Name: Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodę obserwacji rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy na żywo przy użyciu mikroskopii DIC. Technika ta pozwala klasyfikować komórki wyściółkowe na podstawie częstotliwości i kąta ruchu rzęsek oraz badać oscylacje wapnia wewnątrzkomórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Charisse Montgomery za jej usługi redakcyjne. Praca A. Alomrana częściowo spełnia wymagania dla uzyskania tytułu magistra farmakologii.Ta praca jest finansowana przez The University of Toledo's intramural startup fund for W.A.A i NIH grant (DK080640) dla S.M.N.

Procedury dotyczące wykorzystania zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Toledo zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia oraz Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych.
1. Ekstrakcja, sekcja i przygotowanie tkanek mózgu
<ol>
	<li>Poświęć szczep myszy typu dzikiego C57BL/6 poprzez głęboką eutanazję z uduszeniem CO2 przez 5 minut. Upewnij się, że umrze przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Wyczyść głowę myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj kraniektomię za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy, najpierw ściągając skórę, zaczynając od czubka głowy, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Następnie, gdy czaszka jest odsłonięta, usuń czaszkę, obierając kość kawałek po kawałku, zaczynając od tylnej strony i przesuwając się w kierunku przedniej strony. Uważaj, aby nie zniszczyć komór mózgu.</li>
	<li>Zbierz cały mózg.</li>
	<li>Umieścić mózg na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej DMEM/High-Glucose uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny/streptomycyny zawierającym 10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny i wstępnie podgrzanym do 37 °C.</li>
	<li>Pokrój mózg na środkowej płaszczyźnie strzałkowej ręcznie ostrym ostrzem i uzyskaj pierwszy odcinek 100-200 mm z każdej połowy za pomocą wibratomu.</li>
	<li>Przepłukać tkankę mózgową wstępnie podgrzanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem o temperaturze 37 °C (1x PBS).</li>
	<li>Natychmiast umieść sekcję mózgu w pożywce DMEM/High-Glucose podgrzanej do 37 °C.</li>
</ol>
2. Konfiguracja i konfiguracja obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Umieść skrawki tkanki mózgowej w 30-milimetrowych naczyniach hodowlanych ze szklanym dnem zawierających 1 ml pożywki DMEM/High-Glucose Systems. Dostosuj środowisko zamkniętej komory mikroskopu do 37 °C, 95%/5% zawartości O2 / CO2 (Rysunek 1).</li>
	<li>Używając soczewki immersyjnej z olejkiem 60X, zbierz obrazy komórek wyściółki/rzęsek, najpierw umieszczając kroplę oleju na soczewce obiektywu 60X i skupiając się na komórkach o zwykłym świetle przechodzącym DIC.</li>
	<li>Następnie postępuj zgodnie z kierunkiem ruchu pęcherzyków DMEM jako wskazówką do lokalizacji ruchliwych rzęsek wyściółki, ponieważ uderzenia rzęsek tworzą rodzaj ruchu pęcherzyków w okolicy. Wybierz obszar zawierający zdrowe komórki z ruchliwymi rzęskami w bocznej komorze mózgu za pomocą filtra DIC. Po znalezieniu rzęsek wyściółki dostosuj światło i skup się, aby uzyskać zadowalający obraz.</li>
