Name: Protokół Denver Papillae do obiektywnej analizy brodawek grzybiczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj protokół Denver Papillae do obiektywnej analizy brodawek grzybiczych na języku. Ta metoda wykorzystuje barwienie niebieskim barwnikiem, klucz dikotomiczny i cyfrowe zdjęcia do standaryzacji pomiarów w badaniach nad percepcją smaku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Science Education Partnership Award (SEPA) R25 RR025066 w latach 2008-2012 od National Institutes of Health i National Center for Research Resources. Dziękujemy kolegom z branży smakowej za wnikliwą dyskusję na temat literatury, naszych wyników i informacji zwrotnych na temat stosowania DPP w różnych scenariuszach laboratoryjnych: John Hayes, Sue Coldwell, Paul Breslin, Carla Schubert. Dziękuję również kierownictwu Muzeum Przyrody i Nauki w Denver oraz personelowi wspierającemu naukę obywatelską w ramach Laboratorium Genetyki Smaku w ramach Expedition Health. Na koniec dziękujemy wszystkim naszym naukowcom-wolontariuszom za ich czas i poświęcenie na opracowanie i wykorzystanie tego protokołu, w tym: Bear Aragon, Mike Archer, Su Ataman, Michael Bagley, A'nette Bertrand, Diana Boyles, Wendy Covert, Sasha Dooley, Patty Drever, Jessica Ern, Laura Harmacek, Sean Hibbard, Joyce Hutchens, Matt Joo, Leta Keane, Willem Leenhouts, Stephania Lukjan, Ashley Matthews, Mike Mauser, Stephanie Miller, Hallie Morgan-Rodriguez, Griffin Scherma, Alyssa Schickedanz, Terri Simon, Dylan Thomas, Rudy Torres, Tyler Wilson, Diane Woltkamp.

Obrazy oceniane w niniejszym badaniu zostały zebrane w ramach szerszego badania nad smakiem, przeprowadzonego w Genetics of Taste Lab w Denver Museum of Nature &amp; Science (Muzeum)10. Podmiotami w szerszym badaniu byli goście muzeum (n = 1195) w wieku od 18 do 93 lat. Choć osoby badane pochodziły z sześciu z siedmiu kontynentów, uczestnicy wywodzili się głównie z populacji europejskiej. Dane każdego podmiotu zebrano podczas jednej, 30-minutowej sesji laboratoryjnej. Protokół został zatwierdzony przez Western Institutional Review Board, uzyskano pisemną świadomą zgodę, a podmioty poświęciły swój czas dobrowolnie i nie otrzymały wynagrodzenia za udział w badaniu.
1. Gromadzenie danych
<ol>
	<li>Przechwytywanie obrazów
	<ol>
		<li>Pokaż badanym fotografię przedstawiającą sposób ustawienia pozycji ciała (Rycina 1) oraz to, jak będzie wyglądać przechwycony obraz. 
		<img alt="Nie wiem, kim jest ta osoba, ale na tym obrazie nie ma rozpoznawalnej koncepcji naukowej ani konfiguracji, którą można by opisać tekstem alternatywnym zorientowanym na SEO i dostępność." src="/files/ftp_upload/52860/52860fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">Rycina 1: Pozycja podczas przechwytywania obrazu. Jest to fotografia pokazywana badanym w laboratorium GoT w celu prawidłowego ustawienia się do zdjęcia języka.</li>
		<li>Poleć badanym osuszenie języka papierowym ręcznikiem i pozostawienie go w wysunięciu z ust.</li>
		<li>Nanieś około 3 ml niebieskiego barwnika spożywczego w stężeniu 1:36 na wierzchołek języka, używając sterylnego aplikatora rayonowego z końcówką o długości 1 cala. Poproś badanych o schowanie języka do jamy ustnej i przełknięcie, aby usunąć nadmiar barwnika.</li>
		<li>Poproś badanych o przyjęcie pozycji przedstawionej na Rycynie 1, z podbródką opartą na dłoniach i łokciami wspartymi o stół dla zapewnienia stabilności. Poleć badanym wysunięcie języka na komfortową odległość i delikatne unieruchomienie go między zębami.</li>
		<li>Przyklej fragment papieru filtrującego o wymiarach 2.5 cm z wyciętym w nim okręgiem o średnicy 10 mm do końcówki przedniej części lewej strony języka, obok linii środkowej (patrz Rycina 1).</li>
		<li>Wykonaj co najmniej trzy zbliżenia języka, obejmując cały okrąg o średnicy 10 mm, aby zapewnić wizualizację wszystkich FP w tym obszarze. Użyj ustawienia makro wysokiej jakości cyfrowego aparatu kompaktowego zamocowanego na statywie dla stabilności.
		<ol>
			<li>Przybliż obraz do stopnia, w którym cały wycięty obszar zostanie sfotografowany, pozostając w zalecanym zakresie przybliżenia aparatu. Upewnij się, że płaszczyzna obiektywu aparatu jest równoległa do płaszczyzny języka i że wycięcie na zdjęciu ma kształt okrągły, a nie wydłużony. Przejrzyj zdjęcia, aby upewnić się, że są wysokiej jakości i przydatne do zliczania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór i przygotowanie obrazów
	<ol>
		<li>Prześlij zdjęcia na komputer.</li>
		<li>Z obrazów wykonanych językowi tego samego badanego wybierz tylko jeden do dalszej analizy, kierując się wyraźną definicją struktur na języku przy najwyższym przybliżeniu i najmniej zniekształconym kącie, tak aby język był szeroki i płaski względem aparatu.</li>
		<li>Otwórz wybrany surowy obraz w oprogramowaniu open source ImageJ. Kliknij „Plugins”, w menu rozwijanym przewiń do „Analyze” i kliknij „Cell Counter”. Po otwarciu licznika komórek kliknij „Initialize”, aby powiązać obraz z licznikiem. 
		Uwaga: W tym miejscu należy użyć ImageJ 1.45 sec z 32-bitową wersją Java 1.6.0_10.
