Name: Mysi model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza na tętnicy szyjnej i naczyniu krezkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę indukcji zakrzepicy u myszy przy użyciu chlorku żelaza i mikroskopii in vivo. Technika ta umożliwia monitorowanie tworzenia się zakrzepu w czasie rzeczywistym oraz ocenę skuteczności leków przeciwzakrzepowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za wsparcie techniczne od Joy Yao i dr Karen Alt, a także za finansowanie ze strony NHMRC i NHF.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Alfred Medical Research and Education Precinct (E/1534/2015/B). Wszystkie manipulacje chirurgiczne były wykonywane w pełnej narkozy, a zwierzęta nie odczuwały bólu na żadnym etapie. Wszystkie opisane eksperymenty nie są regeneracyjne.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wytnij cienkie pasma bibuły filtracyjnej (1 mm x 2 mm).</li>
	<li>Świeżo przygotuj 2 roztwory chlorku żelaza o stężeniu 4% (w/v) i 6% (w/v) rozcieńczone w wodzie dejonizowanej. Przygotować roztwór rodaminy 6G 0,3% w PBS, przefiltrowany przez 0,22 μm.</li>
	<li>Wytnij mały kawałek (5 mm x 1 cm) z białego plastiku opakowania strzykawki.</li>
</ol>
2. Tworzenie się skrzepliny tętniczki krezki obserwowane przez mikroskopię przyżyciową
<ol>
	<li>Zważyć 10-12 tygodniowego samca myszy typu dzikiego C57Bl/6 i odpowiednio znieczulić mieszaniną ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Monitorować głębokość znieczulenia poprzez reakcję na uszczypnięcie palca, ogona i/lub skóry, reaktywność spowodowaną uszczypnięciem rogówki i powiekowej oraz brak ruchu wąsów. W razie potrzeby wstrzyknąć drugą dawkę ketaminy (50 mg/kg) w celu utrzymania znieczulenia zwierzęcia. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Umieść mysz na małej szalce Petriego umieszczonej na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C. 
	UWAGA: Chociaż wstrzyknięcie IP może powodować ból u zwierząt, czas trwania tego dyskomfortu będzie minimalny (mniej niż 3 sekundy). Ból i dyskomfort związany z iniekcjami zostanie zminimalizowany dzięki zastosowaniu doświadczonego i kompetentnego personelu oraz odpowiedniej wielkości igły (25 G). Po wykonaniu wszystkich procedur należy poddać eutanazji wszystkie zwierzęta za pomocą przedawkowania ketaminy i ksylazyny, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie linii środkowej brzucha o długości około 3 cm w skórze i ostrożnie przeciąć otrzewną.</li>
	<li>Umieść mysz z boku szalki Petriego, delikatnie wyeksterioryzuj jej jelita i ostrożnie rozprowadź krezkę za pomocą 2 wacików, aby wyprowadzić odpowiednie naczynie na powierzchnię szalki Petriego. Dokładnie wysuszyć delikatną wycieraczką. 
	UWAGA: Aby ograniczyć ruch naczyń krezkowych, papaweryna może być stosowana w celu zahamowania perystaltyki jelit</li>.
	<li>Namocz ogon myszy w ciepłej wodzie, aby rozszerzyć naczynia krwionośne i wstrzyknij 30 μl rodaminy 6G (0,3%) do żyły ogonowej myszy za pomocą strzykawki 29 G, aby oznaczyć leukocyty i płytki krwi.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego pod odwróconym mikroskopem i skup się na wybranej tętniczce za pomocą kanału jasnego pola.</li>
	<li>Namocz pasmo bibuły filtracyjnej 6% (w/v) chlorkiem żelaza (III) i nałóż bibułę filtracyjną na tętniczkę za pomocą dwóch kleszczyków: pierwszy do przytrzymania bibuły filtracyjnej, drugi do delikatnego dociśnięcia jej do obszaru zainteresowania. Obserwuj tworzenie się skrzepliny w ciągu pierwszych 10 sekund po nałożeniu bibuły filtracyjnej. 
	UWAGA: Dość często dochodzi do uszkodzenia otaczającego mikrokrążenia, a precyzja osadzania bibuły filtracyjnej i delikatny nacisk są dlatego ważne jest, aby ograniczyć ten problem.</li>