	<li>Ustaw parametry obrazowania na żywo zgodnie z określonym celem za pomocą oprogramowania do obrazowania Metamorph. W obecnej demonstracji można uzyskać dwadzieścia czterobitowych obrazów z binningiem kamery ustawionym na 1 x 1 w połączeniu z obiektywem 60x i czasem naświetlania 5-10 ms.</li>
	<li>Zbierz obrazy DIC, otwierając aperturę mikroskopu do optymalnego poziomu, aby uzyskać minimalny czas ekspozycji. Obserwuj obrazy na żywo przesyłane do kamery, aby zapewnić szybkie i natychmiastowe pozyskiwanie obrazu bez opóźnień. Oblicz szybkość bicia rzęsek w oparciu o wymóg minimalnych czasów naświetlania, aby uzyskać wystarczający kontrast obrazu.</li>
</ol>
3. Wizualizacja i analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz liczbę uderzeń rzęsek, licząc liczbę uderzeń w ciągu 1 minuty. Zrób to, zmniejszając prędkość wideo i licząc liczbę uderzeń za pomocą licznika komórek lub podobnego narzędzia.</li>
	<li>Aby obliczyć częstotliwość dudnień, pomnóż czas naświetlania, przy którym nagrywany jest film, przez liczbę klatek lub uzyskanych zdjęć poklatkowych, aby uzyskać liczbę sekund (Przykład: czas naświetlania 5 ms 200 klatek = 1 000 ms lub 1 sekunda).</li>
	<li>Obliczyć liczbę uderzeń w ciągu jednej sekundy, aby uzyskać częstotliwość, która jest wyrażona jako liczba uderzeń na jedną sekundę. Zrób to, dzieląc liczbę uderzeń rzęsek w jednosekundowym interwale czasowym (przykład: rzęski uderzają 50 razy w filmie o długości 200 klatek nagranym przy czasie ekspozycji 5 ms, tj. 5 ms x 200 klatek = 1 sekunda; teraz podziel 50 uderzeń przez 1 sekundę = 50 Hz).</li>
	<li>Oblicz kąt dudnienia rzęsek, oceniając ścieżkę przebytą przez rzęski wyściółki zarówno podczas uderzeń mocy, jak i odzysku. Wykonaj to zgodnie z wcześniej opisaną metodą, z niewielkimi modyfikacjami 11. Precyzyjny ruch poszczególnych rzęsek obserwuje się podczas pełnego cyklu dudnienia.</li>
	<li>Na arkuszu octanu umieszczonym nad monitorem narysuj poziomą linię wzdłuż krawędzi wyściółki i pionową linię przechodzącą przez linię środkową rzęsek na początku skoku mocy.</li>
	<li>Wykreśl dokładne położenie rzęski klatka po klatce, gdy porusza się do przodu podczas skoku mocy. W podobny sposób narysuj ruch rzęsek podczas udaru rekonwalescencji.</li>
	<li>Oblicz kąt dudnienia rzęsek na podstawie maksymalnego odchylenia rzęski od linii środkowej podczas suwu mocy, a także suwu regeneracyjnego.</li>
</ol>
4. Zapis sygnału wapniowego
<ol>
	<li>Po pokrojeniu mózgu krótko przepłucz wycinek mózgu 1x PBS lub PBS firmy Dulbecco (pH 7,0). Przygotuj świeży Fluo-2, aby uniknąć wygaszania fluorescencji i uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Przygotować 1 mM roztwór podstawowy roztworu Fluo-2 w dimetylosulfotlenku (DMSO), wymieszać i wirować roztwór przez co najmniej 5 minut, aby upewnić się, że Fluo-2 jest jednorodnie rozpuszczony w DMSO.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy Fluo-2 w 500 ml DMEM/High-Glucose uzupełnionego 2% B27 wstępnie podgrzanym do 37 °C do końcowego stężenia 20 mg/ml. 