		<ol>
			<li>Użyj standardowego powiększenia 50% dla zachowania spójności między osobami oceniającymi oraz do wykorzystania w kolejnych krokach oceny FP. Przesuń ten obraz na lewą stronę ekranu, obok licznika komórek. Obraz ten będzie określany jako Kopia A (patrz Rycina 2, lewa strona ekranu).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz drugą kopię surowego obrazu (kopia B) w celu pomiaru średnic kwantyfikowanych brodawek. Przybliżaj i oddalaj obraz zgodnie z preferencjami oceniającego w trakcie całego procesu oceny. Przesuń tę kopię na prawą stronę ekranu, aby dwie kopie nie zostały przypadkowo pomylone. (Patrz Rycina 2, prawa strona ekranu)</li>
	<li>Kliknij narzędzie linii. Korzystając z kopii B, przybliż obraz tak bardzo, jak to konieczne, aby dokładnie narysować średnicę wewnątrz 10 mm okręgu papieru filtrującego pod dowolnym kątem, a następnie kliknij „Analyze” i „Set Scale”. W polu „Known Distance” wpisz „10”. Zweryfikuj poprawność skali, mierząc pod innym kątem i upewnij się, że zakres średnicy mieści się w przedziale 9.8-10.2 mm. Jeśli tak nie jest, powtórz ten krok.</li>
</ol>
<img alt="Proces liczenia komórek w oprogramowaniu ImageJ; analiza obrazów mikroskopowych, cyfrowe dane pomiarowe." src="/files/ftp_upload/52860/52860fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Kopia A i Kopia B. Kopia A (po lewej) jest powiązana z oknem licznika komórek i pozostaje przy 50% powiększeniu w celu zachowania spójności między różnymi osobami oceniającymi, podczas gdy kopię B (po prawej) można powiększyć zgodnie z preferencjami danej osoby.
2. Punktacja FP z wykorzystaniem klucza dychotomicznego protokołu Denver Papillae
<ol>
	<li>Dla każdej potencjalnej brodawki należy zastosować poniższy klucz dychotomiczny (kroki 2.2-2.5), szczegółowo opisujący kryteria ustalenia, czy jest to FP. W celu wizualizacji brodawek zaklasyfikowanych jako FP oraz tych, które zostały odrzucone na każdym etapie procesu, należy odnieść się do Rysunku 3. 
	<img alt="Klasyfikacja morfologii cząstek; obraz mikroskopowy; FP, amorficzne, zmienność rozmiaru, analiza koloru." src="/files/ftp_upload/52860/52860fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3">Rysunek 3: FP a brodawki odrzucone. Rysunek 3a przedstawia język z kilkoma kwalifikującymi się FP, podczas gdy na 3b-3e zaznaczono obszary naruszające poszczególne reguły. (3b) obszar jest amorficzny; (3c) brodawki są zbyt małe; 3d) brodawka jest niebieska w porównaniu do otaczających ją struktur, (3e) brodawka jest zagłębiona w stosunku do otaczających ją struktur.</li>
	<li>Kształt
	<ol>
		<li>Należy ustalić, czy potencjalna brodawka jest amorficzna (bezkształtna). Przy powiększeniu 50% należy sprawdzić, czy występuje powszechnie rozpoznawalny kształt geometryczny (owalny, kostkowy, okrągły).</li>
		<li>Jeśli występuje kształt geometryczny (patrz Rysunek 3a), należy przejść do kroku 2.3.</li>
		<li>Jeśli nie występuje kształt geometryczny (patrz Rysunek 3b), należy przejść do okna licznika komórek i kliknąć „Type 1”. Na kopii A (powiększenie 50%) należy kliknąć potencjalną brodawkę, aby oznaczyć ją jako amorficzną i niebędącą FP. Klikanie typów 1-4 w tym i kolejnych krokach pozwala oceniającym upewnić się, że przeanalizowano wszystkie potencjalne brodawki, oraz kategoryzuje, która reguła została naruszona przy odrzuceniu struktury, co ułatwi dyskusję w kroku 2.7.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolor
	<ol>
		<li>Należy odnieść się do kopii A przy powiększeniu 50% i ustalić, czy na powierzchni języka występuje jakiekolwiek zróżnicowanie kolorystyczne. Jeśli tak, należy kontynuować w kroku 2.3.2. Jeśli nie, koloru nie należy traktować jako czynnika decydującego; należy przejść do kroku 2.4.</li>
		<li>Należy ustalić, czy potencjalna brodawka jest jaśniejsza od otaczającej ją tkanki lub brodawek (patrz Rysunek 3a). Jeśli jakakolwiek część potencjalnej brodawki pozostała różowa lub została zabarwiona jaśniej, należy przejść do kroku 2.4.</li>
		<li>Jeśli potencjalna brodawka jest niebieska, a otaczające ją brodawki są jaśniejsze (patrz Rysunek 3c), należy przejść do okna licznika komórek i kliknąć „Type 2”. Na kopii A należy kliknąć potencjalną strukturę, aby oznaczyć ją jako zbyt niebieską i niebędącą FP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmiar
	<ol>
		<li>Korzystając z kopii B, należy powiększyć obraz do stopnia, w którym można wyraźnie dostrzec obrys potencjalnej brodawki.</li>
		<li>Należy wybrać narzędzie linii i zmierzyć najdłuższy wymiar potencjalnej brodawki. Należy kliknąć „Analyze”, a następnie „measure”. Jeśli zmierzona długość wynosi 0.5 mm lub więcej (patrz Rysunek 3a), należy przejść do kroku 2.5.</li>
		<li>Jeśli zmierzona długość wynosi 0.499 mm lub mniej, należy zmierzyć ją ponownie, aby upewnić się co do dokładności. Jeśli nadal wynosi 0.499 mm lub mniej (patrz Rysunek 3d), należy kliknąć „Type 3” w oknie licznika komórek, a na kopii A kliknąć potencjalną brodawkę, aby oznaczyć ją jako zbyt małą i niebędącą FP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zagłębienie
	<ol>
		<li>Korzystając z kopii A, należy ocenić, czy potencjalna brodawka ma wysokość wyrównaną z resztą języka lub jest wyniesiona. Jeśli brodawka znajduje się w zagłębieniu, należy określić jej wysokość w stosunku do innych struktur w tym zagłębieniu, a nie względem powierzchni języka. Jeśli brodawka jest niższa od otaczających ją brodawek (patrz Rysunek 3e), należy wybrać „Type 4” i na kopii A kliknąć potencjalną brodawkę, aby oznaczyć ją jako zagłębioną i niebędącą FP.</li>
		<li>Jeśli potencjalna brodawka ma wysokość wyrównaną z resztą języka lub jest wyniesiona (patrz Rysunek 3a), należy użyć „Type 5”, kliknąć ją i oznaczyć jako FP. Suma dla typu 5 stanowi surowy wynik FP. Na tym etapie nie należy zamykać kopii, ponieważ ImageJ nie zapisuje wyników w liczniku komórek ani kolorowych oznaczeń typów 1-5 na kopii A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisywanie kopii A
	<ol>
		<li>Należy zapisać surowy wynik FP w notatniku.</li>
		<li>W oknie licznika komórek należy kliknąć „Export Image”. Plik należy zapisać zgodnie z przyjętym w laboratorium systemem nazewnictwa. Pozwoli to na ponowne otwarcie kopii A w przyszłości z zachowaniem kolorowych oznaczeń typów 1-5. Nie zapisze to jednak surowego wyniku FP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola jakości
	<ol>
		<li>Każde zdjęcie powinno zostać ocenione przez dwóch niezależnych oceniających, a następnie wyniki należy porównać7.</li>
		<li>Jeśli wyższy surowy wynik FP mieści się w granicach 10% niższego surowego wyniku FP, należy wyciągnąć średnią z obu wyników w celu uzyskania konsensusowego wyniku FP. Jeśli dwa surowe wyniki FP różnią się o więcej niż 10%, należy wyświetlić oba ocenione zdjęcia na ekranie.
