesiewowych leków. Jednak do wykorzystania ogniw PS w tych zastosowaniach wymagane byłoby opracowanie systemu hodowli masowej. Hodowla zawiesinowa jest jedną z obiecujących metod hodowli do masowej produkcji komórek PS, chociaż niektóre kwestie, takie jak kontrolowanie agregacji i ograniczanie naprężeń ścinających z pożywki, są nadal nierozwiązane. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy metodę enkapsulacji alginianu wapnia (Alg-Ca) za pomocą dyszy współosiowej. Ta metoda może łatwo kontrolować rozmiar kapsułek poprzez współprzepływ gazu N2. Kontrolowana średnica kapsułki musi być większa niż 500 μm, ponieważ zbyt duże natężenie przepływu gazuN2 powoduje rozpad kropel, a tym samym kapsułek o niejednorodnych rozmiarach. Co więcej, niskie stężenie Alg-Na i CaCl2 powoduje powstawanie kapsułek niesferycznych. Chociaż kapsułka Alg-Ca bez powłoki Alg-PLL łatwo się rozpuszcza, umożliwiając gromadzenie komórek, mogą one również potencjalnie wyciekać z kapsułek pozbawionych powłoki Alg-PLL. Rzeczywiście, powłoka alginiatowo-PLL może zapobiegać wyciekom komórkowym, ale jest również trudna do złamania. Technologia ta może być wykorzystana do badań niszy komórek macierzystych, a także do masowej produkcji komórek PS, ponieważ enkapsulacja może modyfikować mikrośrodowisko otaczające komórki, w tym macierz zewnątrzkomórkową i stężenie wydzielanych czynników.

W kroku protokołu 2.5, wypchnięty roztwór alginianu natychmiast po wydaleniu przyjmuje kształt sferyczny (Rycina 2A – H). Jeśli zawiesina jest wypychana przy przepływie N2 niższym niż 1L/min, rozmiar kropli jest jednolity (Rycina 2I). Jednakże, jeśli przepływ N2 przekracza 1L/min, kropla rozpada się (Rycina 2G, biała strzałka), a rozmiar kropli staje się niejednorodny (Rycina 2J). W związku z tym, za pomocą tej metody trudno jest pr...

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej. Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej. Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Ogólnym celem tej procedury jest bezpieczne i skuteczne zamykanie komórek macierzystych w kapsułkach z hydrożelu alginianowego oraz ich hodowla wewnątrz kapsułek w celu kontroli agregacji i mikrośrodowiska. Jest to osiągane poprzez wstępne zmieszanie przefiltrowanej zawiesiny komórek macierzystych z roztworem alginianu sodu. Następnie mieszaninę przenosi się do strzykawki, a na strzykawce montuje współosiową dyszę przed umieszczeniem ich na pompie strzykawkowej. Krople są następnie przygotowywane poprzez wypychanie zawiesiny komórkowej przy współpłynącym azocie gazowym, a następnie zbierane w roztworze chlorku wapnia.Kapsułki są następnie traktowane poli-L-lizyną, aby zapobiec wyciekowi komórek, oraz EDTA w celu upłynnienia wewnętrznych kapsułek przed hodowlą enkapsulowanych komórek w warunkach rotacyjnego wstrząsania. Na koniec komórki są odzyskiwane z kapsułek za pomocą EDTA i fizycznego zniszczenia błony. Ostatecznie enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych zapobiega nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające, którym poddawane są komórki w hodowli zawiesinowej.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii i biomedycyny, takie jak szeroka ekspansja komórek do transplantacji oraz badania nad niszą komórek macierzystych. Rozpocznij enkapsulację komórek poprzez ich zebranie zgodnie z opisem w protokole tekstowym, po wirowaniu przy 160 ×g przez trzy minuty. Przepłucz osad indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (IPS) poprzez resuspensję w roztworze soli fizjologicznej HEPES (HBSS) i trzykrotne wirowanie z kolejnymi etapami resuspensji komórek w HBSS.Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 micron, aby usunąć duże agregaty, które w przeciwnym razie mogłyby zapchać dyszę. Następnie zmieszaj dwa mililitry przefiltrowanej zawiesiny komórkowej i trzy mililitry 5% roztworu alginianu sodu. Aby uzyskać pięć mililitrów zawiesiny komórkowej w 3% alginianie sodu, gęstość komórek powinna wynosić DIR więcej niż 1 milion komórek na mililitr.Po pobraniu zawiesiny komórkowej do strzykawki o pojemności 5 ml, zamontuj dyszę współosiową na strzykawce i umieść je w pompie strzykawkowej, aby emitować przepływ gazu azotowego przez zewnętrzną igłę dyszy współosiowej i wypychać zawiesinę komórkową przez dyszę wewnętrzną. Zbieraj krople do 250 ml 0,5% roztworu chlorku wapnia i odczekaj od 10 do 20 minut w celu żelowania, mieszając przy 60 do 90 RPM. Po przemyciu solą fizjologiczną (HBSS), zebrane kapsułki są wykorzystywane jako kapsułki gołe; aby je opracować, inkubuj kapsułki alginianu wapnia w 0,05% w/v.Roztwór poli-L-lizyny przez pięć minut w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przy potrząsaniu. Po zebraniu kapsułek do probówki i przemyciu ich roztworem HEPES buffered saline, inkubować je w DMEM zawierającym 10% FBS. Aby zneutralizować ładunek elektryczny na ich powierzchni, wykorzystać otrzymane kapsułki jako kapsułki powlekane w celu wytworzenia kapsułek pustych.Kapsułki inkubować w soli fizjologicznej z buforem HEPES zawierającej 10 mM EDTA przez pięć minut. Kapsułki traktowane EDTA są wykorzystywane jako kapsułki puste. Inkubować zamknięte w kapsułkach komórki przy 75 RPM z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 dni; po inkubacji zebrać i inkubować kapsułki w 10 mM EDTA w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 minut.Komórki z kapsułek alginianowych, które nie były poddane działaniu poli-L-lizyny, należy zebrać poprzez wirowanie przy 1000 ×g przez trzy minuty. Jeśli kapsułki alginianowe zostały potraktowane poli-L-lizyną, membranę alginianowo-poli-L-lizynową należy rozerwać, pipetując zawartość w górę i w dół około 10 razy za pomocą igły przymocowanej do strzykawki. Średnica igły powinna być mniejsza niż rozmiar kapsułki; w tym doświadczeniu zastosowano igły o rozmiarze 25 G.Po wirowaniu przy 1000 do 5 000 ×g przez pięć minut, należy zebrać osad komórkowy ściśle z przerwanych membran alginianowo-poli-L-lizynowych. W przypadku zbierania próbek mRNA z komórek należy pamiętać, że pozostałości membran alginianowo-poli-L-lizynowych mogą utrudniać oczyszczanie mRNA, co zostało zobrazowane za pomocą kamery wysokiej rozdzielczości. Wypchnięty roztwór alginianu natychmiast po wydaleniu przyjmuje kształt sferyczny. Jeśli zawiesina jest wypychana przy przepływie azotu mniejszym niż jeden litr na minutę, rozmiar kropli jest jednolity.Jeśli jednak przepływ azotu przekracza 1 l/min, kropla ulega rozpadowi, a rozmiar kropli staje się niejednorodny. W związku z tym trudno jest przygotować za pomocą tej metody krople mniejsze niż 500 µm. W procesie żelowania krople alginianu sodu tworzą sferyczne kapsułki alginianu wapnia w roztworze chlorku wapnia.Jeśli jednak stężenie alginianu sodu jest wystarczająco wysokie, niskie stężenie alginianu sodu powoduje powstawanie kapsułek o nieprawidłowym, niesferycznym i nieregularnym kształcie, co utrudnia proces kodowania. Nawet jeśli stężenie alginianu sodu jest niewystarczające, sferyczne kapsułki można uformować poprzez zwiększenie stężenia wapnia. Niemniej jednak, dla procesu enkapsulacji odpowiednie jest stężenie chlorku wapnia wynoszące około 50 millimolar, ponieważ zbyt wysokie stężenie chlorku wapnia obniża wzrost i żywotność komórek.Kapsułkowane komórki mogą rosnąć wewnątrz kapsułek, jednak w kapsułkach pozbawionych powłoki z alginianu i poli-L-lizyny może dochodzić do wycieku komórek. W przypadku mysich komórek iPS, komórki tworzą agregaty w kształcie dysków w każdej kapsułce z alginianu wapnia, natomiast w kapsułkach pustych komórki skupiają się i tworzą pojedyncze agregaty sferyczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak kapsułkować i hodować komórki z kontrolą ich wielkości.Wychwyt wodoru bez użycia specjalistycznego sprzętu i bez zastosowania absorbenta organicznego.