	<li>Obserwuj tworzenie się skrzepliny za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (kanał TRITC: wzbudzenie piku 557 nm, emisja piku 576 nm), przez bibułę filtracyjną. Obserwuj krążące leukocyty i płytki krwi, które wchłonęły rodaminę 6G, a zatem ich agregacja do skrzepliny jest łatwa do zidentyfikowania.</li>
	<li>Zdejmij bibułę filtracyjną po 1 minucie ekspozycji na chlorek żelaza (III) i kontynuuj monitorowanie tworzenia się skrzepliny. Umyj naczynie PBS.</li>
	<li>Obserwuj i rejestruj dynamiczne tworzenie się skrzepliny podkreślone znakowaniem płytek krwi i leukocytów za pomocą rodaminy 6G. Uchwyć obrazy i zmierz rozmiar skrzepliny. Przedstawione obrazy uzyskano za pomocą odwróconego mikroskopu przyżyciowego, choć obiektywnego 4X, w kanale fluorescencyjnym TRITC.</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich procedur należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania ketaminy i ksylazyny, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
</ol>
3. Powstawanie skrzepliny w tętnicy szyjnej oceniane na podstawie pomiaru prędkości przepływu krwi
<ol>
	<li>Zważyć 10-12 tygodniowego samca myszy C57Bl/6 i odpowiednio znieczulić mieszaniną ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Zamocuj mysz pod mikroskopem operacyjnym za pomocą taśmy klejącej na nogach, na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C.</li>
	<li>Zrób małą poduszkę z jednej wycieraczki i przyklej ją pod głową myszy, aby lekko unieść głowę. Użyj pętli z nici ze szczypcami, aby pociągnąć pysk w dół (użyj górnych zębów). Spowoduje to odsłonięcie obszaru tętnicy szyjnej w celu łatwego dostępu.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie skóry o głębokości 5 mm bezpośrednio pod szczęką, w dół do mostka.</li>
	<li>Wypreparuj powięź i wyizoluj fragment lewej lub prawej tętnicy szyjnej wspólnej powyżej rozwidlenia.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź pęsetę między tętnicę a nerw, aby je rozdzielić. Nie należy naruszać nerwu biegnącego w pobliżu tętnicy i unikać zbytniego dotykania tętnicy szyjnej, ponieważ może to spowodować uszkodzenie naczynia. Odizolować odcinek co najmniej 5 mm tętnicy.</li>
	<li>Dokładnie osusz obszar tętnicy za pomocą wycieraczek, aby uniknąć zakłóceń płynu z FeCl3.</li>
	<li>Umieść mały biały plastikowy kawałek pod izolowaną częścią wspólnej tętnicy szyjnej, aby FeCl3 nie wsiąkł w otaczające tkanki. W tym celu użyj drugich kleszczy, aby przyłożyć kawałek do pierwszego, a następnie powoli wsuń plastikowy papier pod tętnicę.</li>
	<li>Namocz kawałek bibuły filtracyjnej 4% (w/v) lub 6% (w/v) chlorku żelaza i umieść go wokół tętnicy.</li>
	<li>Po 3 minutach ekspozycji zdejmij bibułę filtracyjną, spłucz PBS i osusz obszar wycieraczkami.</li>
	<li>Umieść sondę przepływu Dopplera wokół naczynia w miejscu urazu i zacznij rejestrować zmiany przepływu. W zdrowej tętnicy szyjnej dorosłej myszy przepływ wynosi zwykle około 1 ml/min. Uwaga! Kontakt sondy z chlorkiem żelaza spowoduje jej uszkodzenie, dlatego należy unikać jakiegokolwiek kontaktu. Przedstawione dane uzyskano za pomocą przepływomierza Transonic System Inc., modułu okołonaczyniowego TS420 wyposażonego w sondę przepływu Nano Doppler 0,5 PBS. 
	UWAGA: Stężenie chlorku żelaza może modyfikować kinetykę tworzenia się skrzepliny, co skutkuje różnymi czasami okluzji. Zatem ekspozycja na 6% (w/v) chlorku żelaza daje szybszą okluzję niż ekspozycja na 4% (w/v) chlorek żelaza.</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich procedur należy poddać eutanazji wszystkie zwierzęta za pomocą przedawkowania ketaminy i ksylazyny, a następnie zwichnięcia szyjki macicy i ostrożnie wyczyścić sondę Dopplera.</li>
</ol>

