Name: Sonda luminescencyjna Iridium(III) do wykrywania biomarkera białka malarii Histidine Rich Protein-II (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj metodę wykrywania biomarkera malarii HRP-II za pomocą sondy luminescencyjnej z irydem. Technika ta umożliwia szybką i niezawodną diagnostykę Plasmodium falciparum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez Fundację Billa i Melindy Gatesów Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies, Which Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. było wspierane przez NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. Synteza kompleksu irydu(III)
<ol>
	<li>Odważyć 53,6 mg (50 μmol) [Ir(ppy)2-Cl]2 i rozpuścić w 5 ml chlorku metylenu. Dodać ten roztwór do kolby Erlenmeyera o pojemności 50 ml wyposażonej w mieszadło.</li>
	<li>Odważyć 26,2 mg (100 μmol) AgOTf i rozpuścić w 5 ml metanolu.</li>
	<li>Dodać rozpuszczony AgOTf do roztworu [Ir(ppy)2-Cl]2 i mieszać przez 1 godz. 
	Uwaga: Powinna powstać kremowa zawiesina.</li>
	<li>Po 1 godzinie przefiltrować zawiesinę przez żel krzemionkowy do fiolki o wymiarach dram 25 x 95 mm i odparować pozostały rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej (5-10 min).</li>
	<li>Po usunięciu większości rozpuszczalnika należy sprawdzić, czy w fiolce pozostał tłusty żółty osad. Do tej pozostałości dodać 1 ml metanolu w celu ponownego rozpuszczenia produktu i liofilizacji przez 1-2 dni, aby uzyskać żółty produkt stały.</li>
	<li>Scharakteryzować iloczyn Ir(ppy)2(H2O)2+ ( Ir1) za pomocą H1NMR (w CDCl3), ESI i UV-Vis zgodnie z wcześniejszym opisem. 23</li>
</ol>
2. Interakcje Ir1 z różnymi aminokwasami
<ol>
	<li>Przygotować 2 mM roztwór Ir1 w metanolu (MW 537,10 g/mol). Wirować, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie ciała stałego.</li>
	<li>Przygotować 100 μM roztwory następujących aminokwasów i biomolekuł w buforowanym roztworze soli fizjologicznej HEPES (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl każdego aminokwasu do czarnej 96-dołkowej płytki. Dodaj 100 μl HBS do płytki, aby posłużyła jako półfabrykat.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 2,5 μl roztworu 2 mM Ir1 i wstrząsać płytką na wytrząsarce przez 10 minut.</li>
	<li>Po 10 minutach należy uzyskać widma emisyjne próbek za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek (365 ex/400-700 em).
	<ol>
		<li>Umieść płytkę w instrumencie i otwórz oprogramowanie czytnika płytek, aby skonfigurować nowy eksperyment.</li>
		<li>Ustaw nowy eksperyment tak, aby odczytywał skan fluorescencyjny o długości fali wzbudzenia 365 nm i szerokości szczeliny 9 nm z optyką w górnej pozycji.</li>
		<li>Odczyt emisji od 300-700 nm z krokiem o długości 5 nm.</li>
		<li>Eksportuj dane do analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś próbki na przezroczystą 96-dołkową płytkę i zobrazuj emisję za pomocą transiluminatora UV.</li>
</ol>
3. Miareczkowanie Ir1 za pomocą BNT-II
<ol>
	<li>Przygotować 1 mM roztwór podstawowy BNT-II (MW 8233.6 g/mol) w HBS, jak również 2 mM roztwór Ir1 w metanolu.</li>
	<li>Z roztworu podstawowego przygotować 1 ml 100 μM BNT-II w HBS. Wirować probówkę mikrowirówki, aby upewnić się, że próbka jest wymieszana.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć 100 μM BNT-II o połowę w HBS do końcowego stężenia 1,56 μM BNT-II.</li>
	<li>Dodać 100 μl każdego rozcieńczenia, trzykrotnie, z HBS służącym jako ślepa próba, do studzienek płytki 96-dołkowej. Do każdej próbki dodać 2,5 μl 2 mM Ir1.</li>
	<li>Potrząsaj płytką przez 10 minut na wytrząsarce do talerzy.</li>
	<li>Po wstrząśnięciu odczytać intensywność emisji przy 510 nm (wzbudzenie przy 365 nm) za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek.
	<ol>
		<li>Umieść płytkę w instrumencie i otwórz oprogramowanie czytnika płytek, aby skonfigurować nowy eksperyment.</li>
		<li>Ustaw nowy eksperyment tak, aby odczytywał punkt końcowy fluorescencji o długości fali wzbudzenia 365 nm i długości fali emisji 510 nm. Ustaw szerokość szczeliny dla obu długości fal na 9 nm, z optyką w górnej pozycji.</li>
		<li>Odczytaj tabliczkę i wyeksportuj dane do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść próbki na przezroczystą 96-dołkową płytkę i zobrazować miareczkowanie za pomocą transiluminatora UV.</li>
</ol>
4. Analiza kinetyczna systemu Ir1/BNT-II w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem interferometrii biowarstw
<ol>
	<li>Dodaj 200 μl buforu kinetycznego (KB; 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,02% Tween-20) do 8 dołków w pierwszej kolumnie czarnej 96-dołkowej płytki i włóż płytkę do plastikowego uchwytu czujnika. Ostrożnie przenieś 8 bioczujników Ni(II)NTA do pierwszej kolumny w plastikowym uchwycie, tak aby końcówki były zawieszone w studzienkach bufora. Umieść plastikowy uchwyt po lewej stronie przyrządu interferometrycznego.</li>
	<li>Przygotować 2 ml 0,5 μM roztworu BNT-II w KB.</li>
	<li>Przygotować 500 μl 10 μM roztworu Ir1 w KB i seryjnie rozcieńczyć o połowę do 0,156 μM w KB.</li>
	<li>Na nową czarną płytkę 96-dołkową pobrać pipetę 200 μl KB do wszystkich 8 dołków w kolumnach A i C.</li>
	<li>Na tej samej płytce odpipetować 200 μl roztworu 0,5 μM BNT-II do studzienek w kolumnie B.</li>
	<li>Odpipetować 200 μl każdego rozcieńczenia Ir1 do kolumny D, zaczynając od KB jako ślepej próby w studzience D1. Dodaj rozcieńczenia, aby studzienki zwiększyły stężenie Ir1 w dół kolumny.</li>
	<li>Umieść tę płytkę w przyrządzie po prawej stronie płyty zawierającej czujniki wstępnego zwilżania.</li>
	<li>W oprogramowaniu do interferometrii biowarstw skonfiguruj podstawowy eksperyment kinetyczny, definiując płytkę, test i końcówki czujnika.
	<ol>
		<li>Aby zdefiniować blachę, wybierz kolumnę na ekranie, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz odpowiednią definicję dla studni. Wybierz "Bufor" dla kolumn A i C, "Obciążenie" dla kolumny B i "Próbka" dla kolumny D.</li>
		<li>Zdefiniuj test w następnej zakładce, dodając następujące kroki (kliknij "Dodaj"): Równoważenie (niestandardowe), 60 sekund; Ładowanie, 120 sekund; Wartość wyjściowa, 60 sekund; Asocjacja, 120 sekund; i dysocjacja, 300 sek. Wybierz krok Równoważenie i kliknij dwukrotnie kolumnę A. Powtórz dla obciążenia (kolumna B), linii bazowej (kolumna C), asocjacji (kolumna D) i dysocjacji (kolumna C). Wybierz czujniki Ni(II)NTA.</li>
		<li>Przejdź do następnej zakładki i upewnij się, że czujniki znajdują się w kolumnie A na plastikowym uchwycie czujnika.</li>
		<li>Upewnij się, że eksperyment jest poprawnie opisany, wstaw nazwę pliku, upewnij się, że zaznaczona jest opcja "eksperyment opóźniony" i naciśnij "Przejdź". 
		Uwaga: Ze względu na zautomatyzowany charakter przyrządu, po nakreśleniu eksperymentu kinetycznego kroki zostaną wykonane zgodnie z programem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu przebiegu kinetycznego przetworzyć dane w dostarczonym oprogramowaniu do przetwarzania.
	<ol>
		<li>Kliknij dwukrotnie folder z nazwą pliku, który Cię interesuje, w dolnej części panelu po lewej stronie. Następnie kliknij dwukrotnie odpowiedni folder w sekcji "Kinetyka" w górnej części panelu. Przejdź do zakładki Przetwarzanie.</li>
		<li>Zaznacz pole Odejmowanie po lewej stronie, aby otworzyć ekran wyboru czujnika. Kliknij prawym przyciskiem myszy studnię A4 i zmień typ studni na Studnia referencyjna.</li>
		<li>Zaznacz pole wyboru obok opcji Wyrównaj oś Y i upewnij się, że wybrany krok to Linia bazowa. Określ zakres czasu, który ma być ostatnimi pięcioma sekundami linii bazowej (około 55–60 sekund).</li>
		<li>Zaznacz pole Korekcja międzyetapowa i wybierz opcję Wyrównaj do dysocjacji. Upewnij się, że pole Filtrowanie Savitzky-Golay jest zaznaczone i naciśnij "Dane procesowe!"</li>
		<li>Przejdź do karty Analiza. Upewnij się, że "Asocjacja i dysocjacja" to wybór kroków do analizy i że model ma wartość 1:1. Wybierz Lokalny, Pełne dopasowanie i naciśnij "Dopasuj krzywe!"</li>
		<li>Podświetl wszystkie krzywe w tabeli i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby ustawić wszystkie krzywe na jeden kolor. Następnie wybierz dopasowanie globalne (pełne), pogrupowane według koloru i Rmax rozłączone według czujnika. Naciśnij "Dopasuj krzywe!", aby uzyskać globalne dane kinetyki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wykrywanie BNT-II i rcHRP-II za pomocą Ir1
<ol>
	<li>Przygotować po 1 ml 1 μM roztworu BNT-II i rcHRP-II w HBS z Tween (HBST; HBS z 0,025% animacji 20).</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć każde białko o połowę w HBST do końcowego stężenia 15,6 nM.</li>
	<li>Pobrać pipetą 100 μl każdego rozcieńczenia, trzykrotnie, na białą 96-dołkową płytkę, z rozcieńczeniami w kolejności od najniższego do najwyższego stężenia w dół kolumny.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl 50 μm magnetycznych cząstek agarozy Ni(II)NTA do każdego dołka rozcieńczenia.
	<ol>
		<li>Po każdym pipetowaniu należy wymieszać rurkę mikrowirówki zawierającą cząstki magnetyczne, aby upewnić się, że cząstki pozostają zawieszone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić płytkę na wytrząsarce na 15 minut w celu inkubacji próbek z cząstkami.</li>
	<li>Po tym okresie inkubacji umieść płytkę na 96-dołkowej płytce magnetycznej i odczekaj 30 sekund, aż cząstki wyciągną się z roztworu.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej pobrać oryginalną próbkę i wyrzucić ją jako odpad. Zdejmij płytkę z magnesu.</li>
	<li>Dodaj 200 μl HBST do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Kilkakrotnie pompuj bufor w górę iw dół, aby umyć cząstki magnetyczne.</li>
	<li>Umieść płytkę z powrotem na magnesie i odczekaj 30 sekund, aż cząsteczki wyciągną się z roztworu.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej pobrać 200 μl buforu i wyrzucić go jako odpad. Zdejmij płytkę z magnesu.</li>
	<li>Powtórz kroki od 5.8 do 5.10 dwa razy, aby zakończyć trzy płukania cząstek.</li>
	<li>Dodać 100 μl HBST do każdej studzienki zawierającej cząstki magnetyczne, a następnie 2,5 μl 2 mM Ir1.</li>
	<li>Inkubować cząstki z Ir1 na wytrząsarce płytkowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po 1 godzinie odczytać intensywność emisji przy 510 nm (wzbudzenie przy 365 nm) za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek.
	<ol>
		<li>Umieść płytkę w instrumencie i otwórz oprogramowanie czytnika płytek, aby skonfigurować nowy eksperyment.</li>
		<li>Ustaw nowy eksperyment tak, aby odczytywał punkt końcowy fluorescencji o długości fali wzbudzenia 365 nm i długości fali emisji 510 nm. Ustaw szerokość szczeliny dla obu długości fal na 9 nm, z optyką w górnej pozycji.</li>
		<li>Odczytaj tabliczkę i wyeksportuj dane do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść próbki na przezroczystą 96-dołkową płytkę i zobrazować miareczkowanie za pomocą transiluminatora UV.</li>
</ol>

<ol><li>Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+Care+Diagnostics%3A+Status+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Point of Care Diagnostics: Status and Future.</a> Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+tracking+fluorescence+microscopy+in+mitochondria+reveals+highly+dynamic+but+confined+movement+of+Tom40%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40.</a> Scientific Reports. 1, (2011).</li>
<li>Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Biosensors+and+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA Biosensors and Microarrays.</a> Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).</li>
<li>Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lighting+up+cells%3A+labelling+proteins+with+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores.</a> Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+protein+detection+using+enzyme-labeled+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes.</a> Analyst. 135, 327-331 (2010).</li>
<li>Almeida, M., Carabineiro, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nanogold+in+human+tropical+diseases%3A+research%2C+detection+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gold+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy.</a> Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).</li>
<li>Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Trends+in+the+Use+of+Transition+Metal%E2%80%93Ligand+Complexes+for+Applications+in+Electroluminescent+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices.</a> Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+centered+ligand+field+excited+states%3A+Their+roles+in+the+design+and+performance+of+transition+metal+based+photochemical+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices.</a> Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).</li>
<li>Lamansky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Phosphorescent+Bis-Cyclometalated+Iridium+Complexes%3A+Synthesis%2C+Photophysical+Characterization%2C+and+Use+in+Organic+Light+Emitting+Diodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).</li>
<li>Ho, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+structure+and+oxygen-sensing+properties+of+Iridium%28iii%29-containing+coordination+polymers+with+different+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations.</a> Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).</li>
<li>McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclometalated+Iridium%28III%29+Aquo+Complexes%3A+Efficient+and+Tunable+Catalysts+for+the+Homogeneous+Oxidation+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).</li>
<li>Ma, D. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Selective+Luminescent+Switch-On+Probe+for+Histidine%2FHistidine-Rich+Proteins+and+Its+Application+in+Protein+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).</li>
<li>Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Luminescent+Transition-Metal+Complexes+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).</li>
<li>Leung, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Metal-Based+Inhibitor+of+Tumor+Necrosis+Factor-%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).</li>
<li>You, Y., Nam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photofunctional+triplet+excited+states+of+cyclometalated+Ir%28iii%29+complexes%3A+beyond+electroluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence.</a> Chemical Society Reviews. 41 (21), 7061-7084 (2012).</li>
<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+Iridium%28III%29+Complexes+with+Tunable+Emission+Color+as+Phosphorescent+Dyes+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Organometallics%22%5BJournal%5D)">Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging.</a> Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonemissive+Iridium%28III%29+Complex+That+Specifically+Lights-Up+the+Nuclei+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).</li>
<li>Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine-rich+glycoprotein%3A+A+novel+adaptor+protein+in+plasma+that+modulates+the+immune%2C+vascular+and+coagulation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%2C+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems.</a> Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).</li>
<li>Panton, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+partial+characterization+of+an+unusual+protein+of+Plasmodium+falciparum%3A+histidine-rich+protein+II%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).</li>
<li>Schneider, E. L., Marletta, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+Binding+to+the+Histidine-Rich+Protein+II+from+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum.</a> Biochemistry. 44, 979-986 (2004).</li>
<li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropical+infectious+diseases%3A+Diagnostics+for+the+Developing+World%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World.</a> Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).</li>
<li>Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-Antigenic+Peptides+of+Histidine-Rich+Protein+II+of+Plasmodium+falciparum%3A+Dendrimeric+Biomineralization+Templates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates.</a> Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).</li>
<li>Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterizations+of+cyclometalated+iridium%28III%29+solvento+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes.</a> Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).</li>
<li>Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Resource+Method+for+Extracting+the+Malarial+Biomarker+Histidine-Rich+Protein+II+To+Enhance+Diagnostic+Test+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance.</a> Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).</li>
<li>Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drivers+of+biodiagnostic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drivers of biodiagnostic development.</a> Nature. 462, 461-464 (2009).</li>
<li>Li, M. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+electrochemiluminescence+of+a+new+water-soluble+iridium%28iii%29+complex+for+determination+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics.</a> Analyst. 136, 205-210 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ narzędzia diagnostyczne oparte na mikrocząstkach wysuwają się na czoło nowoczesnej technologii diagnostycznej, wykrywanie docelowych biomolekuł bezpośrednio na powierzchni cząstki jest główną zaletą. Tradycyjne metody wykrywania molekularnego, takie jak ELISA i PCR, są korzystne, ponieważ pozwalają osiągnąć bardzo niskie granice wykrywalności25. Jednak testy te wymagają obszernych odczynników i długich protokołów. Test ten został zaprojektowany tak, aby naśladować interakcje kanapkowe typu ELISA bez wymagań dotyczących czasu i odczynnika (ryc. 5). Ponadto koszt sondy Ir1 na próbkę oszacowano na około grosz, podczas gdy koszt przeciwciał dla typowego testu ELISA wynosi 0,20-0,30 USD za próbkę.
Ponieważ opisane powyżej metody opierają się na cyklometalowanej sondzie irydowej do wykrywania biomarkera malarii, sonda ta nie byłaby podatna na tryby awaryjne typowe dla innych metod wykrywania (tj. wygaszanie fluoroforu i degradacja przeciwciał/enzymów). Histydyna jest wyjątkowa ze względu na swoje właściwości wiązania metali. Przedstawione prace wykorzystują to zjawisko poprzez zastąpienie przeciwciał w typowej kanapce ELISA kompleksami zawierającymi metale. Ni(II)NTA wychwytuje rcHRP-II na powierzchni cząstki, a Ir1 sygnalizuje obecność białka. Najważniejszym krokiem w teście jest umożliwienie mieszania się cząstek magnetycznych z próbką i sondą. W 96-dołkowej płytce ELISA biomolekuły i odczynniki osiągają równowagę z dwuwymiarową powierzchnią dna studzienki. Cząstki magnetyczne mają tendencję do osiadania po wyjęciu z roztworu ze względu na gęsty rdzeń z tlenku żelaza, co zmniejszyłoby dostępne miejsca wiązania. W związku z tym cząstki muszą być mieszane w czasie testu, aby zapewnić maksymalne wiązanie.
Projektując odczynnik do diagnostyki chorób, należy mieć na uwadze formę próbki pobranej od pacjenta, a także fizjologiczne stężenie biomarkera. W przypadku malarii stężenie PFHRP-II we krwi pacjenta może wahać się od niskiego stężenia pikomolarnego do wysokiego nanogonowowego. Chociaż test ten jest klinicznie istotny w przypadku wyższych poziomów infekcji, granica wykrywalności musi zostać poprawiona, aby wykryć bezobjawowych pacjentów z niskim poziomem krążącego pikomolarnego PFHRP-II. W metodach opisanych powyżej sygnał "włączenia" generowany przez Ir1 występuje w obecności histydyny. Podczas gdy biomarker malarii jest bogaty w histydynę, inne białka surowicy, takie jak albumina surowicy ludzkiej i glikoproteina bogata w histydynę, wywołałyby odpowiedź sygnałową za pomocą sondy. To z kolei doprowadziłoby do fałszywie dodatnich diagnoz. To sprawia, że wychwycenie białka na powierzchni cząstki jest korzystnym krokiem, ponieważ interesujące białko można szybko wyekstrahować z próbki pacjenta. Ponadto zaprojektowanie dwufunkcyjnej sondy, która łączy peptyd bogaty w histydynę z wytrzymałym elementem rozpoznawania molekularnego (tj. aptamerem), może dodać kolejną warstwę specyficzności do testu. Peptyd zostałby obciążony irydem przed sprzężeniem z aptamerem. W takiej konstrukcji stabilna sonda Ir1 może być nadal wykorzystywana, osiągając docelową swoistość za pomocą aptamera. Pozwoliłoby to na zastosowanie sondy do wykrywania natywnego HRP-II w złożonej matrycy (tj. osoczu lub krwi pełnej) i zmniejszenia niespecyficznych efektów wiązania. Aby jeszcze bardziej wzmocnić sygnał szybkich testów diagnostycznych, test można włączyć do systemu elektrochemiluminescencyjnego (ECL), w którym pfHRP-II może być wykrywany na RDT jako odczyt elektrochemiczny26. Ta sonda irydowa nowej generacji znacznie udoskonali nasz test ELISA na kulkach do wykrywania biomarkerów choroby.

Barwienie kolorymetryczne i fluorescencyjne jest ważną metodą wykrywania i śledzenia cząsteczek i procesów biochemicznych1,2. Najczęściej stosowanymi markerami fluorescencyjnymi są barwniki organiczne o niskiej masie cząsteczkowej3,4, jednak cząsteczki te nie zawsze mają idealne właściwości optyczne. Barwniki fluorescencyjne są podatne na fotowybielanie, często mają małe przesunięcia Stokesa i mogą mieć nakładające się widma wzbudzenia i emisji. Znakowanie kolorymetryczne jest często osiągane za pomocą znaczników enzymatycznych, które mają wzmocniony sygnał przydatny w oznaczaniu ilościowym testu immunologicznego5,6. Enzymy te mają również swoje wady, w tym nadwrażliwość na światło, warunki reakcji i krótki okres trwałości substratu. Właściwości te zwykle wymagają testów immunologicznych i metod znakowania białek, które muszą być wykonywane w dobrze kontrolowanych warunkach przy użyciu kosztownych odczynników.
Emisyjne kompleksy metali przejściowych zostały zbadane jako alternatywne podejście do oznaczania dla detekcji biochemicznej. W szczególności cyklometalowany Ir(III) badano w kontekście organicznych diod elektroluminescencyjnych (OLED)7-9, wykrywania tlenu10, katalizy1i barwienia białek/komórek12-14. Wysoka fotostabilność i wydajność kwantowa sprawiają, że ta klasa sond jest dobrym kandydatem do detekcji biomolekuł15,16. Wcześniej stwierdzono, że cyklometalowane kompleksy Ir(III) w postaci [Ir(C^N)2(solv)2]+ nieodwracalnie wiążą histydynę i wywołują niebiesko-zieloną odpowiedź sygnałową12,17. Kompleksy te są nieemisyjne w stanie rozpuszczalnikowym, ale gdy histydyna wypiera cząsteczki rozpuszczalnika i wiąże się ze środkiem metalu, uwalniają intensywny sygnał fosforyzujący po długofalowym napromieniowaniu UV. Sygnał ten pojawia się dopiero po podstawieniu liganda i jest wynikiem rozluźnienia elektronu w stanie trypletowym do stanu podstawowego poprzez aktywację szlaków przenoszenia ładunku liganda metalu (3MLCT) i transferu wyśrodkowanego w ligandzie (3LC)8,15. Kompleksy te mogą być potencjalnie wykorzystywane jako sondy detekcyjne dla białek bogatych w histydynę.
Białka bogate w histydynę i ich poziom regulacji są ważne w wielu chorobach, w tym marskości wątroby, raku i zaburzeniach zakrzepowych. Rozdział 18W szczególności Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pfHRP-II) jest dobrze zwalidowanym biomarkerem zakażenia pasożytem malarii. Białko to ma 67 kDa i zawiera 34% histydyny, głównie w obrębie charakterystycznych powtarzających się motywów AHHAHHAAD19. Te powtórzenia histydyny mogą wiązać wolne jony metali19 i kompleksy hemowe20 we krwi gospodarza. pfHRP-II jest powszechnie wykrywany w warunkach o niskich zasobach za pomocą szybkich testów diagnostycznych immunochromatograficznych (RDT), ale testy te są często niedokładne ze względu na warunki próbki, niskie stężenie biomarkerów, słabe standardy produkcji i degradację przeciwciał21.
Fosforyzujące sondy na bazie metali, takie jak cyklometalowane kompleksy Ir(III) opisane powyżej, są atrakcyjnymi opcjami do wykrywania pfHRP-II ze względu na ich selektywne wiązanie histydyny oraz ich stabilne i wydajne właściwości emisji. W tym artykule zbadano zastosowanie [Ir(ppy)2(H2O)2]+ (Ir1) do wykrywania BNT-II, rozgałęzionego peptydu naśladującego pfHRP-II22. Kinetykę tej interakcji monitorowano w czasie rzeczywistym za pomocą technik interferometrii biowarstw. Test został również dostosowany do formatu ELISA na kulkach, w którym osiągnięto nanomolowe granice wykrywalności. Ten test ma przewagę nad tradycyjnymi testami ELISA, ponieważ można go przeprowadzić w czasie krótszym niż 2 godziny przy użyciu odczynników wolnych od przeciwciał, zamiast 4-5 godzin i odczynników biologicznych wymaganych w przypadku typowych testów ELISA.

<table><tbody><tr><td>Dicholortetrakis(2-(2-pirydynylo)fenylo)diiryd(III)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>trifluorometanosulfonian srebra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-aminokwasy</td><td>Fisher Scientific</td><td>zmienia HEPES</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Peptyd Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II</td><td>Syntetyzowany w domu</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany HRPII</td><td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Costar polipropylenowa 96-dołkowa płytka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Costar biała polipropylenowa 96-dołkowa płytka</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Grenier polipropylenowa 96-dołkowa płytka</td><td>VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA magnetyczne cząsteczki agarozy</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA Czujniki interferometrii biowarstw</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octet Red96 Interferometria biowarstwowa Instrumet</td><td>ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 Czytnik mikropłytek</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Biotech Transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

sonda luminescencyjna iridium(iii) do wykrywania biomarkera białka malarii histidine rich protein-ii

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Ta praca opisuje syntezę nieemisyjnego, cyklometalizowanego kompleksu Ir(III), Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), który wywołuje szybki, długotrwały sygnał fosforyzujący, gdy jest skoordynowany z białkiem zawierającym histydynę unieruchomionym na powierzchni cząstki magnetycznej. Synteza Ir1, przy wysokiej wydajności, jest kompletna O/N i polega na rozszczepieniu macierzystego cyklometalowanego dimeru z mostkiem chloro Ir(III) na dwa odpowiedniki solwatowanego kompleksu. Aby potwierdzić specyficzność, kilka aminokwasów badano pod kątem aktywności koordynacyjnej po dodaniu do zsyntetyzowanej sondy i tylko histydyna wywołała odpowiedź sygnałową. Korzystając z BNT-II, rozgałęzionego peptydu naśladującego biomarker malarii Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), sonda irydowa została zwalidowana jako narzędzie do wykrywania HRP-II. Efekty gaszenia odnotowano w miareczkowaniu BNT-II/Ir1 w porównaniu z L-histydyną/Ir1, ale przypisano je przeszkodzie sterycznej i wygaszaniu w stanie trypletowym. Do określenia kinetyki oddziaływania Ir1 z BNT-II w czasie rzeczywistym wykorzystano interferometrię biowarstwową. Po zoptymalizowaniu systemu stwierdzono, że granica wykrywania rcHRP-II za pomocą sondy wynosi 12,8 nM w roztworze. Gdy białko to zostało unieruchomione na powierzchni cząstki agarozy magnetycznej o wielkości 50 μm, granica wykrywalności wynosiła 14,5 nM. Solidna odpowiedź sygnałowa tej sondy nieorganicznej, a także jej elastyczność stosowania w roztworze lub unieruchomionej na powierzchni, mogą znaleźć zastosowanie w różnych zastosowaniach, od zastosowań diagnostycznych po obrazowanie.

Jak pokazano na Rysunku 1, synteza kompleksu solwentowego Ir1 polegała na rozszczepieniu mostka chlorkowego w macierzystym dimerze poprzez wytrącenie chlorku w postaci nierozpuszczalnego AgCl i koordynację cząsteczek wody do centrum metalicznego. Powstanie Ir1 potwierdzono za pomocą H1NMR i ESI. Dodatkowo, w widmie przypisano pasma UV-visible charakterystyczne dla przeniesienia ładunku metal-ligand oraz przejść π-π*, co dodatkowo potwierdziło utworzenie Ir1. Ten solwatowany kompleks nie wykazuje właściwości emisyjnych przy wzbudzeniu przy 365 nm.
 
<img alt="Wykres widma emisji fluorescencji przedstawiający RFU w funkcji długości fali dla analizy fotonicznej." src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Synteza i charakterystyka Ir1. Reakcja rozszczepienia mostka chlorkowego dichlorotetrakis(2-(2-pirydylo)fenylo)diirydu(III) w celu otrzymania kompleksu aquo Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1). Po dodaniu L-His do kompleksu aquo w buforze wodnym aktywowany jest sygnał luminescencyjny.
Po syntezie i charakterystyce kompleksu przeanalizowano selektywność wobec aminokwasów, zgodnie z wcześniejszym opisem dla podobnego analogu irydu17. Rycina 2A pokazuje, że tylko histydyna wywołała sygnał odpowiedzi przy 510 nm, przy wzbudzeniu przy 365 nm.
 
<img alt="Wykres intensywności fluorescencji; RFU w funkcji stężenia peptydów bogatych w histydynę; wyniki analizy danych." src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Selektywność aminokwasowa i miareczkowanie Ir1 peptydami bogatymi w histydynę. (A) Oddziaływanie 200 µM różnych aminokwasów (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) z 50 µM Ir1 w buforze HBS. Skanowanie widma przeprowadzono w zakresie 400-700 nm przy długości fali wzbudzenia 365 nm w czarnej płytce 96-dołkowej. Sygnał w jednostkach względnej fluorescencji (RFU) dla wszystkich aminokwasów poza histydyną (czarna przerywana linia) był pomijalny. (B) Nanomolowe stężenia BNT-II (▪) i rcHRP-II (♦) miareczkowano za pomocą Ir1 w buforze HBS. Peptydy bogate w histydynę inkubowano z sondą przez 15 min w roztworze przed pomiarem emisji przy 510 nm po wzbudzeniu światłem o długości 365 nm. Granicę wykrywalności obliczono jako wartość x dla y = 3σblank.
To „włączenie” fosforescencji sondy z irydem następuje, ponieważ singletowy stan wzbudzony (1MLCT/1LC) biokoniugatu Ir(III) przechodzi przez przejście międzysystemowe w tripletowy stan wzbudzony (3MLCT), gdy histydyna koordynuje się z centrum metalicznym. Sondę tę zastosowano wobec BNT-II, peptydu naśladującego biomarker malarii Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pfHRP-II). W miareczkowaniu BNT-II za pomocą Ir1 zaobserwowano zależną od stężenia odpowiedź sygnału (Rycyna 2B). Rekombinowany HRP-II (rcHRP-II) wykazał również podobną odpowiedź w roztworze. Granice wykrywalności BNT-II i rcHRP-II w roztworze wynosiły odpowiednio 54,8 nM i 12,8 nM. Przy użyciu technik interferometrii warstw biologicznych ustalono, że KD wiązania Ir1 do BNT-II unieruchomionego na powierzchni Ni(II)NTA wynosi 2,05 µM (Rycina 3).
<img alt="Wykres powierzchniowego rezonansu plazmonowego przedstawiający kinetykę wiązania w czasie z oznaczonymi fazami A-E." src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 
Rycina 3: Analiza kinetyczna Ir1 z BNT-II w czasie rzeczywistym. Interferometria warstw biologicznych w analizie kinetycznej wiązania różnych stężeń Ir1 do BNT-II na powierzchni szklanego sensora Ni(II)NTA. Po zrównoważeniu sensorów w KB (obszar A), sensory są obciążone 0,5 µM BNT-II (obszar B). Po osadzeniu peptydu na sensorach ustalana jest linia bazowa (obszar C) przed pomiarem asocjacji Ir1 do BNT-II (obszar D). Po okresie asocjacji sensory są ponownie umieszczane w KB w celu pomiaru dysocjacji (obszar E). Cały proces analizy kinetycznej trwa mniej niż 30 min.
Podczas przejścia z testu w roztworze na platformę opartą na cząstkach magnetycznych, należało uwzględnić dodatkową złożoność wprowadzenia cząstek do układu. Z poprzednich badań wiadomo było, że cząstki te efektywnie wiążą biomarker malarii pfHRP-II.24 Czarne płytki fluorescencyjne sprawdzały się w opisanym powyżej teście w roztworze, jednak płytki białe były lepiej dostosowane do platformy detekcji na cząstkach, co przedstawiono na Rysunku 4A. W białej płytce światło jest odbijane z powrotem do próbki, co umożliwia lepszą absorbancję przez Ir1 związany z powierzchnią cząstki. W teście na cząstkach granica wykrywalności rcHRP-II została określona na poziomie 14,5 nM (Rysunek 4B). Granica wykrywalności rcHRP-II w roztworze oraz na koralikach była statystycznie taka sama w oparciu o nieparzysty test t (p = 0,731).
<img alt="Wykres RFU w funkcji stężenia rcHRP-II, test fluorescencyjny, analiza danych, trend liniowy, słupki błędów." src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
<img alt="Wykres RFU w funkcji stężenia rcHRP-II, test fluorescencyjny, analiza danych, trend liniowy, słupki błędów." src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5">
 
Rysunek 4: Detekcja BNT-II i HRP-II na ziarnach. (A) Różnica między sygnałem wykrytym z Ir1 związanego z BNT-II na powierzchni magnetycznych cząsteczek agarozy Ni(II)NTA o rozmiarze 50 µm w czarnej płytce 96-dołkowej (linia ciągła) a białą płytką 96-dołkową (linia przerywana). Cząsteczki były pobudzane światłem o długości fali 365 nm, a emisję mierzono przy 510 nm. (B) Miareczkowanie rcHRP-II unieruchomionego na cząsteczkach magnetycznych i wykrytego przy użyciu Ir1. Granica detekcji została obliczona jako wartość x, gdy y = 3σblank.
<img alt="Wykres RFU w funkcji stężenia rcHRP-II, test fluorescencyjny, analiza danych, trend liniowy, słupki błędów." src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5">
Rysunek 5: Schematyczne przedstawienie detekcji rcHRP-II na ziarnach przy użyciu Ir1.Ogólny schemat wiązania HRP-II do powierzchni cząsteczek Ni(II)NTA i znakowania ich Ir1. Cząsteczki inkubuje się z peptydem bogatym w histydynę przez 15 min. Po tym okresie inkubacji cząsteczki przemywa się buforem HBST z wykorzystaniem magnesu, aby oddzielić cząsteczki od roztworu. Na koniec cząsteczki z przywiązanym peptydem inkubuje się z Ir1 przez 1 hr przed odczytem emisji przy 510 nm po wzbudzeniu światłem o długości 365 nm.

Solidne odczynniki do wykrywania stają się coraz bardziej niezbędne do opracowania nowych narzędzi diagnostycznych malarii. Zaprojektowano sondę irydową(III), która emituje długotrwały sygnał luminescencyjny w obecności bogatego w histydynę biomarkera białka malarii. Wykrywanie białka zarówno w roztworze, jak i unieruchomionego na cząstce magnetycznej zapewnia elastyczność w zastosowaniu.

Sonda luminescencyjna Iridium(III) do wykrywania biomarkera białka malarii Histidine Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie obecności biomarkera białka malal bogatego w histydynę w próbce przy użyciu fosforescencyjnej sondy irydowej. Osiąga się to najpierw poprzez syntezę cyklometalowanego kompleksu irydu. Po szybkim rozszczepieniu mostka chlorkowego kompleksu dimerowego wyjściowego, cyklometalowany kompleks irydu może zostać wyizolowany i oczyszczony do zastosowania w analizie.Drugim krokiem jest walidacja oddziaływań sondy z różnymi aminokwasami w celu zapewnienia jej specyficzności. W przypadku samej histaminy sygnał fosforescencyjny jest aktywowany wyłącznie w obecności histaminy i jest obserwowany za pomocą spektroskopii luminescencyjnej. Następnie, jako dowód koncepcji, przeprowadza się miareczkowanie sondy irydowej peptydowym mimetykiem biomarkera malarii, białka bogatego w histydynę dwa (histidine rich protein two), aby określić granice wykrywalności w roztworze.Dodatkowo, za pomocą interferometrii warstw biologicznych wyjaśniono kinetykę oddziaływania sondy z peptydem. Ostatnim krokiem jest unieruchomienie rekombinowanego białka bogatego w histydynę na powierzchni magnetycznych cząsteczek niklu NTA oraz ocena granicy wykrywalności tego białka przy użyciu sondy. Ostatecznie wykorzystano luminometrię i spektroskopię, aby wykazać, w jaki sposób białka mogą być wykrywane na powierzchni stałego nośnika przy użyciu nowej klasy fosforescencyjnych sond irydowych.Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie białkami fluorescencyjnymi i testy immunoenzymatyczne, są wysoka stabilność sondy, szybka kinetyka asocjacji oraz odporność na fotoblaknięcie. Ponadto technika ta nie wymaga tak długiego czasu oczekiwania, jak w przypadku testów immunoenzymatycznych.Znaczenie tej techniki wykracza w stronę diagnostyki zakażeń malarią. Wynika to z wysokiej zawartości histydyny w biomarkerze białkowym zakażeń SRO spowodowanych przez plasmodium, nazywanym białkiem bogatym w histydynę 2. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy publikację artykułu opisującego wykorzystanie cyklometalowanej sondy irydowej do barwienia żywych komórek.W niniejszej pracy stwierdzono, że sonda przenika do żywej komórki i rozświetla jądra poprzez wiązanie się z białkami bogatymi w histydynę. Biorąc pod uwagę naturę biomarkera MAL, białka bogatego w histydynę 2, zdecydowaliśmy się wykorzystać tę sondę do wykrycia badanego białka. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa ze względu na złożoność analizy oraz liczne etapy płukania i przenoszenia niezbędne do wykrycia białka docelowego na cząsteczce. Aby rozpocząć, odważ 53,6 mg dimeru irydu wyjściowego i rozpuść w 5 ml chlorku metylenu.Przenieś ten roztwór do kolby Lummi o pojemności 50 mililitrów wyposażonej w mieszadło magnetyczne w kształcie gwiazdy. Następnie odważ 26,2 miligramów silver FL i rozpuść w pięciu mililitrach metanolu. Dodaj rozpuszczony silver FL do macierzystego roztworu dimeru irydu i mieszaj przez jedną godzinę.Po jednej godzinie powinna powstać zawiesina o kremowym kolorze; należy przefiltrować zawiesinę przez żel krzemionkowy do kolby filtracyjnej. Przenieść przefiltrowany produkt do fiolki DRAM o wymiarach 25 by 95 mm i odparować pozostały rozpuszczalnik za pomocą rotacyjnego odparowacza przez 5 to 10 minut. Po usunięciu większości rozpuszczalnika należy sprawdzić, czy w fiolce pozostała oleista, żółta pozostałość.Do otrzymanego osadu należy dodać 1 ml metanolu, aby rozpuścić produkt. Pozostawić go na jeden do dwóch dni w celu uzyskania żółtego ciała stałego, a następnie scharakteryzować produkt zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zbadać oddziaływania sondy irydowej z różnymi aminokwasami. Do czarnej płytki 96-dołkowej należy pipetować po 100 µL każdego roztworu aminokwasów.Do płytki dodaj 100 µL soli fizjologicznej z buforem (HBS), która będzie służyć jako próba blank. Następnie do każdej próbki dodaj 2,5 µL przygotowanego 2 mM roztworu sondy irydowej i inkubuj płytkę na wytrząsarce przez 10 minut. Po upływie 10 minut zmierz widma emisji próbek przy użyciu czytnika płytek 96-dołkowych.Aby to zrobić, umieść płytkę w urządzeniu i otwórz oprogramowanie czytnika płytek, aby skonfigurować nowy eksperyment. Następnie przenieś próbki do przezroczystej płytki 96-dołkowej i zarejestruj obraz emisji przy użyciu transiluminatora UV, aby przeprowadzić miareczkowanie sondy irydowej rozgałęzionym mimetykiem peptydowym biomarkera malarii, białka bogatego w histaminę dwa BNT two. Najpierw przygotuj 1 mM roztwór zapasowy BNT two w HBS.Następnie wykonaj rozcieńczenia szeregowe roztworu BN T two zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do dołków płytki 96-dołkowej dodaj 100 µL każdego rozcieńczenia w trzech powtórzeniach, stosując HBS jako próbę ślepą; do każdej próbki dodaj 2,5 µL 2 mM sondy irydowej. Inkubuj płytkę przez 10 minut na wytrząsarce do płytek, a następnie zmierz intensywność emisji przy 510 nm za pomocą czytnika płytek 96-dołkowych.Na koniec przenieś próbki do przezroczystej płytki 96-dołkowej i wykonaj obrazowanie miareczkowania przy użyciu transiluminatora UV w celu przeprowadzenia analizy kinetycznej w czasie rzeczywistym za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Najpierw dodaj 200 µL buforu kinetycznego do ośmiu dołków w pierwszej kolumnie czarnej płytki 96-dołkowej. Po włożeniu płytki do plastikowego uchwytu na sensory, ostrożnie przenieś osiem biosensorów niklowych do pierwszej kolumny w plastikowym uchwycie w taki sposób, aby końcówki były zanurzone w dołkach z buforem.Następnie przymocuj do uchwytu plastikowego po lewej stronie instrumentu interferometrycznego nową czarną płytkę 96-dołkową i pipetuj 200 µL KB do wszystkich ośmiu dołków w kolumnach pierwszej i trzeciej tej samej płytki, a następnie pipetuj 200 µL 0,5 µM roztworu BNT two do dołków w kolumnie drugiej. Następnie pipetuj 200 µL każdego rozcieńczenia sondy irydowej do kolumny czwartej, zaczynając od KB jako próbki ślepej w dołku A4. Dodawaj rozcieńczenia w taki sposób, aby stężenie sondy irydowej wzrastało w dół kolumny.Umieść tę płytkę w urządzeniu po prawej stronie od płytki zawierającej sensory do wstępnego zwilżania w oprogramowaniu do interferometrii warstwy biologicznej. Skonfiguruj podstawowy eksperyment kinetyczny, definiując analizę na płytce oraz końcówki sensorów w celu określenia parametrów płytki; wybierz kolumnę na ekranie, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz odpowiednią definicję. Dla dołków wybierz bufor.W przypadku kolumn pierwszej i trzeciej ustaw ładowanie dla kolumny drugiej i próbki. Dla kolumny czwartej zdefiniuj analizę w następnej karcie, klikając najpierw dodaj równowagę. Ładowanie 60 sekund, 120 sekund.Asocjacja 120 sekund i dysocjacja 300 sekund. Wybierz krok równowagi i dwukrotnie kliknij w kolumnie pierwszej. Następnie wykonaj tę samą czynność dla ładowania w kolumnie drugiej, linii bazowej w kolumnie trzeciej, asocjacji w kolumnie czwartej i dysocjacji w kolumnie trzeciej.Na koniec wybierz sensory niklowe NTA. Potwierdź, czy opis eksperymentu jest prawidłowy. Wprowadź nazwę pliku.Upewnij się, że opcja eksperymentu z opóźnieniem (delay experiment) jest zaznaczona, a następnie naciśnij przycisk go. Po zakończeniu pomiaru kinetycznego przetwórz dane w dostarczonym oprogramowaniu, aby przeprowadzić detekcję na koralikach dla BNT two oraz rekombinowanego HRP two z użyciem sondy irydowej. Przygotuj rozcieńczenia seryjne BNT two oraz rekombinowanego HRP two zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie pipetuj 100 µL każdego rozcieńczenia w trzech powtórzeniach do białej płytki 96-dołkowej, rozmieszczając rozcieńczenia w kolejności od najniższego do najwyższego stężenia wzdłuż kolumny. Do każdego dołka z rozcieńczeniem pipetuj 10 µL 50 µm magnetycznych kulek niklowych NTA. Zwróć uwagę, aby kuleczki magnetyczne pozostały w zawiesinie podczas pipetowania. Jeśli zaczną osiadać, wymieszaj je pipetą lub w wirówce laboratoryjnej. Umieść płytkę na wytrząsarce na 15 minut, aby inkubować próbki z kuleczkami. Po tym czasie inkubacji umieść płytkę na magnesie do płytek 96-dołkowych i odczekaj 30 sekund, aż kuleczki zostaną wyciągnięte z roztworu.Za pomocą pipety wielokanałowej odessać pierwotną próbkę i zutylizować ją jako odpad, a następnie zdjąć płytkę z magnesu i dodać do każdej studni 200 µL buforu HBS z tweenem lub HBST. Używając pipety wielokanałowej, kilkukrotnie pipetować bufor w górę i w dół, aby wypłukać cząsteczki magnetyczne. Ponownie umieścić płytkę na magnesie i odczekać 30 sekund, aż cząsteczki zostaną wyciągnięte z roztworu.Za pomocą pipety wielokanałowej odessać 200 µL buforu i usunąć go jako odpad. Zdjąć płytkę z magnesu, a następnie powtórzyć etapy płukania dwukrotnie, aby w sumie trzykrotnie wypłukać cząstki. Następnie do każdej studni zawierającej cząstki magnetyczne dodać 100 µL HBST, a następnie 2,5 µL roztworu sondy irydowej o stężeniu 2 mM.Inkubować cząstki z sondą irydową na wytrząsarce płytkowej przez jedną godzinę. Po godzinie zmierzyć intensywność emisji przy 510 nanometrach, korzystając z czytnika płytek 96-dołkowych.Po syntezie i charakterystyce cyklometalowanej sondy irydowej, przetestowano reaktywność różnych aminokwasów z tym kompleksem. Tylko histydyna wywołuje sygnał w postaci względnych jednostek fluorescencji podczas miareczkowania sondy. W przypadku dwóch peptydów zawierających histaminę w roztworze, zaobserwowano odpowiedź zależną od stężenia.Odpowiedź tę można zaobserwować tutaj w szerokopasmowym świetle UV. Interferometria warstwy biologicznej w analizie kinetycznej różnych stężeń sondy irydowej wiążącej się z BNT dwa na powierzchni szklanego sensora niklu NT.A ujawnia, że sonda irydowa wykazuje powinowactwo mikromolarne do peptydów zawierających histydynę.Granica wykrywalności białka bogatego w histydynę przy użyciu sondy była podobna w przypadku, gdy białko zostało unieruchomione na powierzchni cząsteczki magnetycznej. Podobnie jak w roztworze, znakowanie białka można wizualizować na powierzchni samych cząsteczek po opanowaniu metody. Technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas etapów płukania i przenoszenia magnetycznych cząsteczek związanych z białkiem. Usunięcie niezwiązanego białka poprzez płukanie jest istotne dla prawidłowej detekcji unieruchomionego P-F-H-R-P two, projektując element rozpoznawania molekularnego, który będzie specyficznie celował w związane białko poprzez oddziaływania przeciwciało-antygen. Jednocześnie zastosowanie wytrzymałej sondy irydowej pozwoli na bardziej czułą i specyficzną detekcję białek związanych z powierzchnią cząsteczek po ich opracowaniu.Technika ta ma potencjał, aby utorować drogę badaczom z dziedziny diagnostyki do zbadania możliwości wykorzystania tak trwałych odczynników nie tylko w wykrywaniu malarii, ale i innych chorób zakaźnych.

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

System biosensingu z modulacją magnetyczną jest wykorzystywany do szybkiego, czułego i prostego wykrywania analiz biologicznych, takich jak cząsteczki DNA i białka.

Szybka homogeniczna detekcja w testach biologicznych z wykorzystaniem systemu biosensingu z modulacją magnetyczną

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Opisano niedrogą, wysokoprzepustową metodę jednoczesnego wykrywania do 43 celów molekularnych. Zastosowania mPCR/RLB obejmują typowanie mikrobiologiczne oraz wykrywanie wielu patogenów w próbkach klinicznych.

Wielokrotna reakcja łańcuchowa polimerazy i analiza hybrydyzacji w układzie reverse line blot (mPCR/RLB)

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Podczas gdy analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości oferuje możliwość różnicowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w heterogenicznej populacji, stronniczość amplifikacji zmutowanego allelu może zwiększyć jego zdolność do wykrywania alleli obecnych w stosunkowo niskich procentach w próbce. W tym protokole opisano ulepszenia, które poprawiają czułość analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Tutaj opisujemy procedurę pozwalającą na szczegółową analizę zależnej od fosforylacji aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał fosfospecyficznych.

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego Plasmodium falciparum w zakażonych czerwonych krwinkach wodnych za pomocą spektrometru podczerwonego o całkowitym odbiciu i wielowymiarowej analizy danych.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) to nowatorskie podejście do ilościowego wykrywania endogennych i egzogennie stosowanych wariantów białka MeCP2, które daje wysoce ilościowe, dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz- i międzytestowym w szerokim zakresie roboczym. W tym miejscu opisano protokół dla MeCP2-ECLIA w formacie 96-dołkowym.

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

Tutaj prezentujemy protokół do optycznego wykrywania informacji chemicznych o wysokiej rozdzielczości wokół wszczepionych urządzeń medycznych z obrazowaniem chemicznym wzbudzonym promieniowaniem rentgenowskim (XELCI). Ta nowatorska technika obrazowania została opracowana w naszym laboratorium, co umożliwia badanie biochemii zakażeń związanych z implantami.

Obrazowanie chemiczne infekcji związanych z implantami o wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą obrazowania chemicznego luminescencji wzbudzonej promieniowaniem rentgenowskim przez tkankę

Obecny protokół opisuje szczegółową operację obrazowania fluorescencyjnego NIR-II w czasie rzeczywistym myszy za pomocą urządzenia do obrazowania optycznego NIR-II.

Jasna sonda fluorescencyjna NIR-II do obrazowania naczyń krwionośnych i nowotworów

Poznaj metodę wykrywania biomarkera malarii HRP-II za pomocą sondy luminescencyjnej z irydem. Technika ta umożliwia szybką i niezawodną diagnostykę Plasmodium falciparum.

Sonda luminescencyjna Iridium(III) do wykrywania biomarkera białka malarii Histidine Rich Protein-II

Przeglądaj więcej filmów