	UWAGA: B-27 to zoptymalizowany suplement bez surowicy zawierający witaminę A, koktajl przeciwutleniaczy i insulinę stosowaną w celu wspierania krótko- lub długoterminowej żywotności neuronów hipokampa i innych neuronów OUN.</li>
	<li>Natychmiast inkubować wycinek mózgu z 20 mg/ml Fluo-2 przez 30 minut w temperaturze 37 °C na płytce ze szklanym dnem.</li>
	<li>Aby określić optymalne stężenie obciążenia fluoroforu wapnia Fluo-2 i uniknąć toksyczności komórek barwnika wapniowego, należy zmobilizować komórki za pomocą ATP i sprawdzić żywotność komórek, określając przebieg czasowy i szczytową wielkość sygnałów wapnia w odpowiedzi na ATP.</li>
	<li>Nagraj wideo pod kątem oscylacji wapnia z szybkością przechwytywania 5 ms przez co najmniej 1 sekundę (200 klatek na sekundę), z długościami fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 nm i 515 nm (film 2).</li>
	<li>Aby odróżnić sygnał wapniowy Fluo-2 od artefaktów autofluorescencji lub ruchu, należy upewnić się, że intensywności emitowane przy 515 nm są monitorowane oddzielnie. 
	UWAGA: Fluo-2 nie jest fluoremetrią wapnia odpowiednią do ilościowego oznaczania wapnia wewnątrzkomórkowego. Jest to jednak doskonały dynamiczny barwnik wapniowy do wykrywania szybkich zmian wapnia, takich jak oscylacje wapnia. W celu dokładniejszego określenia ilościowego wapnia zaleca się Fura-2. Dynamiczne zmiany Fura-2 są jednak ograniczone przez jego ratiometryczny charakter barwnika.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze wzorami dostarczonymi przez producenta, aby obliczyć dokładne wartości wolnego wewnątrzkomórkowego wapnia. Przykład [Ca2+] = Kd × (R–Rmin)/(Rmax – R). Gdzie Kd jest stałą dysocjacji barwnika od uwolnionego wapnia, R jest zmierzoną fluorescencją przy 488, a Rmin i Rmax są współczynnikami fluorescencji przy minimalnym i maksymalnym stężeniu jonów 12.</li>
</ol>
5. Mikroskopia immunofluorescencyjna
<ol>
	<li>Utrwalić skrawki mózgu roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem zawierającym 4% paraformaldehydu (PFA) i 2% sacharozy przez 10 minut. Alternatywnie, utrwalić cały mózg za pomocą 4% PFA, a następnie przeciąć na odcinki o średnicy 50 mm za pomocą kriostatu.</li>
	<li>Umyj chusteczkę trzy razy 1x PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Inkubować wycinek mózgu z roztworem 0,1% Triton-X w 1x PBS przez 5 minut, a następnie płukać trzy razy 1x PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Inkubować wycinek mózgu z mysim przeciwciałem pierwszorzędowym, antyacetylowaną a-tubuliną, stosowaną w rozcieńczeniu 1:5 000 w 10% FBS w 1x PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj chusteczkę trzy razy 1x PBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Inkubować wycinek mózgu w przeciwciałie wtórnym, fluoresceina anty-mysie IgG w rozcieńczeniu 1: 500 w 10% FBS w 1x roztworze PBS przez 1 godzinę w RT.</li>
	<li>Przed obserwacją pod mikroskopem fluorescencyjnym należy wybarwić skrawek 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) przez 5 minut, aby zabarwić jądro (lub DNA) 13. Aby zminimalizować fotowybielanie, należy natychmiast sfotografować sekcje z możliwie najkrótszym czasem naświetlania.</li>
</ol>