<ol><li>Leadley, R. J., Chi, L., Rebello, S. S., Gagnon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+in+vivo+models+of+thrombosis+to+the+discovery+and+development+of+novel+antithrombotic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 43 (2), 101-116 (2000).</li>
<li>Johnson, G. J., Griggs, T. R., Badimon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+animal+models+in+the+preclinical+study+of+interventions+to+prevent+human+coronary+artery+restenosis%3A+analysis+and+recommendations.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Animal%2C+Cellular+and+Molecular+Models+of+Thrombosis+and+Haemostasis+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+International+Society+on+Thrombosis+and+Haemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">The utility of animal models in the preclinical study of interventions to prevent human coronary artery restenosis: analysis and recommendations. On behalf of the Subcommittee on Animal, Cellular and Molecular Models of Thrombosis and Haemostasis of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis.</a> Thromb Haemost. 81 (5), 835-843 (1999).</li>
<li>Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+thrombosis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Murine thrombosis models.</a> Thromb Haemost. 92 (3), 486-494 (2004).</li>
<li>Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+thrombus+formation+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo thrombus formation in murine models.</a> Circ Res. 100 (7), 979-991 (2007).</li>
<li>Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of thrombus formation.</a> N Engl J Med. 359 (9), 938-949 (2008).</li>
<li>Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H., Anderson, G., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+thrombosis+in+a+mouse+model+by+IgG%2C+IgM+and+IgA+immunoglobulins+from+patients+with+the+antiphospholipid+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome.</a> Thromb Haemost. 74 (5), 1361-1367 (1995).</li>
<li>Kikuchi, S., Umemura, K., Kondo, K., Saniabadi, A. R., Nakashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemically+induced+endothelial+injury+in+the+mouse+as+a+screening+model+for+inhibitors+of+vascular+intimal+thickening%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Photochemically induced endothelial injury in the mouse as a screening model for inhibitors of vascular intimal thickening.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18 (7), 1069-1078 (1998).</li>
<li>Rosen, E. D., Raymond, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+noninvasive+vascular+injury+models+in+mice+generate+platelet-+and+coagulation-dependent+thrombi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi.</a> Am J Pathol. 158, 1613-1622 (2001).</li>
<li>Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+model+of+arterial+thrombosis+induced+by+ferric+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride.</a> Thromb Res. 60 (4), 269-280 (1990).</li>
<li>Eckly, A., Hechler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+FeCl3-induced+arterial+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis.</a> J Thromb Haemost. 9 (4), 779-789 (2011).</li>
<li>Darbousset, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+neutrophils+in+thrombus+formation+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Biol+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Involvement of neutrophils in thrombus formation in living mice.</a> Pathol Biol (Paris). 62 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Denis, C., Methia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+severe+von+Willebrand+disease%3A+defects+in+hemostasis+and+thrombosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model of severe von Willebrand disease: defects in hemostasis and thrombosis).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (16), 9524-9529 (1998).</li>
<li>Wang, X., Hagemeyer, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single-chain+antibody-targeted+microbubbles+for+molecular+ultrasound+imaging+of+thrombosis%3A+validation+of+a+unique+noninvasive+method+for+rapid+and+sensitive+detection+of+thrombi+and+monitoring+of+success+or+failure+of+thrombolysis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Novel single-chain antibody-targeted microbubbles for molecular ultrasound imaging of thrombosis: validation of a unique noninvasive method for rapid and sensitive detection of thrombi and monitoring of success or failure of thrombolysis in mice.</a> Circulation. 125 (25), 3117-3126 (2012).</li>
<li>Wang, X., Smith, P. L., Hsu, M. -Y., Ogletree, M. L., Schumacher, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+ferric+chloride-induced+vena+cava+thrombosis%3A+evidence+for+effect+of+potato+carboxypeptidase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Murine model of ferric chloride-induced vena cava thrombosis: evidence for effect of potato carboxypeptidase inhibitor.</a> J Thromb Haemost. 4 (2), 403-410 (2006).</li>
<li>Karatas, H., Erdener, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl%283%29+application%3A+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (6), 1452-1460 (2011).</li>
<li>Jirousková, M., Chereshnev, I., Väänänen, H., Degen, J. L., Coller, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+blockade+or+mutation+of+the+fibrinogen+gamma-chain+C-terminus+is+more+effective+in+inhibiting+murine+arterial+thrombus+formation+than+complete+absence+of+fibrinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibody blockade or mutation of the fibrinogen gamma-chain C-terminus is more effective in inhibiting murine arterial thrombus formation than complete absence of fibrinogen.</a> Blood. 103 (6), 1995-2002 (2004).</li>
<li>Dubois, C., Panicot-Dubois, L., Merrill-Skoloff, G., Furie, B., Furie, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+VI-dependent+and+-independent+pathways+of+thrombus+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein VI-dependent and -independent pathways of thrombus formation in vivo.</a> Blood. 107 (10), 3902-3906 (2006).</li>
<li>Navarrete, A. -M., Casari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+to+characterize+the+antithrombotic+effect+of+molecules+targeting+human+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A murine model to characterize the antithrombotic effect of molecules targeting human von Willebrand factor.</a> Blood. 120 (13), 2723-2732 (2012).</li>