		<ol>
			<li>Należy wykorzystać typy licznika 1-4, aby pomóc w dyskusji nad rozbieżnościami i uzgodnić ostateczny wynik konsensusowy. Jeśli podczas dyskusji nie uda się osiągnąć konsensusu, należy zrobić przerwę w ocenie. W późniejszym czasie należy ponownie ocenić obraz i przedyskutować wynik. Jeśli konsensus nadal nie zostanie osiągnięty, należy zaprosić trzeciego oceniającego. Należy poprosić go o ocenę obrazu i przeprowadzenie dialogu z pozostałą dwójką.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Szkolenie oceniających w zakresie stosowania DPP
<ol>
	<li>Informacje o szkoleniu
	<ol>
		<li>Dwóch oceniających zliczyło różnorodne obrazy, dokonując pomiarów indywidualnie i regularnie konsultując się, aby upewnić się, że stosują te same kryteria. Metodę (sfinalizowaną powyżej) uznano za akceptowalną i określono mianem DPP dopiero wtedy, gdy indywidualne wyniki zliczeń dla każdego obrazu były konsekwentnie zbliżone do siebie w granicach 10%.</li>
		<li>Wybierz 15 obrazów oficjalnych i 15 obrazów treningowych (Ryciny uzupełniające 2-17) do oceny w kolejności sekwencyjnej. Jeśli wybrany obraz zostanie uznany za niezliczalny, pomiń go i wybierz kolejny obraz w sekwencji. 
		Uwaga: Obrazy te różnią się jakością i rozmiarem, ponieważ zostały wybrane w czasie, gdy laboratorium wciąż opanowywało prawidłową technikę fotografowania. Jeden z wybranych obrazów uznano za niezliczalny w procesie pierwotnego zliczania, ale pozostawiono go, aby upewnić się, że oceniający potrafią podjąć taką decyzję w razie potrzeby. W związku z tym stażystom przekazano 16 obrazów, mimo że tylko 15 z nich podlega ocenie.</li>
		<li>Z wykorzystaniem DPP wyżej wspomniani oceniający zliczyli 15 obrazów treningowych i ustalili dla każdego z nich wynik konsensusowy.</li>
		<li>Przekaż stażystom 15 obrazów oficjalnych i poproś o ich ocenę zgodnie z metodą Millera i Reedy'ego w celu stworzenia punktu odniesienia. Zapisz wyniki. Przeprowadź szkolenie grupowe zgodnie z krokiem 3.2. Po zakończeniu kroku 3.2 poproś oceniających o ponowne ocenienie 15 obrazów oficjalnych i zapisz ich wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szkolenie kolejnych oceniających w zakresie DPP
	<ol>
		<li>Przekaż szkolącym się pierwszy obraz treningowy i zademonstruj metodę DPP dla kilku brodawek na tym obrazie. Omów powody wyboru lub odrzucenia każdej brodawki jako FP. Pozwól stażystom kontynuować ćwiczenia z oceniania pozostałej części zdjęcia i porównać wynik z liczbą konsensusową (liczbę konsensusową laboratorium GoT oraz markery Typu 1-5 przedstawiono na Rycini uzupełniającej 1). W przypadku tego zdjęcia omów wszelkie rozbieżności, niezależnie od progu 10%, aby zapewnić zrozumienie DPP.</li>
		<li>Przekaż kolejnym oceniającym drugi obraz treningowy i poproś o jego ocenę przy użyciu DPP.</li>
		<li>Jeśli surowy wynik FP stażysty mieści się w granicach dziesięciu procent ustalonego zliczenia konsensusowego z sekcji 3.1.3., pozwól stażyście przejść do następnego obrazu i powtórzyć kroki.</li>
		<li>Jeśli wynik wykracza poza zakres dziesięciu procent, wykorzystaj kolorowe oznaczenia stażysty reprezentujące typy 1-5, aby zrozumieć i zidentyfikować niespójność, a następnie wyjaśnij rozbieżności w rozumieniu DPP.</li>
		<li>Daj stażyście możliwość ponownej oceny obrazu i ponownie zweryfikuj nowy wynik. W przypadku sukcesu stażysta przechodzi do następnego obrazu, aż do ukończenia wszystkich zdjęć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miller, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+taste+bud+density+across+adult+age+groups%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Human taste bud density across adult age groups.</a> J Gerontol. 43 (1), B26-B30 (1988).</li>
<li>Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fungiform+papillae+and+taste+pores+in+living+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Quantification of fungiform papillae and taste pores in living human subjects.</a> Chem Senses. 15 (3), 281-294 (1990).</li>
<li>Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+Human+Taste+Bud+Density+and+Taste+Intensity+Perception%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Variations in Human Taste Bud Density and Taste Intensity Perception.</a> Physiol Behav. 47 (6), 1213-1219 (1990).</li>
<li>Shahbake, M., Hutchinson, I., Laing, D. G., Jinks, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+assessment+of+fungiform+papillae+density+in+the+human+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative assessment of fungiform papillae density in the human tongue.</a> Brain Res. 1052 (2), 196-201 (2005).</li>
<li>Bartoshuk, L. M., Duffy, V. B., Miller, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC%2FPROP+tasting%3A+anatomy%2C+psychophysics%2C+and+sex+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">PTC/PROP tasting: anatomy, psychophysics, and sex effects.</a> Physiol Behav. 56 (6), 1165-1171 (1994).</li>
<li>Essick, G. K., Chopra, A., Guest, S., McGlone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lingual+tactile+acuity%2C+taste+perception%2C+and+the+density+and+diameter+of+fungiform+papillae+in+female+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Lingual tactile acuity, taste perception, and the density and diameter of fungiform papillae in female subjects.</a> Physiol Behav. 80 (2-3), 289-302 (2003).</li>
<li>Delwiche, J. F., Buletic, Z., Breslin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+papillae+number+to+bitter+intensity+of+quinine+and+PROP+within+and+between+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Relationship of papillae number to bitter intensity of quinine and PROP within and between individuals.</a> Physiol Behav. 74 (3), 329-337 (2001).</li>
<li>Kim, U. K., Jorgenson, E., Coon, H., Leppert, M., Risch, N., Drayna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+human+quantitative+trait+locus+underlying+taste+sensitivity+to+phenylthiocarbamide%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the human quantitative trait locus underlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide.</a> Science. 299 (5610), 1221-1225 (2003).</li>