<ol><li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia%3A+Highly+sophisticated+biological+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li>
<li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li>
<li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li>
<li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x%287%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+signalling%22%5BJournal%5D)">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li>
<li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li>
<li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+%28New+York%2C+N.Y.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li>
<li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function%2C+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li>
<li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476(2012).</li>
<li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li>
<li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging%3A+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li>
<li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li>
<li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+membrane+biology%22%5BJournal%5D)">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li>
<li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5(2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisano tutaj protokół przygotowania tkanki mózgowej myszy zarówno do obrazowania na żywo, jak i mikroskopii fluorescencyjnej, który zapewnia szybką i czułą dokładną obserwację rzęsek wyściółki w komorach mózgu. Technika ta nie ogranicza się tylko do komory bocznej; Można go wykorzystać do obserwacji rzęsek w innych komorach mózgu. Ta technika obrazowania zapewnia transmisję na żywo, która przypomina ruch płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez bicie rzęsek w warunkach ex vivo . Ponadto umożliwia analizę ruchu kierunk...

Rzęski to organelle czuciowe oparte na mikrotubulach, które rozciągają się od powierzchni komórki do środowiska zewnątrzkomórkowego. W zależności od organizacji mikrotubul rzęski można podzielić na dwa typy - "9 + 0" lub "9 + 2". Funkcjonalnie, na podstawie ich ruchliwości, można je sklasyfikować jako rzęski ruchliwe lub nieruchome 1. Rzęski pierwotne to termin powszechnie używany do określenia nieruchomych rzęsek "9 + 0". Mają one dziewięć równoległych mikrotubul dubletowych (oznaczonych przez "9"), a centralna para mikrotubul jest nieobecna w osłonce centralnej (oznaczonej przez "0"). Jednak niektóre rzęski "9+0", takie jak rzęski węzłowe, które regulują lateralizację zarodka, są ruchliwe 2. Z drugiej strony, ruchliwe rzęski charakteryzują się, oprócz dziewięciu równoległych dubletów mikrotubul, dodatkową centralną parą dubletów mikrotubul i są związane z białkami motorycznymi dyneiny w celu ułatwienia ruchliwości. Ponadto niektóre rzęski "9 + 2", takie jak rzęski węchowe, są nieruchome 3. Komórki wyściółki wyściełającej komory mózgu i kanał centralny rdzenia kręgowego charakteryzują się ruchliwymi rzęskami, które napędzają płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) wzdłuż komór mózgu 4.
Ogólnym celem tej metody jest ułatwienie badania dynamiki ruchliwych rzęsek i nieprawidłowości strukturalnych. Zdrowie i rozwój mózgu w dużym stopniu zależą od sprawnego krążenia płynu mózgowo-rdzeniowego w komorach mózgu. Na przykład prawidłowy przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego i równowaga płynów wymagają prawidłowego bicia i funkcjonalnych rzęsek wyściółki 5,6, które z kolei odgrywają kluczową rolę w regulacji kierunkowego ruchu komórek nerwowych i migracji komórek macierzystych 7. W związku z tym nieprawidłowa funkcja lub struktura rzęsek wyściółki może prowadzić do nieprawidłowego przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego, co jest związane z wodogłowiem, stanem chorobowym, w którym dochodzi do nieprawidłowego gromadzenia się płynu mózgowo-rdzeniowego w komorach mózgu. Może to w konsekwencji powodować wzrost ciśnienia śródczaszkowego i postępujące powiększenie głowy, drgawki, widzenie tunelowe i upośledzenie umysłowe 8.
Przewaga tej techniki nad istniejącymi metodami polega na tym, że po raz pierwszy pozwoliła ona na zgłoszenie trzech różnych typów komórek wyściółki: I, II i III, w oparciu o ich unikalną częstotliwość i kąt dudnienia rzęsek. Te komórki wyściółki są zlokalizowane w określonych regionach komór mózgu. Ponadto można wykazać wpływ wieku i środków farmakologicznych, takich jak alkohol i cilostazol, na zmianę typów komórek wyściółki lub ich lokalizacji, co nie było możliwe przed tą klasyfikacją komórek wyściółki. Cilostazol jest inhibitorem fosfodiesterazy-3, enzymu, który metabolizuje cAMP do AMP, a także reguluje wewnątrzkomórkowy poziom wapnia 9. Wykorzystanie szybkiej analizy obrazowania fluorescencyjnego umożliwia obrazowanie i ilościowe określenie unikalnych wewnątrzkomórkowych właściwości oscylacji wapnia komórek wyściółki. Na przykład zarówno alkohol, jak i cilostazol znacząco zmieniły częstotliwość dudnienia wyściółki rzęskowej, a także właściwości wewnątrzkomórkowego oscylacji wapnia, co z kolei może prowadzić do zmiany objętości płynu mózgowo-rdzeniowego przez rzęski wyściółki 10. Podsumowując, technika ta była kluczem do dostarczenia pierwszych dowodów na istnienie trzech różnych typów komórek wyściółki o różnych właściwościach oscylacji wapnia.
W następnej sekcji znajduje się szczegółowy przegląd procedury krok po kroku, zwracając szczególną uwagę na przygotowanie i obsługę tkanek.

