Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ex vivo obserwacja bicia Motr append CLIA znajdującego się w komorach mózgu myszy. Osiąga się to poprzez pobranie całego mózgu, a następnie wykonanie cienkich przekrojów przez komory boczne. Następnie skrawki inkubuje się w specjalnej płytce z szklanym dnem zawierającej pożywkę z wysoką zawartością glukozy w temperaturze ciała, aby utrzymać żywotność tkanki podczas eksperymentu.

Na koniec ruchy rzęsek są rejestrowane przy użyciu mikroskopu kontrastowego z interferencją różnicową o wysokiej rozdzielczości. Ostatecznie strukturę i lokalizację białek w rzęskach można zwizualizować za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszą dotychczasową metodą jest to, że jest to pierwsza technika pozwalająca na klasyfikację komórek naskórka na trzy odrębne grupy w oparciu o ich unikalne częstotliwości i kąty powtarzalności ruchów rzęsek.

To korzystny wynik. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię wodogłowia, ponieważ nieprawidłowe funkcjonowanie epidermalnych CLIA prowadzi do gromadzenia się płynu mózgowo-rdzeniowego w mózgu.

Komory Procedurę zademonstrują pani Zaha Alam oraz pani Hannah sat, bardzo utalentowane studentki z naszego laboratorium. Rozpocznij od oczyszczenia głowy dorosłej myszy 70% etanolem. Następnie, zaczynając od górnej części głowy, użyj sterylnych nożyczek i pęsety, aby odsunąć skórę i odsłonić czaszkę.

Następnie należy leczyć kość fragment po fragmencie, zaczynając od strony tylnej i przesuwając się w stronę przedniej. Aby usunąć czaszkę, należy wybrać cały mózg i umieścić go w 100 milimetrowej szalce Petriego z pożywką z wysoką zawartością glukozy o temperaturze 37 °C. Za pomocą ostrego ostrza należy przeciąć mózg w płaszczyźnie pośrodkowej strzałkowej, aby uzyskać pierwszy przekrój o grubości od 100 do 200 mikronów z każdej połowy.

Następnie należy wypłukać skrawki w PBS o temperaturze 37 °C i bezzwłocznie przenieść tkankę do pożywki z glukozą o temperaturze 37 °C. Aby obrazować skrawki, należy umieścić plasterki mózgu w szklanych naczyniach hodowlanych o średnicy 30 mm z dnem szklanym, zawierających 1 ml pożywki z wysoką zawartością glukozy, a następnie ustawić warunki w zamkniętej komorze mikroskopowej na 37 °C i 5% CO2, korzystając z obiektywu olejowego 60x. Następnie należy ustawić ostrość na komórkach, używając standardowego światła przechodzącego w trybie DIC.

Następnie, kierując się ruchem pęcherzyka DMEM, aby zlokalizować ruchome włókna ependymalne (ependymocyty). Używając filtra DIC, należy wybrać obszar zawierający zdrowe komórki z ruchomymi włóknami w bocznym komorze mózgu. Po zidentyfikowaniu włókien ependymalnych należy dostosować oświetlenie i ostrość, aby uzyskać satysfakcjonujący obraz.

Następnie ustaw parametry obrazowania na żywo w oprogramowaniu do obrazowania. Przykładowo, w tym przypadku pozyskiwane są obrazy 24-bitowe przy binningu kamery ustawionym na 1x1, z użyciem obiektywu 60x i czasem ekspozycji od 5 do 10 ms. Otwórz aperturę mikroskopu do optymalnego poziomu, aby zapewnić minimalny czas ekspozycji, a następnie wykonaj obrazy DIC.

Obserwuj obrazy na żywo przesyłane do kamery, aby zapewnić szybką i natychmiastową akwizycję obrazu bez opóźnień. Prędkość bicia może być następnie obliczona na podstawie wymaganego minimalnego czasu ekspozycji w celu uzyskania wystarczającego kontrastu obrazu do rejestracji sygnalizacji wapniowej. Po pocięciu mózgu krótko wypłucz tkankę w PBS, a następnie niezwłocznie inkubuj skrawki w 20 µg/mL świeżo przygotowanego lu O2 na płytce z szklanym dnem.

Po 30 minutach w temperaturze 37°C zarejestruj oscylacje wapnia z częstotliwością próbkowania 5 ms przez co najmniej jedną sekundę. Najpierw przy długości fali wzbudzenia 488 nm, a następnie przy długości fali emisji 515 nm. Aby zwizualizować interesujące markery komórkowe za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, utrwal próbki w 4% paraformaldehydzie i 2% sacharozie w PBS przez 10 minut.

Przemyć tkankę trzykrotnie w PBS, każdorazowo przez pięć minut. Następnie inkubować skrawki mózgu w 0,1% Triton X przez pięć minut. Po wypłukaniu próbek w sposób przedstawiony powyżej, inkubować je z przeciwciałem mysim przeciwko acetylowanej alfa-tubulinie.

Po kolejnym przemyciu w roztworze PBS inkubuj próbki z przeciwciałami fluorescencyjnymi anty-US IgG przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec przeprowadź kontrastowanie sekcji barwnikiem DPI przez pięć minut i natychmiast wykonaj obrazowanie komórek przy minimalnym możliwym czasie naświetlania. Obecność penal CLIA potwierdza się za pomocą markera rzęsek, acetylowanej alfa-tubuliny, z kontrastowaniem DPI. W celu identyfikacji jąder, analiza strumienia ruchliwości penal CLIA jest przeprowadzana poprzez zliczanie częstotliwości uderzeń oraz analizę wzorców kątowych poruszających się komórek.

Na podstawie tych danych CLIA można następnie podzielić na jedną z trzech grup. Co ważne, wystawienie CLIA na działanie 0,25% etanolu znacząco hamuje częstotliwość uderzeń CLIA, niezależnie od ich typu. Dalsze wygięcie CLIA wywołuje zależną od rzęsek wewnątrzkomórkową sygnalizację wapniową, co pozwala na pomiar sygnału wapnia wewnątrzkomórkowego w komorach mózgowych. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu jednej godziny.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się z tkanką mózgową delikatnie i sprawnie, aby nie zniszczyć komór mózgu po ich wykształceniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do badania funkcji append CLIA oraz żywej tkanki mózgu myszy.