Name: Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj metodę pomiaru stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych szczura. Technika umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym i badanie aktywności pojedynczych kanałów jonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Glenowi Slocumowi (Medical College of Wisconsin) i Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) za doskonałą pomoc techniczną przy eksperymentach mikroskopowych. Gregory Blass został doceniony za krytyczną korektę manuskryptu. Badania te były wspierane przez grant National Institutes of Health HL108880 i grant American Diabetes Association 1-15-BS-172 (dla AS) oraz stypendium badawcze Bena J. Lippsa z American Society of Nephrology (dla DVI).

Wykorzystanie i dobrostan zwierząt powinny być zgodne z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Płukanie nerek
<ol>
	<li>Użyć samców szczurów w wieku od 8 do 12 tygodni (sugerowany szczep Sprague Dawley, jednak można stosować inne szczepy w różnym wieku i o różnej płci, wprowadzając odpowiednie modyfikacje).</li>
	<li>Zanurzyć zwierzę w narkozie zgodnie z procedurą dopuszczoną przez protokół IACUC; monitorować głębokość znieczulenia i zbadać zwierzę. Szczegółowy opis zabiegu chirurgicznego, który zostanie przeprowadzony w punktach 1.3 - 1.8, znajduje się w pracy Ilatovskaya et al.7</li>
	<li>Po prawidłowym znieczuleniu umieścić zwierzę na stole operacyjnym z kontrolą temperatury, wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha (do 3 cali długości) i odsłonić żyłę główną oraz aortę.</li>
	<li>Założyć ligaturę wokół tętnicy trzewnej, tętnicy krezkowej górnej oraz aorty brzusznej powyżej nich; nie podwiązywać.</li>
	<li>Wyonać tępe rozdzielenie aorty brzusznej poniżej tętnic nerkowych i założyć wokół niej dwie ligatury, ale nie podwiązywać; następnie zacisnąć aortę powyżej ligatur i zawiązać dolną nitkę.</li>
	<li>Wprowadzić do aorty cewnik z rurki polietylenowej PE50 (podłączonej do pompy strzykawkowej wypełnionej PBS) poniżej zacisku i przymocować cewnik drugą ligaturą; usunąć zacisk, włączyć pompę i podwiązać aortę oraz tętnicę krezkową wraz z tętnicą trzewną. Szybko wykonać nacięcie w żyle nerkowej, aby obniżyć ciśnienie.</li>
	<li>Przeprowadzić perfuzję aorty schłodzonym PBS przez 2 lub 3 min z szybkością 6 ml/min.</li>
	<li>Zatrzymać perfuzję, wyciąć i odtrułować7 nerki, a następnie umieścić je w roztworze PBS na lodzie. Uśmiercić zwierzę zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC.</li>
</ol>
2. Izolacja kłębuszków nerkowych szczura
<ol>
	<li>Przygotować 30 ml świeżego roztworu 5% BSA w RPMI 1640.</li>
	<li>Za pomocą żyletki i nożyczek wyizolować korę obu nerek, a następnie rozdrobnić do uzyskania homogennej masy. Procedura ta została opisana wcześniej7.</li>
	<li>Rozdrobnioną w poprzednim kroku tkankę przecisnąć szpachelką przez stalowe sito o oczkach 100 mesh (wcześniej namoczone w roztworze 5% BSA/RPMI). Zebrać przelewy i pozwolić im spłynąć grawitacyjnie przez sito o oczkach 140 mesh.</li>
	<li>Przelewy zebrane z sita 140 mesh przefiltrować przez wcześniej namoczone sito o oczkach 200 mesh, odrzucić filtrat, a górną część sita przemyć 10 – 15 ml przygotowanego roztworu BSA/RPMI, aby zebrać kłębki nerkowe osadzające się na sicie.</li>
	<li>Roztwór BSA/RPMI zawierający kłębki nerkowe umieścić w probówce 15 ml na lodzie i pozostawić kłębki do osadzenia na dnie probówki przez maksymalnie 20 min. Koncentrat kłębków nerkowych na dnie probówki będzie wyraźnie widoczny. Usunąć nadmiar roztworu, pozostawiając w probówce około 2 ml.</li>
</ol>
3. Jednokanałowa elektrofizjologia patch-clamp
<ol>
	<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe o wymiarach 5 x 5 mm, pokrywając je poli-ʟ-lizyną o MW 70 000 - 150 000, i pozostawić do wyschnięcia. Na każde szkiełko zużyć około 30 µl 0,01% sterylnego roztworu filtrowanego w wodzie.</li>
	<li>Ogrzać roztwory eksperymentalne do RT i napełnić komorę do patch-clamp oraz pipetę. Do monitorowania kanałów TRPC zastosować roztwór kąpielowy, w mM: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glukozy, pH 7,4; roztwór do pipety: 126 NaCl, 1,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukozy; pH 7,4.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed eksperymentem patch-clamp dodać do roztworu w pipecie inhibitory w celu zablokowania aktywności kanałów endogennych, które nie są istotne dla prowadzonych badań (zaleca się: 100 µM kwasu niflumowego lub DIDS (do blokowania kanałów Cl- aktywowanych przez Ca2+), 10 mM TEA (do hamowania K+ kanałów zależnych od Ca2+ o dużym przewodnictwie), 10 nM iberiotoksyny (do blokowania K+ kanałów aktywowanych przez Ca2+), 10 µM nikardypiny (do blokowania Ca2+ kanałów typu N)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie wymieszać roztwór zawierający kłębki nerkowe, a następnie nanieść około 50 µl tego roztworu na szkiełka nakrywkowe pokryte poli-ʟ-lizyną. Pozostawić kłębki do przytwierdzenia na około 5 min.</li>
	<li>Przenieść szkiełka z kłębkami do komory patch-clamp uprzednio napełnionej roztworem kąpielowym; perfundować komorę z prędkością 3 ml/min przez 1 min, aby zapewnić usunięcie nieprzytwierdzonych kłębków.</li>
	<li>Przeprowadzić konwencjonalny eksperyment patch-clamp w konfiguracji cell-attached7. Za pomocą szklanej pipety (oporność pipety 7 - 10 MΩ) utworzyć szczelne połączenie o wysokiej oporności (seal) między pipetą a błoną podocytu poprzez zastosowanie delikatnego ssania (pipetę przytwierdzoną do podocytu na powierzchni wyizolowanego kłębka przedstawiono na Rysunku 2, po lewej stronie).</li>
	<li>Dla pomiarów w konfiguracji cell-attached zastosować filtr dolnoprzepustowy dla prądów przy 300 Hz za pomocą ośmiopolowego filtru Bessela.</li>
	<li>Wyizolowane kłębki nerkowe można wykorzystywać w eksperymentach patch-clamp przez maksymalnie 4 - 6 h. Zapasową frakcję kłębków przechowywać w lodzie.</li>
</ol>
4. Ratiometryczne pomiary fluorescencyjne konfokalne wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w podocytach
<ol>
	<li>Przenieś 500 µl frakcji kłębuszków (opisanej w punkcie 2.5) do stożkowej probówki o pojemności 0,5 ml i dodaj barwniki wapniowe Fura Red, AM oraz Fluo-4, AM. Użyj roztworów stokowych Fura Red, AM o stężeniu 2 mM i Fluo-4, AM o stężeniu 1 mM (przechowywać w -20 °C, rozpuszczone w DMSO), stosując 2,5 µl każdego barwnika na 500 µl frakcji kłębuszków. Natychmiast po dodaniu barwników owiń probówkę folią aluminiową.</li>
	<li>Umieść probówki na wytrząsarce obrotowej na co najmniej 20 min, maksymalnie do 1 h w RT. 
	Uwaga: Na tym etapie można dodać związki farmakologiczne.</li>
	<li>Przygotuj szklane laminki, pokryj je poli-ʟ-lizyną i pozostaw do wyschnięcia na płycie grzewczej ustawionej na 70 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu obciążania barwnikami wapniowymi nanieś 100 µl roztworu zawierającego kłębuszki na pokryte poli-ʟ-lizyną laminki i pozostaw je na około 5 min, aby przylgnęły do powierzchni. Zamocuj laminki z przytwierdzonymi kłębuszkami w komorze obrazowania i przemyj roztworem kąpielowym (zawierającym (w mM): 145 NaCl, 2 CaCl2, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) z przepływem 3 ml/min, aby usunąć nieprzylgnięte kłębuszki i pozostałe barwniki.</li>
	<li>Ustaw konfokalny skaningowy mikroskop laserowy na długość fali wzbudzenia 488 nm oraz filtry emisyjne (odpowiednio 525/25 i 650/25 nm dla Fluo-4 i Fura Red). W oprogramowaniu do obrazowania ustaw pożądaną częstotliwość i rozdzielczość.</li>
	<li>Zlokalizuj kłębuszki w świetle przechodzącym, a następnie włącz detekcję sygnału fluorescencji. Dostosuj intensywność lasera dla każdego barwnika, aby uniknąć nasycenia sygnału. Wybierz płaszczyznę ogniskową z podocytami, które przylegają bezpośrednio do szkła. Minimalizuje to efekt spowodowany skurczem kłębuszka w odpowiedzi na aplikację leku. Upewnij się, że wybrany kłębuszek jest dobrze przylegający do szkła.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie wybranej płaszczyzny ogniskowej (wykonuj obrazy 512 x 512 z częstotliwością ustawioną na 4 s, aby zwizualizować szybkie zmiany przejściowe Ca2+; użyj obiektywu 60X/NA 1,4 lub podobnego dla uzyskania obrazu o wysokiej rozdzielczości), podaj badane leki i zarejestruj odpowiedź.