<table><tbody><tr><td>DMEM/WYSOKI POZIOM GLUKOZY</td><td>Cellgro Mediatech Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710-SP</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-2395</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-2&nbsp;</td><td>TEF Labs</td><td>#0200</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Antyacetylowane przeciwciało a-tubulinowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451&nbsp;</td><td>klon 6-11B1</td></tr><tr><td>FITC Przeciwciało przeciw myszom</td><td>Vector Labs</td><td>FI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych</td><td>VWR Vista Vision</td><td>30-2041</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (18 x 18)</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004.326</td><td></td></tr><tr><td>Wibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Kriostat Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwróconej fluorescencji</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Olej do Nikon TE2000</td><td>60X&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu 24 x 60 mm2</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra DAPI</td><td>Technologia</td><td></td><td></td> Chroma</tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Wielolimne komórki wyściółki wyściełają komory mózgu dorosłego. Nieprawidłowa funkcja lub struktura rzęsek wyściółki wiąże się z różnymi deficytami neurologicznymi. Obecna technika obrazowania na żywo ex vivo ruchliwych rzęsek wyściółki pozwala na szczegółowe badanie dynamiki rzęsek w kilku etapach. Kroki te obejmują: eutanazję myszy dwutlenkiem węgla zgodnie z protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Toledo (IACUC); Kraniektomia, a następnie usunięcie mózgu i strzałkowe wycięcie mózgu za pomocą wibratomu lub ostrego ostrza w celu uzyskania bardzo cienkich odcinków przez boczne komory mózgu, w których można uwidocznić rzęski wyściółki. Inkubacja wycinków mózgu na dostosowanej do potrzeb szklanej płytce zawierającej zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium (DMEM)/High-Glucose firmy Dulbecco w temperaturze 37 °C w obecności 95%/5% mieszaninyO2/CO2 jest niezbędne do utrzymania tkanki przy życiu podczas eksperymentu. Film przedstawiający bicie rzęsek jest następnie rejestrowany za pomocą mikroskopu kontrastowego z interferencją różnicową o wysokiej rozdzielczości. Film jest następnie analizowany klatka po klatce w celu obliczenia częstotliwości dudnienia rzęsek. Pozwala to na wyraźną klasyfikację komórek wyściółki na trzy kategorie lub typy w oparciu o ich częstotliwość i kąt dudnienia rzęsek. Ponadto technika ta pozwala na wykorzystanie szybkiej analizy obrazowania fluorescencyjnego w celu scharakteryzowania unikalnych wewnątrzkomórkowych właściwości oscylacji wapnia komórek wyściółki, a także wpływu środków farmakologicznych na oscylacje wapnia i częstotliwość dudnienia rzęsek. Ponadto technika ta nadaje się do obrazowania immunofluorescencyjnego w badaniach struktury rzęsek i lokalizacji białek rzęskowych. Jest to szczególnie ważne w diagnostyce chorób i badaniach fenotypu. Głównym ograniczeniem tej techniki jest zmniejszenie ruchu żywych ruchliwych rzęsek, gdy tkanka mózgowa zaczyna obumierać.

Pomiar funkcji rzęsek ependymalnych w żywym mózgu myszy
Metoda opisana w niniejszym protokole jest wykorzystywana do monitorowania funkcji i struktury rzęsek komórek wyściełających komory mózgu (ependymocytów) w świeżej tkance wyizolowanej z mózgu myszy, a także do monitorowania i badania częstotliwości uderzeń rzęsek. Kroki niezbędne do przeprowadzenia pełnego eksperymentu przedstawiono na schemacie (Rysunek 1). Zaleca się, aby eksperyment został przeprowadzony w krótkim odst...