<li>Rayes, J., Hollestelle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+and+ADAMTS13-dependent+modulation+of+disease+severity+in+a+mouse+model+for+von+Willebrand+disease+type+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mutation and ADAMTS13-dependent modulation of disease severity in a mouse model for von Willebrand disease type 2B.</a> Blood. 115 (23), 4870-4877 (2010).</li>
<li>Lamrani, L., Lacout, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostatic+disorders+in+a+JAK2V617F-driven+mouse+model+of+myeloproliferative+neoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hemostatic disorders in a JAK2V617F-driven mouse model of myeloproliferative neoplasm.</a> Blood. 124 (7), 1136-1145 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+activation+and+thrombosis+in+transgenic+mice+expressing+constitutively+active+P2Y12%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Increased platelet activation and thrombosis in transgenic mice expressing constitutively active P2Y12.</a> J Thromb Haemost. 10 (10), 2149-2157 (2012).</li>
<li>Schäfer, K., Konstantinides, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+mechanisms+of+increased+luminal+stenosis+after+arterial+injury+in+mice+deficient+for+urokinase-+or+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Different mechanisms of increased luminal stenosis after arterial injury in mice deficient for urokinase- or tissue-type plasminogen activator.</a> Circulation. 106 (14), 1847-1852 (2002).</li>
<li>Wang, X., Palasubramaniam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+effective+and+safe+thrombolysis+and+thromboprophylaxis%3A+preclinical+testing+of+a+novel+antibody-targeted+recombinant+plasminogen+activator+directed+against+activated+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Towards effective and safe thrombolysis and thromboprophylaxis: preclinical testing of a novel antibody-targeted recombinant plasminogen activator directed against activated platelets.</a> Circ Res. 114 (7), 1083-1093 (2014).</li>
<li>Decrem, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ir-CPI%2C+a+coagulation+contact+phase+inhibitor+from+the+tick+Ixodes+ricinus%2C+inhibits+thrombus+formation+without+impairing+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Ir-CPI, a coagulation contact phase inhibitor from the tick Ixodes ricinus, inhibits thrombus formation without impairing hemostasis.</a> J Exp Med. 206 (11), 2381-2395 (2009).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmolaris%2C+a+novel+factor+XIa+anticoagulant+from+the+salivary+gland+of+the+vampire+bat+%28Desmodus+rotundus%29+inhibits+inflammation+and+thrombosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Desmolaris, a novel factor XIa anticoagulant from the salivary gland of the vampire bat (Desmodus rotundus) inhibits inflammation and thrombosis in vivo.</a> Blood. 122 (25), 4094-4106 (2013).</li>
<li>Lei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anfibatide%2C+a+novel+GPIb+complex+antagonist%2C+inhibits+platelet+adhesion+and+thrombus+formation+in+vitro+and+in+vivo+in+murine+models+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Anfibatide, a novel GPIb complex antagonist, inhibits platelet adhesion and thrombus formation in vitro and in vivo in murine models of thrombosis.</a> Thromb Haemost. 111 (2), 279-289 (2014).</li>
<li>Waisberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+infection+induces+expression+of+a+mosquito+salivary+protein+%28Agaphelin%29+that+targets+neutrophil+function+and+inhibits+thrombosis+without+impairing+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum infection induces expression of a mosquito salivary protein (Agaphelin) that targets neutrophil function and inhibits thrombosis without impairing hemostasis.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004338(2014).</li>
<li>Owens, A. P., Lu, Y., Whinna, H. C., Gachet, C., Fay, W. P., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+standardization+of+the+murine+ferric+chloride-induced+carotid+arterial+thrombosis+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Towards a standardization of the murine ferric chloride-induced carotid arterial thrombosis model.</a> J Thromb Haemost. 9 (9), 1862-1863 (2011).</li>
<li>Wang, X., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+murine+model+of+ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+for+thrombosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">An optimized murine model of ferric chloride-induced arterial thrombosis for thrombosis research.</a> Thromb Res. 115 (1-2), 95-100 (2005).</li>
<li>Tseng, M. T., Dozier, A., Haribabu, B., Graham, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+migration+of+ferric+ion+in+FeCl3+injured+murine+common+carotid+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Transendothelial migration of ferric ion in FeCl3 injured murine common carotid artery.</a> Thromb Res. 118 (2), 275-280 (2006).</li>
<li>Bonnard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+mimetic+polysaccharide+microparticles+tracked+in+vivo+on+activated+endothelium+and+in+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Leukocyte mimetic polysaccharide microparticles tracked in vivo on activated endothelium and in abdominal aortic aneurysm.</a> Acta Biomater. 10 (8), 3535-3545 (2014).</li>
<li>Boulaftali, Y., Lamrani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+dorsal+skinfold+chamber+as+a+model+for+the+study+of+thrombolysis+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">The mouse dorsal skinfold chamber as a model for the study of thrombolysis by intravital microscopy.</a> Thromb Haemost. 107 (5), 962-971 (2012).</li>
<li>Konstantinides, S., Schäfer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+and+its+cofactor+vitronectin+stabilize+arterial+thrombi+after+vascular+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice.</a> Circulation. 103 (4), 576-583 (2001).</li>
<li>Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+murine+carotid+arterial+injury%3A+A+model+of+redox+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology.</a> Redox Biol. 1 (1), 50-55 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Model zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza jest doskonałym narzędziem badawczym. Jak wykazano w tym badaniu, jest on niezwykle łatwy do wdrożenia, a gdy jest stosowany w połączeniu z mikroskopią przyżyciową lub przepływomierzem dopplerowskim, zapewnia dobre monitorowanie tworzenia się skrzepliny w czasie rzeczywistym. Dostosowując czas ekspozycji i stężenie FeCl3, daje również możliwość wytwarzania skrzeplin nieokluzyjnych lub okluzyjnych.
Jednak ta metoda ma również pewne ograni...