<li>Hayes, J. E., Bartoshuk, L. M., Kidd, J. R., Duffy, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supertasting+and+PROP+bitterness+depends+on+more+than+the+TAS2R38+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Supertasting and PROP bitterness depends on more than the TAS2R38 gene.</a> Chem Senses. 33 (3), 255-265 (2008).</li>
<li>Garneau, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowdsourcing+taste+research%3A+genetic+and+phenotypic+predictors+of+bitter+taste+perception+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Integr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Crowdsourcing taste research: genetic and phenotypic predictors of bitter taste perception as a model.</a> Front Integr Neurosci. 8 (33), (2014).</li>
<li>Fox, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+chemical+constitution+and+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The relationship between chemical constitution and taste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 18 (1), 115-120 (1932).</li>
<li>Tepper, B. J., Nurse, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+Perception+is+related+to+PROP+taster+status%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Fat Perception is related to PROP taster status.</a> Physiol Behav. 61 (6), 949-954 (1997).</li>
<li>Duffy, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+receptor+gene+%28TAS2R38.%29%2C+6-n.-Propylthiouracil+%28PROP%29+bitterness+and+alcohol+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Bitter receptor gene (TAS2R38.), 6-n.-Propylthiouracil (PROP) bitterness and alcohol intake.</a> Alcohol Clin Exp Res. 28 (11), 1629-1637 (2004).</li>
<li>Yackinous, C., Guinard, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+between+PROP+taster+status+and+fat+perception%2C+touch%2C+and+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Relation between PROP taster status and fat perception, touch, and olfaction.</a> Physiol Behav. 72 (3), 427-437 (2001).</li>
<li>Fischer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+related+to+fungiform+papillae+density%3A+The+Beaver+Dam+Offspring+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Factors related to fungiform papillae density: The Beaver Dam Offspring Study.</a> Chem Senses. 38 (8), 669-677 (2013).</li>
<li>Feeney, E. L., Hayes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+suprathreshold+intensity+for+bitter+and+umami+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosens+Percept%22%5BJournal%5D)">Regional differences in suprathreshold intensity for bitter and umami stimuli.</a> Chemosens Percept. 7 (3-4), 147-157 (2014).</li>
<li>Saito, T., Narita, N., Yamada, T., Manabe, Y., Ito, T. Morphology of human fungiform papillae after severing chorda tympani nerve. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaito%2C+T+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22">Ann Otol Rhinol Laryngol</a>. 120 (5), 300-306 (2011).</li>
<li>Miller, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+peripheral+taste+system%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Olfaction+and+Gustation%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the peripheral taste system.</a> Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. L. , Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).</li>
<li>Cheng, L. H. H., Robinson, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+fungiform+papillae+and+taste+buds+on+the+human+tongue%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">The distribution of fungiform papillae and taste buds on the human tongue).</a> Arch Oral Biol. 36 (8), 583-539 (1991).</li>
<li>Cruickshanks, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+taste+impairment+in+epidemiologic+studies-The+Beaver+Dam+Offspring+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Measuring taste impairment in epidemiologic studies-The Beaver Dam Offspring Study.</a> Ann N Y Acad Sci. 1170, 543-552 (2009).</li>
<li>McNamara, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Taste+summative+evaluation+report+prepared+for+Denver+Museum+of+Nature+%26+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Independent+Evaluator%22%5BJournal%5D)">Genetics of Taste summative evaluation report prepared for Denver Museum of Nature & Science.</a> Independent Evaluator. , Chicago IL. (2012).</li>
<li>Arvidson, K., Friberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+taste%3A+Response+and+taste+bud+number+in+fungiform+papillae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human taste: Response and taste bud number in fungiform papillae.</a> Science. 209 (4458), 807-808 (1980).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Korzystając z DPP, wariancja w liczbie obrazów między niezależnymi punktorami i w obrębie punktatorów znacznie się zmniejszyła. Chociaż metoda ta sprawia, że wizualna analiza gęstości FP bez wideomikroskopii jest mniej subiektywna, należy zauważyć, że metoda ta ocenia tylko FP. DPP nie może zagwarantować, że struktury sklasyfikowane jako FP mają pory smakowe, a zatem są brodawkami smakowymi, ani że liczby odzwierciedlają rzeczywistą gęstość kubków smakowych20,23. Natura tej metody polega na tym, że zapewnia niezawodność poprzez spójność i precyzję; Jednak może to być stronnicze wyniki w spójnym kierunku. Testowanie dokładności w stosunku do innych metod wykorzystujących prawdziwy pomiar gęstości kubków smakowych (np. wideomikroskopia) wykraczałoby poza zakres tego badania. Jednakże, poprzez bardziej rygorystyczne scharakteryzowanie morfologii FP i stworzenie klucza dychotomicznego, metoda ta odpowiada na zarzut Millera i Reedy'ego dotyczący dziedziny, że należy przeprowadzić więcej charakterystyki FP, aby uzyskać konsensus co do ich morfologii i kwantyfikacji2. Ponadto wskazali, że ta charakterystyka może "wyjaśnić niektóre różnice między badanymi i wyjaśnić niektóre z rozbieżnych wyników wśród badaczy2". Zapewniając jednolitą metodę kwantyfikacji, wiele rozbieżności dotyczących roli FP w badaniach związanych ze smakiem i odżywianiem może zostać skorygowanych.
Klucz dychotomiczny można dostosować do różnych technik przechwytywania obrazu. Znaną odległość dla skali pomiarowej można łatwo ustawić na średnicę używaną w każdym laboratorium, a recesję można zdyskontować, jeśli na język umieszczono folię saran lub szkło w celu uchwycenia obrazu. W laboratorium GoT stwierdzono, że neutralny język zapewnia najlepszą definicję brodawek. Może to być spowodowane ilością światła w laboratorium, która powodowała, że folia saran lub szkło odbijały światło z powrotem do kamery, tworząc odblaski, które utrudniały ocenę. Niektóre laboratoria stwierdziły, że barwnik jest trudniejszy do policzenia, ale laboratorium GoT stwierdziło, że rozcieńczony niebieski barwnik spożywczy o stężeniu 1:36 zapewnia idealny kontrast między brodawkami grzybowatymi i nitkowatymi na większości języków.
Stworzenie dychotomicznego klucza do charakterystyki FP pozwoli badaczom z różnych laboratoriów, przy użyciu różnych metod przechwytywania obrazu, na konsekwentną analizę struktur na języku i pewność co do raportowania ich wyników. Wreszcie, użycie klucza dychotomicznego może mieć zastosowanie w innych obszarach metodologii naukowej, w których cechy struktur lub obiektów dostarczają niespójnych liczb z badania na badanie.

Brodawki to widoczne guzki na powierzchni języka. Istnieją cztery rodzaje brodawek: grzybowate (FP), foliatywne, obwodowe i nitkowate. Podczas gdy brodawki nitkowate są rozmieszczone na powierzchni języka, okołokształtne są zlokalizowane tylko z tyłu języka, a liście znajdują się po bokach. Natomiast FP znajdują się w przedniej części języka. Brodawki FP, foliowe i okołobrzegowe są uważane za smakowe, ponieważ mogą zawierać kubki smakowe, podczas gdy nitkowate nie. Kubki smakowe to skupiska komórek odpowiedzialnych za wykrywanie chemicznych degustatorów i przekształcanie bodźców w sygnał smakowy w mózgu. Cząsteczki śliny i pokarmu dostają się do kubków smakowych przez otwory zwane porami smakowymi, w których cząsteczki smaku mają potencjał aktywacji komórek smakowych.
Interesujące, istnieją duże indywidualne różnice w gęstości kubków smakowych, co po raz pierwszy zaobserwowano w badaniu histologicznym języków z 18 zwłok (Miller, 1988)1. Same kubki smakowe nie są widoczne na powierzchni języka, jednak pory smakowe są widoczne przy użyciu odpowiednich technik powiększania, oświetlenia i barwienia, co skłoniło Millera i Reedy'ego (1990) do opracowania metody identyfikacji porów smakowych i brodawek grzybowatych za pomocą wideomikroskopii u żywych ludzi2. Wiele laboratoriów zmodyfikowało swoją oryginalną technikę wideomikroskopii, wykorzystując nieruchome zdjęcia i niewielkie lub żadne powiększenie. Ponieważ jednak brodawki grzybowate są znacznie łatwiejsze do wizualizacji niż pory przy użyciu tych ostatnich technik, laboratoria zwróciły się do liczenia brodawek grzybowatych zamiast porów smakowych. Zakłada się przy tym, że gęstość brodawek grzybowatych jest rozsądną miarą zastępczą gęstości porów smakowych, mimo że wiele brodawek grzybowatych nie zawiera porów smakowych ani kubków smakowych3; FP są nie tylko bardziej widoczne i dostępne niż brodawki okołolistne i liściaste, ale ich rejestracja obrazu jest mniej czasochłonna niż analiza porów smakowych za pomocą alternatywnej metody wideomikroskopii2,4. W 1990 roku Miller i Reedy wykorzystali tę technikę, aby odkryć, że gęstości porów smakowych są skorelowane z gęstościami FP3, co zostało następnie potwierdzone w Bartoshuk i wsp.5 Oprócz tego anatomicznego związku, Miller i Reedy odkryli również, że 8 osób w górnej połowie rozkładu gęstości porów smakowych oceniło również sacharozę, NaCl i propylotiouracyl (PROP) jako znacznie bardziej intensywne niż pozostałe8 osób. Późniejsze prace Bartoshuka i wsp. (1994) zaobserwowały korelację między ponadprogową intensywnością smaku PROP a gęstością brodawek grzybowatych, a także gęstością porów smakowych u 42 osób5. Ta wygodna metoda doprowadziła do wpływowych badań donoszących, że osoby, których język ma wiele brodawek, wywołują silniejszą reakcję na wiele degustacji, w tym gorzkie degustatory fenylotiokarbamid (PTC) i PROP 6,7.
PTC i PROP są dobrze przebadanymi degustatorami, często używanymi ze względu na wyraźny związek między fenotypem wrażliwości smakowej danej osoby a jej genotypem. Badania populacyjne wykazały, że osoby, które mają homozygotyczny recesywny diplotyp genu, TAS2R38, mają znacznie niższą wrażliwość na PROP niż nosiciele dominującego lub heterozygotycznego wariantu genu8-10. To dziedziczne zjawisko zostało po raz pierwszy opisane w 1932 roku, kiedy Arthur L. Fox ogłosił swoje odkrycie "ślepoty smakowej" PTC11. Wśród osób, które są w stanie posmakować tych gorzkich związków, intensywność zgłaszanego smaku może wahać się od lekko nieprzyjemnego do rozdzierająco gorzkiego6. Aby wyjaśnić wariancję, której nie można wyjaśnić za pomocą TAS2R38, wysunięto teorię, że można ją przypisać gęstości FP na języku4.
Wraz z postępem badań nad smakiem, dziedzina ta została podzielona na dwie szkoły myślenia wokół tej teorii dotyczącej roli FP i wrażliwości na gorzki smak. Chociaż wiele badań potwierdziło pierwotne twierdzenie, że gęstość FP jest czynnikiem wpływającym na czułość PROP4,6,12,13, istniała niewielka, ale ważna ewentualność, która znalazła dowody na jego obalenie, zgłaszając niezdolność do odtworzenia roli10,14,15,16. Delwiche i wsp. (2001) ostrzegał, że tendencja jest bardzo zmienna; Gęstość FP nie uwzględnia jednolicie różnic we wrażliwości na gorycz u badanych i była możliwa do wykazania tylko dla osób o co najmniej umiarkowanej wrażliwości na PROP7. Oprócz zastosowania mniej rygorystycznie zdefiniowanej metody Millera i Reedy'ego dotyczącej ilościowego oznaczania FP, ważne jest, aby zauważyć, że z wyjątkiem Beaver Dam Offspring Study15 przeprowadzonego przez Fischera i wsp., większość z powyższych badań miała małe rozmiary próby, co może również przyczyniać się do niespójnych ustaleń dotyczących roli FP w smaku.