Korzystając z mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) o wysokiej rozdzielczości, obserwuje się ex vivo bicie ruchliwych rzęsek wyściółki znajdujących się w komorach mózgu myszy za pomocą obrazowania na żywo. Technika ta pozwala na rejestrację unikalnej częstotliwości i kąta dudnienia rzęsek, a także ich właściwości stymulacyjnych wewnątrzkomórkowych oscylacji wapnia.

Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ex vivo obserwacja bicia Motr append CLIA znajdującego się w komorach mózgu myszy. Osiąga się to poprzez pobranie całego mózgu, a następnie wykonanie cienkich przekrojów przez komory boczne. Następnie skrawki inkubuje się w specjalnej płytce z szklanym dnem zawierającej pożywkę z wysoką zawartością glukozy w temperaturze ciała, aby utrzymać żywotność tkanki podczas eksperymentu.Na koniec ruchy rzęsek są rejestrowane przy użyciu mikroskopu kontrastowego z interferencją różnicową o wysokiej rozdzielczości. Ostatecznie strukturę i lokalizację białek w rzęskach można zwizualizować za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszą dotychczasową metodą jest to, że jest to pierwsza technika pozwalająca na klasyfikację komórek naskórka na trzy odrębne grupy w oparciu o ich unikalne częstotliwości i kąty powtarzalności ruchów rzęsek.To korzystny wynik. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię wodogłowia, ponieważ nieprawidłowe funkcjonowanie epidermalnych CLIA prowadzi do gromadzenia się płynu mózgowo-rdzeniowego w mózgu.Komory Procedurę zademonstrują pani Zaha Alam oraz pani Hannah sat, bardzo utalentowane studentki z naszego laboratorium. Rozpocznij od oczyszczenia głowy dorosłej myszy 70% etanolem. Następnie, zaczynając od górnej części głowy, użyj sterylnych nożyczek i pęsety, aby odsunąć skórę i odsłonić czaszkę.Następnie należy leczyć kość fragment po fragmencie, zaczynając od strony tylnej i przesuwając się w stronę przedniej. Aby usunąć czaszkę, należy wybrać cały mózg i umieścić go w 100 milimetrowej szalce Petriego z pożywką z wysoką zawartością glukozy o temperaturze 37 °C. Za pomocą ostrego ostrza należy przeciąć mózg w płaszczyźnie pośrodkowej strzałkowej, aby uzyskać pierwszy przekrój o grubości od 100 do 200 mikronów z każdej połowy.Następnie należy wypłukać skrawki w PBS o temperaturze 37 °C i bezzwłocznie przenieść tkankę do pożywki z glukozą o temperaturze 37 °C. Aby obrazować skrawki, należy umieścić plasterki mózgu w szklanych naczyniach hodowlanych o średnicy 30 mm z dnem szklanym, zawierających 1 ml pożywki z wysoką zawartością glukozy, a następnie ustawić warunki w zamkniętej komorze mikroskopowej na 37 °C i 5% CO2, korzystając z obiektywu olejowego 60x. Następnie należy ustawić ostrość na komórkach, używając standardowego światła przechodzącego w trybie DIC.Następnie, kierując się ruchem pęcherzyka DMEM, aby zlokalizować ruchome włókna ependymalne (ependymocyty). Używając filtra DIC, należy wybrać obszar zawierający zdrowe komórki z ruchomymi włóknami w bocznym komorze mózgu. Po zidentyfikowaniu włókien ependymalnych należy dostosować oświetlenie i ostrość, aby uzyskać satysfakcjonujący obraz.Następnie ustaw parametry obrazowania na żywo w oprogramowaniu do obrazowania. Przykładowo, w tym przypadku pozyskiwane są obrazy 24-bitowe przy binningu kamery ustawionym na 1x1, z użyciem obiektywu 60x i czasem ekspozycji od 5 do 10 ms. Otwórz aperturę mikroskopu do optymalnego poziomu, aby zapewnić minimalny czas ekspozycji, a następnie wykonaj obrazy DIC.Obserwuj obrazy na żywo przesyłane do kamery, aby zapewnić szybką i natychmiastową akwizycję obrazu bez opóźnień. Prędkość bicia może być następnie obliczona na podstawie wymaganego minimalnego czasu ekspozycji w celu uzyskania wystarczającego kontrastu obrazu do rejestracji sygnalizacji wapniowej. Po pocięciu mózgu krótko wypłucz tkankę w PBS, a następnie niezwłocznie inkubuj skrawki w 20 µg/mL świeżo przygotowanego lu O2 na płytce z szklanym dnem.Po 30 minutach w temperaturze 37°C zarejestruj oscylacje wapnia z częstotliwością próbkowania 5 ms przez co najmniej jedną sekundę. Najpierw przy długości fali wzbudzenia 488 nm, a następnie przy długości fali emisji 515 nm. Aby zwizualizować interesujące markery komórkowe za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, utrwal próbki w 4% paraformaldehydzie i 2% sacharozie w PBS przez 10 minut.Przemyć tkankę trzykrotnie w PBS, każdorazowo przez pięć minut. Następnie inkubować skrawki mózgu w 0,1% Triton X przez pięć minut. Po wypłukaniu próbek w sposób przedstawiony powyżej, inkubować je z przeciwciałem mysim przeciwko acetylowanej alfa-tubulinie.Po kolejnym przemyciu w roztworze PBS inkubuj próbki z przeciwciałami fluorescencyjnymi anty-US IgG przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec przeprowadź kontrastowanie sekcji barwnikiem DPI przez pięć minut i natychmiast wykonaj obrazowanie komórek przy minimalnym możliwym czasie naświetlania. Obecność penal CLIA potwierdza się za pomocą markera rzęsek, acetylowanej alfa-tubuliny, z kontrastowaniem DPI. W celu identyfikacji jąder, analiza strumienia ruchliwości penal CLIA jest przeprowadzana poprzez zliczanie częstotliwości uderzeń oraz analizę wzorców kątowych poruszających się komórek.Na podstawie tych danych CLIA można następnie podzielić na jedną z trzech grup. Co ważne, wystawienie CLIA na działanie 0,25% etanolu znacząco hamuje częstotliwość uderzeń CLIA, niezależnie od ich typu. Dalsze wygięcie CLIA wywołuje zależną od rzęsek wewnątrzkomórkową sygnalizację wapniową, co pozwala na pomiar sygnału wapnia wewnątrzkomórkowego w komorach mózgowych. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu jednej godziny.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się z tkanką mózgową delikatnie i sprawnie, aby nie zniszczyć komór mózgu po ich wykształceniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do badania funkcji append CLIA oraz żywej tkanki mózgu myszy.