	<ol>
		<li>Wybierz pożądaną płaszczyznę ogniskową (jak najbliżej powierzchni szkła, aby zapewnić obrazowanie podocytów na powierzchni kłębuszka). Sprawdź intensywność fluorescencji w kanałach Fluo4 i FuraRed i upewnij się, że kłębuszek jest wyraźnie widoczny w świetle przechodzącym.</li>
		<li>Rozpocznij obrazowanie. Przed aplikacją jakichkolwiek leków zarejestruj co najmniej 1 min fluorescencji bazowej, aby upewnić się, że sygnał jest stabilny (brak nagłych skoków lub zanikania sygnału).</li>
		<li>Podaj odpowiednie leki za pomocą mikropipety; zachowaj ostrożność i upewnij się, że lek mógł się odpowiednio rozprzestrzenić i dotrzeć do kłębuszka. W razie potrzeby delikatnie wymieszaj roztwór kąpielowy, monitoruj wybraną płaszczyznę ogniskową i sprawdź, czy nie wyszła ona z ostrości w wyniku aplikacji leku.</li>
		<li>Zarejestruj zmiany intensywności fluorescencji dla sygnałów Fluo4 i FuraRed. Upewnij się, że rejestracja jest wystarczająco długa, czekając, aż sygnał osiągnie poziom plateau lub osiągnie szczyt, a następnie powróci do poziomu bazowego. W razie potrzeby wymień roztwór lub dodaj inne leki.</li>
		<li>Zatrzymaj rejestrację i zapisz plik w natywnym formacie oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza obrazów dla pomiarów wapnia
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę obrazu przy użyciu otwartego oprogramowania ImageJ wyposażonego w wtyczkę ND Utility, która umożliwia importowanie obrazów w natywnym formacie ND2.</li>
	<li>Zaimportuj sekwencję obrazów; pamiętaj o rozdzieleniu kanałów i zastosowaniu trybu skali szarości hyperstack.</li>
	<li>W oprogramowaniu ImageJ przejdź ścieżką Analyze → Tools → ROI manager, aby otworzyć okno menedżera obszarów zainteresowania (ROI manager). Wybierz kilka obszarów zainteresowania (podocyty), korzystając z owalnego narzędzia zaznaczania oraz funkcji „Add (t)” w ROI Managerze. Jako ostatni ROI zaznacz obszar w tle; zapisz wybrane ROI (More → Save).</li>
	<li>Zaznacz okno zawierające kanał wybrany do analizy. W ROI Managerze użyj funkcji More → Multi Measure, w wyskakującym oknie dialogowym zaznacz pole „one row per slice”, a następnie kliknij OK. Wyniki zostaną wyświetlone w formacie, który można skonfigurować w oknie Results: w opcji menu Results → Set Measurements zaznacz „Mean gray value” i oblicz wartości intensywności pikseli dla każdego ROI, które zostaną wyświetlone w oknie Results w oddzielnych kolumnach dla każdego ROI.</li>
	<li>Skopiuj zmierzone wartości intensywności ROI dla każdego kanału (Fluo-4 i Fura Red) do preferowanego oprogramowania do analizy danych; od każdego punktu danych odejmij wartości intensywności tła.</li>
	<li>Dla każdego punktu czasowego oblicz stosunek intensywności kanałów Fluo-4 do Fura Red. Przedstaw zmiany transientów Ca2+ w czasie na wykresie punktowym lub liniowym dla każdego ROI. Oblicz wartości Mean/SE dla wybranych kłębuszków. 
	Uwaga: Kolumna czasu powinna być ustawiona zgodnie z częstotliwością obrazowania wybraną w punkcie 4.5.</li>
</ol>
6. Obliczenia wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia z wykorzystaniem sygnału fluorescencji Fluo-4
<ol>
	<li>Pobrać próbkę kłębuszków i przeprowadzić protokół eksperymentalny do kroku 4.7. Po zarejestrowaniu fluorescencji tła dodać jonomycynę (stężenie końcowe w komorze kąpieli powinno wynosić 10 µM) do roztworu kąpieli i zarejestrować wzrost intensywności fluorescencji. Gdy intensywność osiągnie maksimum i rozpocznie się spadek, dodać MnCl2 (stężenie końcowe powinno wynosić 5 mM), aby wygasić fluorescencję8.</li>
	<li>Przeanalizować dane uzyskane w punkcie 6.1. Za pomocą preferowanego oprogramowania analitycznego skopiować wartości intensywności ROI sygnału Fluo-4 uzyskane zgodnie z protokołem opisanym w punktach 5.1 - 5.5.</li>
	<li>Obliczyć wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia (w nM) w podocycie odpowiadającym ROI, korzystając ze wzoru: 
	<img alt="Równanie stężenia jonów wapnia [Ca²⁺] w biochemii, wzór na obliczanie wolnych jonów." src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie Kd to określona wcześniej stała dysocjacji dla Fluo-4 (345 nM), F to intensywność w punkcie czasowym, dla którego obliczane jest stężenie wapnia (linia bazowa), a Fmin i Fmax to odpowiednio wartości intensywności w punkcie maksymalnego obciążenia wapniem (po zastosowaniu jonomycyny) oraz po wygaszeniu fluorescencji (za pomocą MnCl2) (patrz Rycina 3).</li>
</ol>

<ol><li>Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+nephrotic+syndrome%3A+connecting+molecular+genetics+to+podocyte+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).</li>
<li>Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+glomerular+barrier+and+mechanisms+of+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria.</a> Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).</li>
<li>Patrakka, J., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+podocytes+in+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of podocytes in proteinuria.</a> Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+albumin+reflection+coefficient+with+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).</li>
<li>Gloy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+depolarizes+podocytes+in+the+intact+glomerulus+of+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat.</a> J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).</li>
<li>Nitschke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+the+intracellular+calcium+activity+in+podocytes+of+the+intact+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus.</a> Kidney Int. 57, 41-49 (2000).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+analysis+of+TRPC+channels+in+the+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+heavy+metal+ions+perturb+fura-2+measurements+of+basal+and+hormone-evoked+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals.</a> Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).</li>
<li>Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mineralocorticoid+and+angiotensin+II+receptor+blockers+on+proteinuria+and+glomerular+podocyte+protein+expression+in+a+model+of+minimal+change+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+%28Carlton%29%22%5BJournal%5D)">Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome.</a> Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Abramowitz, J., Birnbaumer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+canonical+transient+receptor+potential+channels%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels).</a> FASEB J. 23, 297-328 (2009).</li>
<li>Heeringa, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+TRPC6+mutation+that+causes+childhood+FSGS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS.</a> PLoS ONE. 4, e7771(2009).</li>
<li>Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+role+of+TRPC6+in+vitamin+D+ameliorating+podocyte+injury+in+STZ-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats.</a> Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).</li>
<li>Bohrer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+puromycin-induced+defects+in+the+transglomerular+passage+of+water+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules.</a> J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).</li>
<li>Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+charge+and+size+selectivity+barrier+of+the+glomerular+filter+in+aminonucleoside+nephrosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats.</a> Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).</li>
<li>Schiessl, I. M., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+AT2+receptor+activation+attenuates+AT1+receptor-induced+increases+in+the+glomerular+filtration+of+albumin%3A+a+multiphoton+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+acutely+inhibit+TRPC+channels+in+freshly+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).</li>
<li>Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+wave+of+tubuloglomerular+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium wave of tubuloglomerular feedback.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).</li>
<li>Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+directly+stimulates+ENaC+activity+in+the+cortical+collecting+duct+via+AT%281%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+the+P2+receptors+profile+in+the+podocytes+of+the+freshly+isolated+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+has+acute+effects+on+TRPC6+channels+in+podocytes+of+freshly+isolated+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli.</a> Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).</li>
<li>Schaldecker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+TRPC5+ion+channel+protects+the+kidney+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter.</a> J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).</li>
<li>Roshanravan, H., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+acting+through+P2Y+receptors+causes+activation+of+podocyte+TRPC6+channels%3A+role+of+podocin+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).</li>
<li>Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+activation+of+TRPC6+channels+in+rat+podocytes+requires+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species.</a> J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj podejście pozwala na analizę obchodzenia się z wapniem przez podocyty kłębuszków nerkowych gryzoni. Technika ta pozwala na zastosowanie jednokanałowej elektrofizjologii patch-clamp i fluorescencji ratiometrycznego obrazowania konfokalnego. Jednak oba podejścia mogą być stosowane oddzielnie, samodzielnie. Proponowany protokół składa się z kilku stosunkowo prostych kroków, w tym: 1) płukanie nerek; 2) izolacja kłębuszków nerkowych przez przesiewanie różnicowe; 3) wykonywanie eksperymentów elektrofizjologiczny...

Nerki utrzymują równowagę homeostatyczną dla różnych substancji i regulują objętość krwi w sposób, który określa całkowite ciśnienie krwi. Zaburzenia filtracji, wchłaniania zwrotnego lub wydzielania nerek prowadzą do lub towarzyszą stanom patologicznym, począwszy od nadciśnienia tętniczego lub niedociśnienia, a skończywszy na schyłkowej niewydolności nerek, która ostatecznie wymaga przeszczepu nerki. Nerkowa jednostka filtrująca (kłębuszek nerkowy) składa się z trzech warstw – śródbłonka naczyń włosowatych, błony podstawnej i jednokomórkowej warstwy komórek nabłonkowych – podocytów, które odgrywają główną rolę w utrzymaniu integralności i funkcji błony szczelinowej1. Dysfunkcja permselektywnego filtra kłębuszkowego powoduje utratę makrocząsteczek z moczem, taką jak białkomocz. Różne czynniki mogą wpływać na strukturę podocytów i ich procesy stóp, które decydują o integralności bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych.
Podocyty są zaangażowane w utrzymanie funkcji filtracji kłębuszków nerkowych. Ustalono, że niewłaściwe obchodzenie się z wapniem przez podocyty prowadzi do uszkodzenia komórek i odgrywa ważną rolę w progresji różnych postaci nefropatii2,3. W związku z tym opracowanie modelu pozwalającego na bezpośredni pomiar wewnątrzkomórkowych zmian stężenia wapnia będzie miało zasadnicze znaczenie dla badań nad funkcją podocytów. Izolowane kłębuszki nerkowe były wcześniej wykorzystywane w licznych badaniach, w tym w pomiarze zmian współczynnika odbicia albuminy4 oraz ocenie integralnych prądów komórkowych w pomiarach elektrofizjologicznych klamer krosowychcałej komórki 5,6. W niniejszej pracy opisano protokół, który pozwala badaczowi mierzyć wewnątrzkomórkowe zmiany stężenia wapnia w odpowiedzi na zastosowanie środków farmakologicznych, oszacować podstawowe poziomy wapnia w komórkach oraz ocenić aktywność poszczególnych kanałów wapniowych. Do określenia zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w obrębie podocytów i aktywności kanału wykorzystano pomiary ratometryczne stężenia wapnia oraz elektrofizjologię patch-clamp.

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l w DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronicowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>roztwór</td></tr><tr><td>Ionomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Rotator do probówek</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>Niemcy</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop odwrócony Nikon</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>Wzbudzanie laserowe 488 nm. Filtry emisyjne 500-550 nm oraz 570-620 nm</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>Szybko przykrywowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>związek silikonowy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>Komora rejestracyjna/perfuzyjna</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz do patch-clampu</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>System Axon Digidata&amp;reg;</td></tr><tr><td>Filtr dolnoprzepustowy</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8-biegunowy filtr Bessela</td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemianowe</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Wytwornica mikropipet typu płomieniowego/Browna</td></tr><tr><td>Mikrokuźnia</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japonia</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Stół izolujący mikrowibracje</td><td>TMC</td><td></td><td>wyposażony w klatkę Faradaya</td></tr><tr><td>Wielokanałowy system perfuzyjny z zaworami</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Komora rejestracyjna/perfuzyjna</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Nikardypina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoksyna</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas niflumowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek TEA</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>bez antybiotyków</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30% roztwór albuminy</td></tr><tr><td>Stół chirurgiczny z kontrolą temperatury</td><td>MCW core</td><td></td><td>dla gryzoni</td></tr><tr><td>Sita stalowe:</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>Sito o oczkach 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>ekran dla CD-1</td></tr><tr><td>Mikroskop binokularowy</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop binokularowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzyjny oparty na pompie strzykawkowej</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewody polietylenowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie izofluranem</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Inne podstawowe odczynniki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocyty (komórki nabłonka kłębuszków nerkowych) są znane z regulowania przepuszczalności kłębuszków nerkowych i utrzymywania struktury kłębuszków nerkowych; kluczowa rola tych komórek w patogenezie różnych chorób nerek została ustalona, ponieważ uszkodzenie podocytów prowadzi do białkomoczu i zaniku procesu łapowego. Wcześniej informowano, że różne czynniki endogenne mogą powodować dramatyczne przeciążenie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2 + w podocytach, prawdopodobnie prowadząc do albuminurii, a to prawdopodobnie dzieje się za pośrednictwem kanałów jonowych przewodzących wapń. Dlatego ważne okazało się zbadanie obchodzenia się z wapniem w podocytach zarówno w normalnych warunkach, jak i w różnych stanach patologicznych. Jednak dostępne podejścia eksperymentalne pozostały nieco ograniczone do komórek hodowanych i transfekowanych. Chociaż stanowią one dobry podstawowy model dla takich badań, są one zasadniczo ekstrahowane z rodzimego środowiska kłębuszków nerkowych. W tym miejscu opisujemy metodologię badania podocytów jako części świeżo wyizolowanych całych kłębuszków nerkowych. Preparat ten zachowuje potencjał funkcjonalny podocytów, które są nadal przyczepione do naczyń włosowatych; Dlatego podocyty pozostają w środowisku, które chroni główne części aparatu filtracyjnego kłębuszków nerkowych. Niniejszy manuskrypt omawia dwa podejścia eksperymentalne, które pozwalają na 1) wykrywanie zmian stężenia wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą ratiometrycznej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz 2) rejestrację aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych. Metodologie te wykorzystują zalety rodzimego środowiska kłębuszków nerkowych, które umożliwiają naukowcom rozwiązanie ostrych zmian w wewnątrzkomórkowym obchodzeniu się z wapniem w odpowiedzi na zastosowanie różnych czynników, pomiar podstawowego stężenia wapnia w komórkach (na przykład w celu oceny postępu choroby) oraz ocenę i manipulowanie przewodnictwem wapnia na poziomie pojedynczych kanałów jonowych.