Krótko mówiąc, w przełomowym artykule metodologicznym Millera i Reedy'ego (1990), autorzy zabarwili języki na niebiesko, aby określić ilościowo FP, ponieważ FP pozostają różowe, podczas gdy brodawki nitkowate wchłaniają barwnik i zmieniają kolor na niebieski. Sklasyfikowali FP jako "zaokrąglone różowe struktury o średnicy około 0,5 mm"2. Podczas gdy autorzy zalecili, aby przed zastosowaniem tej metody do dalszych prac analitycznych charakterystyki FP zostały ściślej zdefiniowane i doszli do wniosku, że zmienność już odnotowana w literaturze "może być przypisana różnym populacjom badanych, różnym metodom i różnym badaczom"2, ich badania doprowadziły do powszechnie akceptowanych cech, że FP są okrągłe17,18, duży2, różowy lub poplamiony jaśniejszy2 i podwyższony4. Na pierwszy rzut oka cechy te wydają się bardzo proste. W Laboratorium Genetyki Smaku (GoT Lab lub Lab) stosowanie metody było skomplikowane ze względu na indywidualne próby oceny kwalifikacji i priorytetyzacji ważności powyższych cech, gdy niektóre, ale nie wszystkie, cechy były obecne. Powikłania te obejmowały małe brodawki, które wydawały się różowe pośród znacznie większych brodawek; cały język wchłania niebieski barwnik, eliminując w ten sposób klasyfikację na podstawie zmienności koloru; podłużne brodawki zamiast okrągłych; i języki bez różnic w wysokości, co przyczyniło się do tego, że strzelcy zgłaszali bardzo zróżnicowane liczby FP tego samego obrazu.
Te różnice w analizie skłoniły nas do przejrzenia literatury w celu określenia subiektywności, zidentyfikowania wszelkich wyjątków od powszechnie akceptowanych cech FP i ostatecznie opracowania protokołu do dokładnego i obiektywnego zdefiniowania i oceny FP.
Po pierwsze, kształt FP jest opisany w literaturze jako zaokrąglona, przypominająca grzyba struktura17,18. Wspomniano jednak również o godnych uwagi wyjątkach. Miller podkreślił, że termin "forma grzyba" jest mylący i że wiele FP nie ma kształtu grzyba, ale może się znacznie różnić pod względem wielkości i morfologii18. Melis i wsp. (2013) opisał również kilka brodawek, które uznano za "zniekształcone", gdzie średnica FP w jednym kierunku była co najmniej o dwa odchylenia standardowe większa niż w innym kierunku19. Co więcej, Cheng i Robinson odkryli, że wskazując FP poprzez barwienie, wahały się one od płaskiego wierzchołka do wydłużonego wyglądu20. Biorąc pod uwagę powyższe wyjątki, charakterystyka FP jako okrągłego i w kształcie grzyba wydaje się zbyt wąską definicją.
Po drugie, kolor FP jest opisany jako "różowe kółka na niebieskim tle"7 po zabarwieniu języka niebieskim barwnikiem. Chociaż barwienie jaśniejszym było najbardziej konsekwentnym kryterium FP w całej literaturze, nadal nie było to jednolite kwalifikatory. Cheng i Robinson zaobserwowali, że FP nie zawsze były lekko zabarwione, co utrudniało identyfikację i czyniło ją niepewną. Wydaje się więc, że języki inaczej wchłaniają barwnik i chociaż kontrast jest widoczny na wielu językach, niektóre stają się całkowicie niebieskie bez rozróżnienia, podczas gdy inne natychmiast tracą jakikolwiek ślad niebieskiego barwnika21.
Trzecia cecha, rozmiar FP, był dość spójny wśród papierów, wahając się od 0,5 mm do 0,97 mm6,18. W literaturze Miller zauważył, że na grzbietowej przedniej stronie języka występują dwa zakresy wielkości brodawek. Brodawki o większych średnicach były głównie brodawkami grzybowatymi i stożkowatymi, podczas gdy brodawki o mniejszej średnicy były przeważnie nitkowate18. Jednakże, z wyjątkiem badania Beaver Dam Offspring Study21, rozmiar nie wydaje się określać, czy struktura jest FP w literaturze, ale został podany dla brodawek już sklasyfikowanych jako "grzybowate".
Na koniec, wysokość jest wymieniona jako czwarta cecha FP4, chociaż Miller zauważył, że rozróżnienie między brodawkami nitkowatymi i grzybowatymi jest trudne, gdy używa się tego kryterium w pobliżu krawędzi języka. Podał dwa przykłady FP, które różniły się znacznie wysokością, jeden miał 0,8 mm wysokości, podczas gdy drugi miał mniej niż 0,1 mm wysokości, ale nadal miał dwa pory smakowe, które były wyraźnie obserwowane18. Obserwacja ta była również kontynuowana i potwierdzona przez Shahbake i wsp.4
Te definicje i ich zgłoszone wyjątki pokazują, że branża smakowa już dawno dostrzegła niekonsekwencję w charakterystyce FP i niedociągnięcia powszechnie używanego protokołu od Miller & Reedy. Rzeczywiście, Miller i Reedy nawoływali do dalszego definiowania cech FP2. Postawiliśmy hipotezę, że osoby oceniające przypisywały różną wagę cechom i inaczej ustalały priorytety ich ważności, gdy brodawki nie spełniały wszystkich kryteriów, na przykład gdy brodawka była duża i miała kształt grzyba, ale była zabarwiona na niebiesko. Uznano, że badacze wcześniej opublikowanych badań prawdopodobnie zrobili to samo, co w połączeniu z małą liczebnością próby może tłumaczyć zróżnicowane wyniki wynikające z zastosowania tej metody.
Laboratorium GoT zajęło się tą luką w metodologii FP, opracowując wytyczne, które definiują każdą cechę za pomocą obiektywnych pomiarów i ustalają priorytety cech, aby wskazać, które mają pierwszeństwo w analizie. Tą metodą jest Denver Papillae Protocol (DPP), dychotomiczny klucz z wyraźną i wyraźną charakterystyką FP, aby zapewnić dokładne i powtarzalne zliczenia na podstawie cyfrowych zdjęć języka. DPP jest proponowaną metodą standaryzacji poprzednio stosowanej metody Millera i Reedy'ego, eliminując w ten sposób indywidualną interpretację i zapewniając bardziej spójne wyniki podczas analizy gęstości FP. W ten sposób DPP może być wykorzystany do bardziej wiarygodnego określenia roli FP w smaku.