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Źródło: Al Omran, A. J., et al. Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w komorach bocznych mózgu myszy. J. Vis. exp. (2015).  Ten film demonstruje technikę obrazowania na żywo przy użyciu mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) do obserwacji bicia rzęsek wyściółki w strzałkowych odcinkach mózgu myszy. Rzęski wyściółki napędzają płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), a ich aktywność jest rejestrowana w sekcjach mózgu utrzymywanych w pożywce bogatej w składniki odżywcze i obrazowanych w komorze o...

Obrazowanie na żywo aktywności rzęsek komórek wyściółki w wycinku mózgu myszy

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Ta metoda tworzy namacalne, znajome środowisko dla myszy do nawigacji i eksploracji podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia.

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

Podczas gdy obrazowanie wielofotonowe jest skuteczne tylko na ograniczonych głębokościach od powierzchni tkanki, możliwe jest osiągnięcie obrazowania o rozdzielczości 3 μm na dowolnej głębokości za pomocą pCLE. W tym miejscu przedstawiamy protokół do przeprowadzania obrazowania pCLE w celu pomiaru dynamiki mikronaczyniowej w hipokampie myszy ictal i dzikich myszy.

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę obserwacji rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy na żywo przy użyciu mikroskopii DIC. Technika ta pozwala klasyfikować komórki wyściółkowe na podstawie częstotliwości i kąta ruchu rzęsek oraz badać oscylacje wapnia wewnątrzkomórkowego.

Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów