Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w odpowiedzi na czynniki farmakologiczne. Pozwala to na oszacowanie podstawowego poziomu wapnia oraz ocenę aktywności poszczególnych kanałów w podocytach w obrębie całego, świeżo wyizolowanego kłębuszka nerkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie krwi z nerek szczura za pomocą płukania przez aortę brzuszną.

Następnie pobiera się nerki, izoluje korę nerkową i rozdrabnia ją za pomocą żyletki. W trzecim kroku kłębki nerkowe są izolowane poprzez różnicowanie. Następnie wyizolowane, odcięte kłębki można poddać eksperymentom elektrofizjologicznym lub napełnić barwnikami fluorescencyjnymi i poddać pomiarom stężenia wapnia za pomocą mikroskopii konfokalnej.

W rezultacie procedury te umożliwiają badaczom analizę gwałtownych zmian w wewnątrzkomórkowym gospodarowaniu wapniem w odpowiedzi na podanie różnych czynników oraz ocenę i manipulację przewodnictwem wapniowym na poziomie pojedynczych kanałów jonowych. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że pozwala ona na badanie podocytów jako części całego izolowanego kłębka nerkowego. Nasza preparatyka zachowuje potencjał funkcjonalny podocytów.

Pozostają one przytwierdzone do naczyń kapilarnych i uczestniczą w homeostazie środowiska, które w rzeczywistości może zachowywać główne części aparatu filtracyjnego kłębuszków. Zastosowanie tej techniki rozszerza nasze badania farmakologiczne. W stanach prawidłowych i patologicznych mechanizm gospodarki wapniowej w podocytach odgrywa istotną rolę regulacyjną w rozwoju i zapobieganiu powikłaniom nerkowym w takich chorobach jak nefropatia cukrzycowa, włóknienie odcinkowe i ogniskowe kłębuszków czy nadciśnienie tętnicze. Duże znaczenie ma obserwacja odpowiedzi napływu wapnia w tych komórkach na leki, co można łatwo poddać analizie przesiewowej.

W tym przygotowaniu VLA Hunka zademonstruje, jak płukać nerkę przed poniższymi procedurami. Przedstawię izolację kłębuszków i elektrofizjologię z użyciem zacisku V, a dr GaN przeprowadzi Państwa przez konfokalną obrazowanie wapnia. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść zanestezjowanego szczura na stole chirurgicznym z kontrolą temperatury. Pod mikroskopem wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha, aby odsłonić żyłę CVA oraz aortę.

Następnie załóż więzadła wokół tętnicy trzewnej, tętnicy krezkowej górnej oraz aorty brzusznej powyżej nich. Przeprowadź tępe rozdzielenie tkanek aorty brzusznej poniżej tętnic nerkowych. Następnie załóż wokół niej dwie podwiązki, ale nie zaciskaj ich.

Zaciśnij aortę powyżej podwiązań i zawiąż dolną nitkę. Następnie przeprowadź przez aortę cewnik z rurki polietylenowej połączonej z pompą strzykawkową wypełnioną PBS poniżej zacisku i przymocuj cewnik drugim podwiązaniem. Następnie zdejmij zacisk i wykonaj podwiązania.

Przeciąć tętnice trzewne i krezkowe. Przesyłać do aorty schłodzony wcześniej PBS przez trzy minuty z prędkością sześciu mililitrów na minutę. Jednocześnie wykonać nacięcie w żyle głównej dolnej w pobliżu żył nerkowych, aby zmniejszyć ciśnienie.

Po trzech minutach przerwać perfuzję, wyciąć i zabezpieczyć nerki. Umieścić je w roztworze PBS na lodzie. Następnie przygotować 30 ml świeżego 5% BSA w medium RPMI 1640.

Za pomocą żyletki i nożyczek wyizoluj korę obu nerek, a następnie rozdrobnij je do uzyskania homogennej masy. Następnie przeciśnij rozdrobnioną tkankę przez stalowe sito o oczkach 100 mesh, które uprzednio namoczono w 5% roztworze P-S-A-R-P-M-I. Zbierz przefiltrowany materiał i przepuść go przez sito o oczkach 140 mesh.

Następnie przefiltruj zebraną frakcję przepływową z sita o oczkach 140 µm, używając wcześniej namoczonego sita o oczkach 200 µm. Odrzuć filtrat, przemyj górne sito od 10 do 15 mililitrów przygotowanego roztworu B-S-A-R-P-M-I i zbierz kłębki nerkowe z górnej części sita. Następnie umieść roztwór B-S-A-R-P-M-I zawierający kłębki nerkowe w probówce typu Eppendorf o pojemności 15 mililitrów i pozostaw kłębki nerkowe do osadzenia się na dnie probówki przez maksymalnie 20 minut.

W tej procedurze należy pokryć szkiełka dekowe o wymiarach 5 na 5 milimetrów poli-L-lizyną o masie cząsteczkowej od 70 000 do 150 000 i wysuszyć je na płycie grzewczej. Następnie należy ogrzać roztwory eksperymentalne do temperatury pokojowej, a potem napełnić komorę i pipetę do techniki patch-clamp. Delikatnie wymieszaj roztwór zawierający kłębki naczyniowe. Następnie nanieś około 50 µL tego roztworu na każde szkiełko dekowe pokryte poli-L-lizyną.