Zdjęcia języka wykonane badanym zostały przeanalizowane przez naukowców obywatelskich (oceniających) z Laboratorium, którzy są prawdziwymi obiektami tego badania. Trzon Laboratorium stanowią naukowcy obywatele-naukowcy w różnym wieku (lata) od 16 do połowy lat 80. Podsumowujący raport ewaluacyjny zlecony przez Muzeum w 2012 r. opisuje naukowców amatorskich jako żywo zainteresowanych nauką, a dwie trzecie z nich posiada wykształcenie wyższe w danej dyscyplinie naukowej22. Kandydaci na naukowców-amatorów są obecnie rekrutowani pocztą pantoflową, muszą pomyślnie przejść proces rozmowy kwalifikacyjnej z doświadczonymi wolontariuszami w Muzeum i przejść okres próbny na stałej wystawie zdrowia Muzeum, Expedition Health, zanim będą mieli możliwość ubiegania się o stanowisko w laboratorium. Po przyjęciu do laboratorium naukowcy-amatorzy przechodzą 12-tygodniowe szkolenie, aby uzyskać certyfikat uprawniający do przyjmowania do pracy na ludziach. Po uzyskaniu tej certyfikacji są oni w stanie wziąć udział w modułach szkoleniowych dotyczących różnych technik w laboratorium (np. liczenie brodawek, ekstrakcja DNA), a po uzyskaniu dodatkowych certyfikatów i regularnych środków kontroli jakości, ci naukowcy-amatorzy mają możliwość aktywnego udziału w analizie danych. Naukowcy-amatorzy poświęcają swój czas i nie otrzymują wynagrodzenia za swój wkład w Muzeum.

<table><tbody><tr><td>Obraz J</td><td>National Institutes of Health</td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij</a></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik spożywczy, ciemnoniebieski odcień</td><td>Esco</td><td>http://escofoods.com/blue-food-coloring.html</td><td></td></tr><tr><td>sterylne aplikatory położnicze / ginekologiczne z końcówką ze sztucznego jedwabiu</td><td>Puritan</td><td>25-808 Bibuła</td> filtracyjna 1PR <td></td></tr><tr><td>klasy 1 Whatman</td><td></td><td>Whatman No.: 1001-325</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix P100 (10,3 megapiksela) i P500 (12,1 megapiksela)</td><td>Nikon</td><td>http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/</td> <td>żaden model nie wydaje się być już dostępny na stronie internetowej</td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>Kleenex</td><td>https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół denver papillae do obiektywnej analizy brodawek grzybiczych

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

Celem Protokołu Denver Papillae jest użycie klucza dychotomicznego do zdefiniowania i priorytetyzacji cech brodawek grzybowatych (FP), aby zapewnić spójne punktowanie między punktantami. Protokół ten opiera się na potrzebie, która pojawiła się w ciągu ostatnich dwóch dekad badań nad smakiem przy użyciu FP jako wskaźnika gęstości porów smakowych. Gęstość FP była historycznie analizowana przy użyciu charakterystyki ich morfologii Miller i Reedy z 1990 roku: okrągły, zabarwiony, jaśniejszy, duży i podwyższony. W niniejszej pracy autorzy ostrzegali, że konieczne jest nakreślenie bardziej rygorystycznych definicji morfologii FP. Pomimo tego wezwania do działania, literatura następcza była niewielka, a większość badań nadal cytuje oryginalną pracę Millera i Reedy'ego. W związku z tym raporty dotyczące gęstości FP były bardzo zróżnicowane, co w połączeniu z małymi rozmiarami prób może przyczynić się do rozbieżnych wniosków na temat roli FP we wrażliwości smakowej. Laboratorium Genetyki Smaku zbadało tę pozorną niespójność w liczeniu i odkryło, że osoby oceniające indywidualnie priorytetowo traktowały znaczenie tych cech w różny sposób i nie miały żadnych wskazówek dotyczących tego, kiedy brodawka ma niektóre, ale nie wszystkie, zgłaszane cechy FP. Rezultatem tej subiektywności jest bardzo zmienna liczba FP tego samego obrazu języka. Protokół Denver Papillae został opracowany w celu zaradzenia tej konsekwencji poprzez zastosowanie klucza dychotomicznego, który dodatkowo definiuje i ustala priorytety znaczenia cech zaproponowanych przez Millera i Reedy'ego. Proponowana metoda może pomóc w stworzeniu standardowego sposobu ilościowego oznaczania FP dla naukowców zajmujących się badaniami nad smakiem i wartościami odżywczymi.

Poniżej przedstawiono reprezentatywną fotografię ocenioną przez dwóch niezależnych oceniających z zastosowaniem powszechnie używanej metodologii Millera i Reedy’ego do identyfikacji FP, opartej na standardach terenowych dotyczących kształtu okrągłego, dużych rozmiarów, koloru różowego lub jaśniejszego zabarwienia oraz wypukłości, a następnie tę samą fotografię ocenioną przez dwóch oceniających z użyciem DPP. Przedstawione wyniki są reprezentatywne dla wysokiej wariancji obserwowanej przy zastosowaniu oryginalnej metody w porównaniu z niższą wariancją uzyskaną dzięki DPP.
<img alt="Analiza fluorescencyjna porównująca dwie próbki, przedstawiająca rozkład czerwonych i zielonych punktów, wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/52860/52860fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4">
Rysunek 4: Ilościowe oznaczanie metodą Millera i Reedy'ego w porównaniu do oznaczania metodą DPP. Obraz po lewej stronie jest reprezentatywny dla zliczeń przeprowadzonych przez dwóch oceniających z wykorzystaniem metody Millera i Reedy'ego. Obraz po prawej stronie przedstawia zliczenia dwóch oceniających z wykorzystaniem DPP. Kolor czerwony oznacza oceniającego 1, żółty oceniającego 2, a zielony obu oceniających (1 i 2).