Badanie mechanizmów związanych z rozwojem zakrzepicy i ocena skuteczności leków przeciwzakrzepowych wymaga dobrze ugruntowanych eksperymentalnych modeli zwierzęcych. Jako pierwsze wykorzystano duże modele zwierzęce, ponieważ zapewniają one duże naczynia bardziej podobne do ludzi niż gryzoni1. Jednak wysokie koszty, wymagane większe obiekty i trudności w genetycznej manipulacji nimi są głównymi wadami ich stosowania, a duże zwierzęta są obecnie ograniczone do późnych badań przedklinicznych, gdy wstępne testy na gryzoniach dały rozstrzygające wyniki2. Dzięki szerokiej dostępności szczepów transgenicznych i knockout oraz ich niewielkim rozmiarom, które minimalizują ilość leków przeciwzakrzepowych wymaganych do testów in vivo, myszy są głównie wykorzystywane do badań nad zakrzepicą. Dlatego u myszy opracowano kilka modeli zaburzeń zakrzepowych3.
Wiele znanych modeli zakrzepicy narusza warstwę wewnętrzną ściany naczynia, po czym następuje ekspozycja podśródbłonkowej macierzy zewnątrzkomórkowej na przepływ krwi, powodując powstawanie skrzepów krwi4. Skrzepliny mogą wynikać z ekspozycji kolagenu, który wyzwala aktywację płytek krwi i/lub z ekspozycji czynnika tkankowego, który aktywuje kaskadę krzepnięcia5. Następnie stosuje się kilka technik, aby osiągnąć początkowe uszkodzenie naczynia. Pierangeli i wsp. opracowali model mechanicznego zakłócenia za pomocą narzędzia mikrochirurgicznego na żyle udowej6. Kikushi i wsp. opisano model, który polega na podaniu związku fotoreaktywnego (Rose Bengal), który gromadzi się w dwuwarstwie lipidowej komórek śródbłonka, a następnie na specyficznym wzbudzeniu ściany naczynia za pomocą zielonego światła (540 nm)7. Uraz może być również wywołany przez krótkie, impulsowe oświetlenie laserowe o dużej intensywności8. Inna technika po raz pierwszy opracowana na tętnicy szyjnej szczurów polega na miejscowym stosowaniu chlorku żelaza (FeCl3)9. W tym przypadku denudacja naczyń wynika z wolnych rodników generowanych przez FeCl3, który powoduje peroksydację lipidów i niszczenie komórek śródbłonka10. Uraz indukuje ekspresję kilku cząsteczek adhezyjnych, wywołując adhezję i agregację płytek krwi, a także rekrutację leukocytów. Wykazano, że leukocyty, zwłaszcza neutrofile, odgrywają kluczową rolę w aktywacji kaskady krzepnięcia krwi prowadzącej do zakrzepicy11. Ta metoda dobrze nadaje się do odtwarzania kaskady krzepnięcia; Badacze muszą pamiętać, że w tym modelu mysim zakrzepica jest zwykle wywoływana w zdrowych naczyniach, podczas gdy zakrzepica u ludzi występuje głównie u chorych, np. naczynia miażdżycowe.
Ponieważ ten model jest bardzo prosty do wdrożenia i skuteczny również u myszy, jest obecnie najczęściej używanym modelem zakrzepicy w badaniach in vivo na małych zwierzętach. Ponadto technika ta daje możliwość wywołania powstawania skrzeplin w różnych naczyniach. Naczyniami docelowymi mogą być tętnice lub żyły o dużej średnicy (tętnica szyjna, kość udowa, żyła główna) lub małej średnicy (krezka, krezka)12–14. Ostatnio zastosowano go również na bliższej środkowej tętnicy mózgowej w celu opracowania modelu udaru15. Powstawanie zakrzepicy można bezpośrednio obserwować za pomocą mikroskopii przyżyciowej po znakowaniu fluorescencyjnym płytek krwi i leukocytów lub monitorować poprzez pomiar spadku przepływu krwi za pomocą sondy temperatury lub sondy dopplerowskiej12,16,17. Następnie można zbadać kilka parametrów, takich jak czas okluzji, czas tworzenia skrzepliny lub wielkość skrzepliny. Różnice fizjologiczne między badanymi naczyniami skutkują znacznymi różnicami w uzyskanych skrzeplinach. Dlatego badacze zwykle wybierają naczynie docelowe zgodnie z parametrami, które chcą zmierzyć i/lub ustawieniem choroby, które chcą zbadać. Zazwyczaj model tętnicy szyjnej jest bardziej odpowiedni dla badań nad zakrzepicą tętnic związanych z zawałem mięśnia sercowego lub udarem, podczas gdy badania nad żyłą główną są bardziej istotne dla badań nad zakrzepicą żył głębokich. Dostępność różnych naczyń decyduje również o metodzie stosowanej do pomiaru wzrostu skrzepliny. Na przykład naczynia krezkowe są łatwo dostępne, co sprawia, że model ten dobrze nadaje się do przyżyciowej obserwacji mikroskopowej i badania dynamiki powstawania skrzepliny. Tętnica szyjna jest mniej dostępna, ale większa, co umożliwia pomiary przepływu krwi i stanowi doskonały model do badania zakrzepicy okluzyjnej.
Model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza zapewnił ogromny postęp w zrozumieniu tej patologii. Został wykorzystany w wielu badaniach koncentrujących się na roli czynnika von Willebranda w powstawaniu zakrzepicy18,19. W połączeniu z technikami modyfikacji genetycznej umożliwiło to identyfikację wielu specyficznych genów zaangażowanych w zaburzenia zakrzepowe. Lamrani i wsp. na przykład wykazały, że knock-in genuJAK2 V617F jest związany z przyspieszonym tworzeniem się niestabilnego skrzepu20. Zhang i in. zbadali fizjologiczne implikacje receptora płytkowego P2Y12 i wykazali, że myszy transgeniczne z nadekspresją specyficznie tego receptora tylko w płytkach krwi, wykazywały szybsze i stabilniejsze tworzenie się skrzepliny w tętnicy krezkowej uszkodzonej FeCl321. W tej metodzie zbadano również kluczową rolę tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) i aktywatora plazminogenu typu urokinazy (uPA) w procesie degradacji fibryny22. Co więcej, model ten zapewnia również prosty i dokładny sposób testowania zdolności fibrynolitycznych wielu nowych leków in vivo. Na przykład Wang i wsp. wykorzystali ten model do przedklinicznej walidacji nowego rekombinowanego aktywatora plazminogenu ukierunkowanego na aktywowane płytki krwi23. Metoda ta umożliwiła również walidację białek terapeutycznych wyizolowanych ze śliny kleszczy, nietoperzy wampirów i komarów lub z jadu węży ze specyficzną identyfikacją celu24-27. Przykłady te pokazują wszechstronność modelu chlorku żelaza. W tym artykule skupiamy się na dwóch metodach i badamy zakrzepicę indukowaną chlorkiem żelaza na dwóch różnych typach naczyń; naczynie krezkowe i tętnica szyjna.