alginate-encapsulation-pluripotent-stem-cells-using-co-axial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Zoptymalizowaliśmy technikę mikroenkapsulacji jako efektywną platformę 3D do propagacji i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w endodermę oraz neurony dopaminergiczne (DA). Zapewnia ona również możliwość immunoisolacji komórek od gospodarza podczas transplantacji. Platforma ta może zostać dostosowana do innych typów komórek.

Mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w różne linie komórkowe

Łącząc generowanie monodyspersyjnych kropli z inercyjnym porządkowaniem komórek i cząsteczek, opisujemy metodę enkapsulacji pożądanej liczby komórek lub cząsteczek w pojedynczej kropli z częstotliwością rzędu kHz. Wykazujemy wydajność dwukrotnie przekraczającą wydajność enkapsulacji nieuporządkowanej w przypadku kropli z jedną lub dwiema cząsteczkami.

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Tutaj prezentujemy protokół enkapsulacji komórek katabolicznych, które zużywają lipidy do produkcji ciepła w tkance tłuszczowej w jamie brzusznej i zwiększają rozpraszanie energii u otyłych myszy.

Enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Ten film i rękopis opisują metodę opartą na emulsji do kapsułkowania komórek ssaków w kulkach alginianowych od 0,5% do 10%, które mogą być produkowane w dużych partiach za pomocą prostego mieszanego naczynia. Zamknięte w kapsułkach komórki mogą być hodowane in vitro lub przeszczepiane do zastosowań w terapii komórkowej.

Enkapsulacja komórek ssaków w kulkach alginianowych za pomocą prostego naczynia z mieszadłem

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Ten artykuł opisuje enkapsulację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) za pomocą urządzenia do ogniskowania przepływu współosiowego. Wykazaliśmy, że ta technologia enkapsulacji mikroprzepływowej umożliwia efektywne tworzenie sferoid hPSC.

Mikroprzepływowe wytwarzanie mikrokapsułek typu core-shell zawierających sferoidy ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.

Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych

Poznaj metodę enkapsulacji pluripotencjalnych komórek macierzystych w kapsułki alginianowe przy użyciu dyszy współosiowej. Technika ta minimalizuje agregację komórek i naprężenia ścinające podczas hodowli zawiesinowej.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Przeglądaj więcej filmów