W niniejszej pracy zajęliśmy się problemem pomiaru gwałtownych zmian poziomu wapnia w podocytach. Rysunek 1 przedstawia schematyczny opis protokołu eksperymentalnego opracowanego w celu przeprowadzenia wysokorozdzielczego obrazowania konfokalnego fluorescencyjnego żywych komórek oraz rejestracji aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębków nerkowych gryzoni. W skrócie, po znieczuleniu szczura, nerki należy przepłukać roztworem PBS w celu usunięcia krwi. Następnie ner...

Zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia w podocytach są jednym z najważniejszych sposobów kontrolowania funkcji filtracji kłębuszków nerkowych. W tym miejscu wyjaśniamy podejście o wysokiej przepustowości, które umożliwia wykrywanie obchodzenia się z wapniem w czasie rzeczywistym i aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych.

Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w odpowiedzi na czynniki farmakologiczne. Pozwala to na oszacowanie podstawowego poziomu wapnia oraz ocenę aktywności poszczególnych kanałów w podocytach w obrębie całego, świeżo wyizolowanego kłębuszka nerkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie krwi z nerek szczura za pomocą płukania przez aortę brzuszną.Następnie pobiera się nerki, izoluje korę nerkową i rozdrabnia ją za pomocą żyletki. W trzecim kroku kłębki nerkowe są izolowane poprzez różnicowanie. Następnie wyizolowane, odcięte kłębki można poddać eksperymentom elektrofizjologicznym lub napełnić barwnikami fluorescencyjnymi i poddać pomiarom stężenia wapnia za pomocą mikroskopii konfokalnej.W rezultacie procedury te umożliwiają badaczom analizę gwałtownych zmian w wewnątrzkomórkowym gospodarowaniu wapniem w odpowiedzi na podanie różnych czynników oraz ocenę i manipulację przewodnictwem wapniowym na poziomie pojedynczych kanałów jonowych. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że pozwala ona na badanie podocytów jako części całego izolowanego kłębka nerkowego. Nasza preparatyka zachowuje potencjał funkcjonalny podocytów.Pozostają one przytwierdzone do naczyń kapilarnych i uczestniczą w homeostazie środowiska, które w rzeczywistości może zachowywać główne części aparatu filtracyjnego kłębuszków. Zastosowanie tej techniki rozszerza nasze badania farmakologiczne. W stanach prawidłowych i patologicznych mechanizm gospodarki wapniowej w podocytach odgrywa istotną rolę regulacyjną w rozwoju i zapobieganiu powikłaniom nerkowym w takich chorobach jak nefropatia cukrzycowa, włóknienie odcinkowe i ogniskowe kłębuszków czy nadciśnienie tętnicze. Duże znaczenie ma obserwacja odpowiedzi napływu wapnia w tych komórkach na leki, co można łatwo poddać analizie przesiewowej.W tym przygotowaniu VLA Hunka zademonstruje, jak płukać nerkę przed poniższymi procedurami. Przedstawię izolację kłębuszków i elektrofizjologię z użyciem zacisku V, a dr GaN przeprowadzi Państwa przez konfokalną obrazowanie wapnia. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść zanestezjowanego szczura na stole chirurgicznym z kontrolą temperatury. Pod mikroskopem wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha, aby odsłonić żyłę CVA oraz aortę.Następnie załóż więzadła wokół tętnicy trzewnej, tętnicy krezkowej górnej oraz aorty brzusznej powyżej nich. Przeprowadź tępe rozdzielenie tkanek aorty brzusznej poniżej tętnic nerkowych. Następnie załóż wokół niej dwie podwiązki, ale nie zaciskaj ich.Zaciśnij aortę powyżej podwiązań i zawiąż dolną nitkę. Następnie przeprowadź przez aortę cewnik z rurki polietylenowej połączonej z pompą strzykawkową wypełnioną PBS poniżej zacisku i przymocuj cewnik drugim podwiązaniem. Następnie zdejmij zacisk i wykonaj podwiązania.Przeciąć tętnice trzewne i krezkowe. Przesyłać do aorty schłodzony wcześniej PBS przez trzy minuty z prędkością sześciu mililitrów na minutę. Jednocześnie wykonać nacięcie w żyle głównej dolnej w pobliżu żył nerkowych, aby zmniejszyć ciśnienie.Po trzech minutach przerwać perfuzję, wyciąć i zabezpieczyć nerki. Umieścić je w roztworze PBS na lodzie. Następnie przygotować 30 ml świeżego 5% BSA w medium RPMI 1640.Za pomocą żyletki i nożyczek wyizoluj korę obu nerek, a następnie rozdrobnij je do uzyskania homogennej masy. Następnie przeciśnij rozdrobnioną tkankę przez stalowe sito o oczkach 100 mesh, które uprzednio namoczono w 5% roztworze P-S-A-R-P-M-I. Zbierz przefiltrowany materiał i przepuść go przez sito o oczkach 140 mesh.Następnie przefiltruj zebraną frakcję przepływową z sita o oczkach 140 µm, używając wcześniej namoczonego sita o oczkach 200 µm. Odrzuć filtrat, przemyj górne sito od 10 do 15 mililitrów przygotowanego roztworu B-S-A-R-P-M-I i zbierz kłębki nerkowe z górnej części sita. Następnie umieść roztwór B-S-A-R-P-M-I zawierający kłębki nerkowe w probówce typu Eppendorf o pojemności 15 mililitrów i pozostaw kłębki nerkowe do osadzenia się na dnie probówki przez maksymalnie 20 minut.W tej procedurze należy pokryć szkiełka dekowe o wymiarach 5 na 5 milimetrów poli-L-lizyną o masie cząsteczkowej od 70 000 do 150 000 i wysuszyć je na płycie grzewczej. Następnie należy ogrzać roztwory eksperymentalne do temperatury pokojowej, a potem napełnić komorę i pipetę do techniki patch-clamp. Delikatnie wymieszaj roztwór zawierający kłębki naczyniowe. Następnie nanieś około 50 µL tego roztworu na każde szkiełko dekowe pokryte poli-L-lizyną.Następnie przenieś szklane chipy z kłębuszkami do komory patch-clamp, wcześniej napełnionej roztworem Beth. Przepłucz komorę z przepływem 3 ml/min przez jedną minutę, aby usunąć wszystkie nieprzytwierdzone kłębuszki, przed przystąpieniem do konwencjonalnego pomiaru patch-clamp w konfiguracji cell-attached.Następnie należy przenieść 500 µL frakcji kłębków nerkowych do każdej probówki stożkowej o pojemności 0,5 ml i dodać barwniki wapniowe Pure Red AM oraz Fluo-4 AM. Następnie probówki należy umieścić na wytrząsarku obrotowej do jednej godziny w temperaturze pokojowej. W tym czasie należy przygotować szkiełka nakrywki z polilizyną i pozostawić je do wyschnięcia na płytce grzejnej w temperaturze 70 °C. Po zakończeniu inkubacji z barwnikami wapniowymi, należy nanieść 100 µL roztworu zawierającego kłębki nerkowe na pokryte polilizyną szkiełka nakrywki i pozostawić je na powierzchni przez około pięć minut.Następnie zamocuj szkiełka podstawowe z przytwierdzonymi kłębuszkami w komorze obrazującej i perfunduj je roztworem kąpielowym z prędkością 3 ml/min, aby usunąć nieprzytwierdzone kłębuszki oraz pozostałe barwniki. Po tym ustaw długość fali wzbudzenia konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego na 488 nm. Następnie w oprogramowaniu do obrazowania ustaw pożądaną częstotliwość i rozdzielczość.Następnie zlokalizuj kłębki nerkowe w świetle transmitowanym. Następnie włącz detekcję sygnału fluorescencyjnego. Po tym wybierz pożądaną płaszczyznę ogniskowania i sprawdź intensywność fluorescencji na kanałach flu oh four oraz firo red.Upewnij się, że kłębek nerkowy jest wyraźnie widoczny w świetle przechodzącym. Następnie zarejestruj zmiany intensywności fluorescencji dla sygnałów flu oh four oraz furor red. Aby zaimportować sekwencję obrazów, rozdziel kanały i użyj trybu skali szarości dla hiperstosu (hyper stack).W oprogramowaniu Image J otwórz okno menedżera ROI, przechodząc przez ścieżkę Analyze tools, ROI Manager. Wybierz jeden lub więcej obszarów zainteresowania, korzystając z narzędzia owalnego zaznaczenia oraz funkcji Add T w menedżerze ROI. Następnie zaznacz obszar w tle i zapisz wybrane ROI.Następnie zaznacz pole „one row per slice” w oknie dialogowym i kliknij „OK” w opcjach menu wyników. Ustaw pomiary. Wybierz „mean gray value” i oblicz wartości intensywności pikseli dla