<table><tbody><tr><td>Bibuła chromatograficzna Whatman</td><td>GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza (III) 40% (w/v)</td><td>VWR</td><td>24212.298</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy czarno-biały aparat&nbsp;</td><td>Przepływomierz</td> dopplerowski Olympus <td>XM10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Transonic</td><td>TS420</td><td></td></tr><tr><td>Nano-dopplerowska sonda przepływu</td><td>Transonic</td><td>0,5 PBS</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Hospira&nbsp;</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Rampun)</td><td>Bayer</td><td>75313&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa (29 G)</td><td>BD Ultra-Fine</td><td>326103</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>BSN medical</td><td>211827A</td><td></td></tr><tr><td>Nici dysilkowe</td><td>Dynek Dynek Pty Ltd</td><td>CS30100</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Dulbecco sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Gibco life technologies</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Kirchner</td><td>T60</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza na tętnicy szyjnej i naczyniu krezkowym

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Ciężka zakrzepica i jej niedokrwienne konsekwencje, takie jak zawał mięśnia sercowego, zatorowość płucna i udar mózgu, są głównymi problemami zdrowotnymi na całym świecie. Uszkodzenie chlorkiem żelaza jest obecnie dobrze znaną techniką szybkiego i dokładnego wywoływania tworzenia się skrzeplin w odsłoniętych żyłach lub tętnicach o małej i dużej średnicy. Model ten odegrał kluczową rolę w badaniach nad patofizjologią zakrzepicy, w odkrywaniu i walidacji nowych leków przeciwzakrzepowych oraz w zrozumieniu mechanizmu działania tych nowych leków. W tym miejscu przedstawiono zastosowanie tej techniki na naczyniu krezkowym i tętnicy szyjnej u myszy. Metoda opisuje sposób znakowania krążących leukocytów i płytek krwi barwnikiem fluorescencyjnym oraz obserwacji za pomocą mikroskopii przyżyciowej na odsłoniętej krezce ich nagromadzenia na uszkodzonej ścianie naczynia, co prowadzi do powstania skrzepliny. Na tętnicy szyjnej niedrożność spowodowaną tworzeniem się skrzepu mierzy się poprzez monitorowanie przepływu krwi za pomocą sondy dopplerowskiej.