Następnie przenieś szklane chipy z kłębuszkami do komory patch-clamp, wcześniej napełnionej roztworem Beth. Przepłucz komorę z przepływem 3 ml/min przez jedną minutę, aby usunąć wszystkie nieprzytwierdzone kłębuszki, przed przystąpieniem do konwencjonalnego pomiaru patch-clamp w konfiguracji cell-attached.

Następnie należy przenieść 500 µL frakcji kłębków nerkowych do każdej probówki stożkowej o pojemności 0,5 ml i dodać barwniki wapniowe Pure Red AM oraz Fluo-4 AM. Następnie probówki należy umieścić na wytrząsarku obrotowej do jednej godziny w temperaturze pokojowej. W tym czasie należy przygotować szkiełka nakrywki z polilizyną i pozostawić je do wyschnięcia na płytce grzejnej w temperaturze 70 °C. Po zakończeniu inkubacji z barwnikami wapniowymi, należy nanieść 100 µL roztworu zawierającego kłębki nerkowe na pokryte polilizyną szkiełka nakrywki i pozostawić je na powierzchni przez około pięć minut.

Następnie zamocuj szkiełka podstawowe z przytwierdzonymi kłębuszkami w komorze obrazującej i perfunduj je roztworem kąpielowym z prędkością 3 ml/min, aby usunąć nieprzytwierdzone kłębuszki oraz pozostałe barwniki. Po tym ustaw długość fali wzbudzenia konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego na 488 nm. Następnie w oprogramowaniu do obrazowania ustaw pożądaną częstotliwość i rozdzielczość.

Następnie zlokalizuj kłębki nerkowe w świetle transmitowanym. Następnie włącz detekcję sygnału fluorescencyjnego. Po tym wybierz pożądaną płaszczyznę ogniskowania i sprawdź intensywność fluorescencji na kanałach flu oh four oraz firo red.

Upewnij się, że kłębek nerkowy jest wyraźnie widoczny w świetle przechodzącym. Następnie zarejestruj zmiany intensywności fluorescencji dla sygnałów flu oh four oraz furor red. Aby zaimportować sekwencję obrazów, rozdziel kanały i użyj trybu skali szarości dla hiperstosu (hyper stack).

W oprogramowaniu Image J otwórz okno menedżera ROI, przechodząc przez ścieżkę Analyze tools, ROI Manager. Wybierz jeden lub więcej obszarów zainteresowania, korzystając z narzędzia owalnego zaznaczenia oraz funkcji Add T w menedżerze ROI. Następnie zaznacz obszar w tle i zapisz wybrane ROI.

Następnie zaznacz pole „one row per slice” w oknie dialogowym i kliknij „OK” w opcjach menu wyników. Ustaw pomiary. Wybierz „mean gray value” i oblicz wartości intensywności pikseli dla każdego ROI, które zostaną wyświetlone w oknie wyników w oddzielnych kolumnach.

Następnie dla każdego ROI skopiuj zmierzone wartości intensywności ROI dla każdego kanału do preferowanego oprogramowania do analizy danych i od każdego punktu danych dla każdego punktu czasowego odejmij wartości intensywności tła. Oblicz stosunek intensywności kanałów flu oh four do URA red, a następnie wykreśl zmiany w czasie przejściowych zmian poziomu wapnia dla każdego ROI. Na tym obrazie przedstawiono pipetę do patch-clamp przyczepioną do ciała utlenionego na powierzchni kłębka szczura.

Podczas rejestracji elektrofizjologicznej w prawym dolnym rogu obrazu widoczna jest część otoczkowanego kłębuszka. Przedstawiono reprezentatywny zapis prądu dla aktywności kanałów typu TRP z komórki podocytu w konfiguracji cell-attached, służący do pomiaru wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Kłębuszki zostały załadowane barwnikiem Fluo-4 AM w celu znakowania wapnia wewnątrzkomórkowego.

Ten film ilustruje wpływ CIN oraz chlorku manganu na napływ wapnia do kłębuszków. Ten wykres ilościowo przedstawia zmiany intensywności sygnału flu-4 zarejestrowane z pojedynczego podocytu w odpowiedzi na CIN oraz chlorek manganu. Zgodnie z oczekiwaniami, CIN powoduje maksymalną fluorescencję, a chlorek manganu gasi barwnik, co skutkuje najniższą intensywnością fluorescencji.

Zastosowanie tych leków pozwala badaczowi na późniejsze określenie dokładnego stężenia wapnia wewnątrz komórki. Niniejszy film demonstruje wpływ 10 µM TP na stężenie wapnia w kłębuszkach. Należy zauważyć wzrost zielonej fluorescencji fluo-4 oraz spadek czerwonej fluorescencji fu-red, co wskazuje na wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia.

Technika ta oferuje wyjątkową możliwość monitorowania zmian w napływie wapnia na poziomie pojedynczego kanału jonowego i poszczególnych komórek po zastosowaniu leków lub innych manipulacjach. Tym samym podejście to stanowi bardzo potężne narzędzie, biorąc pod uwagę wiele dostępnych genetycznie modyfikowanych modeli gryzoni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzać pomiary wapniowe w podocytach, a także eksperymenty elektrofizjologiczne z użyciem techniki clamp, stosowane łącznie lub oddzielnie.

Techniki te zapewniają szczegółowy i mechanistyczny wgląd w regulację gospodarki wapniowej w podocytach w warunkach prawidłowych i patologicznych.