każdego ROI, które zostaną wyświetlone w oknie wyników w oddzielnych kolumnach.Następnie dla każdego ROI skopiuj zmierzone wartości intensywności ROI dla każdego kanału do preferowanego oprogramowania do analizy danych i od każdego punktu danych dla każdego punktu czasowego odejmij wartości intensywności tła. Oblicz stosunek intensywności kanałów flu oh four do URA red, a następnie wykreśl zmiany w czasie przejściowych zmian poziomu wapnia dla każdego ROI. Na tym obrazie przedstawiono pipetę do patch-clamp przyczepioną do ciała utlenionego na powierzchni kłębka szczura.Podczas rejestracji elektrofizjologicznej w prawym dolnym rogu obrazu widoczna jest część otoczkowanego kłębuszka. Przedstawiono reprezentatywny zapis prądu dla aktywności kanałów typu TRP z komórki podocytu w konfiguracji cell-attached, służący do pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Kłębuszki zostały załadowane barwnikiem Fluo-4 AM w celu znakowania wapnia wewnątrzkomórkowego.Ten film ilustruje wpływ CIN oraz chlorku manganu na napływ wapnia do kłębuszków. Ten wykres ilościowo przedstawia zmiany intensywności sygnału flu-4 zarejestrowane z pojedynczego podocytu w odpowiedzi na CIN oraz chlorek manganu. Zgodnie z oczekiwaniami, CIN powoduje maksymalną fluorescencję, a chlorek manganu gasi barwnik, co skutkuje najniższą intensywnością fluorescencji.Zastosowanie tych leków pozwala badaczowi na późniejsze określenie dokładnego stężenia wapnia wewnątrz komórki. Niniejszy film demonstruje wpływ 10 µM TP na stężenie wapnia w kłębuszkach. Należy zauważyć wzrost zielonej fluorescencji fluo-4 oraz spadek czerwonej fluorescencji fu-red, co wskazuje na wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia.Technika ta oferuje wyjątkową możliwość monitorowania zmian w napływie wapnia na poziomie pojedynczego kanału jonowego i poszczególnych komórek po zastosowaniu leków lub innych manipulacjach. Tym samym podejście to stanowi bardzo potężne narzędzie, biorąc pod uwagę wiele dostępnych genetycznie modyfikowanych modeli gryzoni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzać pomiary wapniowe w podocytach, a także eksperymenty elektrofizjologiczne z użyciem techniki clamp, stosowane łącznie lub oddzielnie.Techniki te zapewniają szczegółowy i mechanistyczny wgląd w regulację gospodarki wapniowej w podocytach w warunkach prawidłowych i patologicznych.

single-channel-analysis-calcium-imaging-podocytes-freshly-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Celem tego protokołu jest wyizolowanie nienaruszonych obszarów rozrusznika miednicy nerkowej myszy za pomocą sekcji wibratomowej. Skrawki te można następnie wykorzystać do obrazowania Ca2 + in situ w celu wyjaśnienia przejściowych właściwości Ca2 + komórek rozrusznika serca i innych komórek śródmiąższowych w warstwach wibratomu.

Izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika serca miednicy nerkowej myszy poprzez wycięcie wibratomem

Przedstawiona metoda umożliwia wizualizację znakowanych fluorescencyjnie białek komórkowych za pomocą mikroskopii ekspansywnej, co prowadzi do rozdzielczości 70 nm na konwencjonalnym mikroskopie.

Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Obrazowanie wapnia w komórkach jest wszechstronną metodologią do badania dynamicznej sygnalizacji pojedynczych komórek, na mieszanych populacjach w kulturze, a nawet na przebudzonych zwierzętach, w oparciu o ekspresję przepuszczalnych dla wapnia kanałów/receptorów, które dają unikalne sygnatury funkcjonalne.

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj metodę pomiaru stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych szczura. Technika umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym i badanie aktywności pojedynczych kanałów jonowych.

Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Przeglądaj więcej filmów