Fluorescencyjna mikroskopia intravitalna krezki wykaże gromadzenie się znakowanych Rodaminą 6G płytek krwi i leukocytów wzdłuż ściany naczynia uszkodzonego przez FeCl3. Postępujące tworzenie się częściowego zakrzepu jest monitorowane w naczyniu krezki o średnicy 200 µm (Rysunek 1). Zakrzep pojawia się powoli i jest wyraźnie identyfikowalny po pierwszej minucie ekspozycji na FeCl3 (Rysunek 1, t = 60 sec). 40 sec po usunięciu papieru filtracyjnego nasączonego FeCl<sub...

Model zakrzepicy indukowanej FeCl3 u myszy jest opisany tutaj. Przedstawiono metodę monitorowania wzrostu skrzepliny za pomocą obserwacji mikroskopowej przyżyciowej naczynia krezkowego oraz pomiaru przepływu krwi w tętnicy szyjnej.

Mysi model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza na tętnicy szyjnej i naczyniu krezkowym

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie powstawania wywołanej zakrzepicy w odsłoniętym naczyniu krwionośnym myszy. Osiąga się to najpierw poprzez odsłonięcie wybranego naczynia. Następnie na naczynie krezkowe nakłada się niewielki kawałek papieru filtracyjnego nasączonego chlorkiem żelaza, aby wywołać powstanie zakrzepu.Agregację komórek tworzących zakrzep monitorowano za pomocą mikroskopii w naczyniu w obrębie tętnicy szyjnej. Zmiany w przepływie krwi wywołane przez zakrzep mierzono za pomocą dopplerometru. Zastosowanie chlorków do indukcji zakrzepicy w tętnicy CED u szczurów zostało po raz pierwszy opracowane w 1990 roku przez profesora Coza i współpracowników.Od tego czasu metoda ta została dostosowana do myszy i wykorzystana do badania wielu różnych naczyń. Obecnie jest to najczęściej stosowany model zakrzepicy w naszej dziedzinie badań, który pomógł odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak czynniki ryzyka związane ze ścianą naczynia oraz rola receptora P2Y12 na płytkach krwi w formowaniu zakrzepów. Przed rozpoczęciem procedury należy wyciąć paski papieru filtracyjnego o wymiarach 1x2 mm oraz mały kawałek białego plastiku o wymiarach 3x5 mm z opakowania strzykawki.Nas

ferric-chloride-induced-thrombosis-mouse-model-on-carotid-artery

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy udoskonaloną procedurę modeli zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza (FeCl3) na tętnicy szyjnej i krezkowej oraz żyle, scharakteryzowaną efektywnie za pomocą mikroskopii przyżyciowej do monitorowania czasu do powstania skrzeplin okluzyjnych.

Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza

Tutaj prezentujemy modyfikacje niezbędne do dobrze scharakteryzowanego i powszechnie stosowanego modelu uszkodzenia tętnicy szyjnej wywołanego chlorkiem żelaza (FeCl3) dla małych zwierząt, do wykorzystania w modelu uszkodzenia naczyń krwionośnych dużych zwierząt. Uzyskany w ten sposób model może być wykorzystany do oceny badań przedklinicznych zarówno profilaktycznych, jak i trombolitycznych interwencji farmakologicznych i mechanicznych.

Zakrzepica tętnicy szyjnej psów wywołana chlorkiem żelaza: duży zwierzęcy model uszkodzenia naczyń krwionośnych

Obecny protokół opisuje, jak wykorzystać uraz za pośrednictwemFeCl 3 do wywołania zakrzepicy tętniczej, oraz jak zbierać i przygotowywać próbki uszkodzeń tętnic na różnych etapach zakrzepicy do analizy mikroskopowej elektronowej.

Zakrzepica tętnicza wywołana chlorkiem żelaza i pobieranie próbek do analizy pod mikroskopem elektronowym 3D

Opisano tutaj zabieg częściowego podwiązania tętnicy szyjnej, który wywołuje zaburzenia przepływu krwi i późniejszy rozwój miażdżycy (w ciągu dwóch tygodni) z neowaskularyzacją wewnątrzblaszczkową (w ciągu czterech tygodni) w wspólnej tętnicy szyjnej myszy. Opisano również nową metodę izolacji RNA z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej, zapewniającą wysoką czystość RNA śródbłonkowego.

Model miażdżycy indukowanej zaburzeniem przepływu w tętnicy szyjnej myszy poprzez częściowe podwiązanie oraz prosta metoda izolacji RNA z endotelium tętnicy szyjnej

Myszie kompletne model stazy w zakrzepicy żyły głównej dolnej pozwala na uzyskanie mierzalnych ilości tkanki ściany żyły oraz zakrzepu. Model ten okazał się użyteczny w ocenie oddziaływań między ścianą żyły a zakrzepem zamykającym światło naczynia oraz w analizie przejścia od stanu ostrego do chronicznego stanu zapalnego.

Myszy w całkowitym modelu zastoju zakrzepicy żyły głównej dolnej

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

Opisano model implantacji stentu w tętnicy szyjnej myszy. W porównaniu z innymi podobnymi metodami, procedura ta jest bardzo szybka, prosta i dostępna, oferując możliwość zbadania w wygodny sposób reakcji ściany naczyniowej na różne stenty uwalniające leki oraz molekularnych mechanizmów restenozy.

Mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy

Opisujemy metodę tworzenia wiarygodnego modelu nadciśnienia żylnego mózgu u dorosłej myszy. Model ten został szeroko opisany i przetestowany na szczurach. Ten nowy odpowiednik u myszy otwiera możliwość wykorzystania genetycznie zmodyfikowanych zwierząt, a tym samym poszerza zastosowania modelu.

Model nadciśnienia żylnego dorosłej myszy: Zespolenie tętnicy szyjnej wspólnej z żyłą szyjną zewnętrzną.

Ta metoda została opracowana w celu dostarczenia stałego roztworu leku przez tętnicę szyjną, aby ocenić farmakokinetykę nowych leków w modelach mysich.

Wlewy z tętnic szyjnych do analizy farmakokinetycznej i farmakodynamicznej taksanów u myszy

Ten protokół wykorzystuje cewnik balonowy do spowodowania uszkodzenia śródświetlnego tętnicy szyjnej szczura i wywołania przerostu neointimalu. Jest to dobrze ugruntowany model do badania mechanizmów przebudowy naczyń krwionośnych w odpowiedzi na uraz. Jest również szeroko stosowany do określania ważności potencjalnych podejść terapeutycznych.

Uszkodzenie balonu naczyniowego i podanie śródświetlne w tętnicy szyjnej szczura

Poznaj metodę indukcji zakrzepicy u myszy przy użyciu chlorku żelaza i mikroskopii in vivo. Technika ta umożliwia monitorowanie tworzenia się zakrzepu w czasie rzeczywistym oraz ocenę skuteczności leków przeciwzakrzepowych.

Mysi model zakrzepicy wywołanej chlorkiem żelaza na tętnicy szyjnej i naczyniu krezkowym

Przeglądaj więcej filmów