Niezawodność statystyczna DPP została wcześniej zbadana przy użyciu mieszanego modelu liniowego w celu oceny zmienności10W skrócie, aby uzyskać dane do oceny roli, jaką DPP odgrywa w spójności wyników, piętnaście obrazów oceniono dwukrotnie. W pierwszej serii ocen oceniający nieznający DPP użyli metody Millera&amp; Metoda Reedy'ego2Następnie przeszkolono oceniających w obsłudze oprogramowania DPP, a obrazy zostały ponownie ocenione indywidualnie, z pominięciem końcowego etapu wypracowania konsensusu opisanego w sekcji 2.7 dotyczącej kontroli jakości (Rysunek 5). Następnie zbiór danych z wyników FP wykorzystano w modelu mieszanym w celu oceny łącznych różnic wynikających z protokołu (Rycina 6), zmienność wewnątrzoceniającego oraz interakcję między tymi dwoma czynnikami. Model ten wykazał istotną różnicę w punktacji przy zastosowaniu metody Millera &amp; Metoda Reedy'ego w porównaniu z DPP (wartość p) &lt;1 x 10-6) przy czym w przypadku DPP liczba była wyższa o 6,99 (SE = 0,99); 5,2% zmienności wyniku wynikało z treningu, 25,9% z oceniającego, a pozostała część ze zmienności specyficznej dla obrazu10Następnie, w celu wygenerowania danych do określenia zmienności wewnątrzoceniającego, 11 osób oceniło serię trzydziestu obrazów w losowej kolejności. Bez wiedzy oceniających seria ta zawierała trzy powtórzone obrazy. Zaobserwowano drastyczną różnicę w zmienności ocen przy porównaniu obrazów różnych i powtórzonych.
<img alt="Wykres pudełkowy porównujący wyniki przed i po ocenie 26 oceniających, ilustrujący rozkład wyników." src="/files/ftp_upload/52860/52860fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Brak przeszkolenia DPP vs po przeszkoleniu DPP. Panele przedstawiają wykresy pudełkowe ocen recenzentów dla 15 obrazów przed i po przeszkoleniu zgodnie z Denver Papillae Protocol. Na każdym wykresie pudełkowym wypełnione koło oznacza średnią, natomiast puste koło oznacza wartość odstającą.
<img alt="Wykres wariancji oceniających; wykres słupkowy przedstawiający rozkład wariancji dla wielu oceniających." src="/files/ftp_upload/52860/52860fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Zmiana wariancji oceniających. Kolor szary reprezentuje wariancję dla poszczególnych oceniających przed szkoleniem DPP. Kolor czarny reprezentuje tego samego oceniającego po szkoleniu DPP.

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru gęstości brodawek grzybowych na podstawie zdjęć cyfrowych. Metoda ta włącza priorytetyzację i obiektywne wskaźniki charakterystyki do oryginalnej pracy opisowej na temat brodawek grzybowatych autorstwa Millera i Reedy'ego (1990).

Protokół Denver Papillae do obiektywnej analizy brodawek grzybiczych

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ujednolicenie ilościowej oceny brodawek grzybiczych między różnymi ocenami i laboratoriami poprzez zastosowanie klucza dychotomicznego. Osiąga się to najpierw poprzez zabarwienie języka badanego na niebiesko za pomocą barwnika spożywczego i przyklejenie do języka papieru filtrującego z wycięciem o średnicy jednego centymetra. Drugim krokiem jest wykonanie wysokiej jakości zdjęcia zbliżeniowego języka badanego.Następnie osoba oceniająca wykorzystuje klucz dychotomiczny do zbadania kształtu, rozmiaru, koloru i wypukłości potencjalnej brodawki. Brodawka, która nie jest amorficzna, jest o co najmniej 0.5 mm bardziej różowa niż tło i nie jest zagłębiona, zostaje zakwalifikowana jako brodawka o kształcie grzyba. Ostatnim krokiem jest porównanie wyników dwóch ocen i upewnienie się, że różnica w liczbach nie przekracza 10%.Ostatecznie protokół Denver Papillae jest wykorzystywany do zdefiniowania i ustalenia priorytetów cech brodawek grzybowych, aby zapewnić spójność zliczeń w różnych ocenach i laboratoriach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak protokół Millera i Reada, jest redukcja subiektywizmu ocen podczas kwantyfikacji brodawek grzybowych. Jest to osiągane dzięki jasnej definicji każdej cechy oraz zastosowaniu klucza dychotomicznego, co gwarantuje, że wszystkie struktury zaklasyfikowane jako brodawki grzybowe spełniają każde z kryteriów.Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie smaku, takie jak określenie roli, o ile taka istnieje, jaką gęstość brodawek formy grzybowej odgrywa w percepcji smaku. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy poprosiliśmy naszych naukowców-obywateli o policzenie brodawek formy grzybowej metodą Millera i Readinga, lecz zauważyliśmy, że wyniki zliczania drastycznie różniły się dla tego samego obrazu języka. Rozmowy z osobami oceniającymi ujawniły, że różnie priorytetyzowały one cechy oraz stosowały odmienne kryteria liczenia brodawek, które spełniały niektóre, ale nie wszystkie wymagania.Procedurę zaprezentuje Rudy Torres, wolontariusz-obywatel w laboratorium genetyki smaku. Aby przygotować badanych do tej procedury, należy pokazać im zdjęcie z instrukcją dotyczącą ułożenia ciała oraz przykładem tego, jak będzie wyglądać wykonane zdjęcie. Poinstruuj badaną, aby osuszyła język ręcznikiem papierowym i pozostawiła go wysuniętego z ust.Używając sterylnego aplikatora rayonowego z końcówką o długości jednej cala, nanieś około trzech mililitrów niebieskiego barwnika spożywczego w stężeniu 1:36 na wierzchołek języka. Poleć badaną, aby schowała język do jamy ustnej i przełknęła go, w celu usunięcia nadmiaru barwnika. Następnie poproś badaną o przyjęcie pozycji przedstawionej na zdjęciu, z brodą opartą o dłonie i łokciami wspartymi o stół dla zachowania stabilności.Poproś badaną o wysunięcie języka na komfortową odległość i delikatne przytrzymanie go zębami. Przyklej 2,5 centymetrowy kawałek papieru filtracyjnego z wyciętym w nim otworem o średnicy 10 milimetrów do koniuszka wewnętrznej strony lewej połowy języka. Obok linii środkowej zamocuj wysokiej jakości cyfrowy aparat kompaktowy na statywie w celu zapewnienia stabilności.Korzystając z ustawienia makro, wykonaj co najmniej trzy zdjęcia języka z bliska, obejmując cały okrągły wycinek o średnicy 10 milimetrów, aby zapewnić wizualizację wszystkich grzybów, form, brodawek lub FP w tym obszarze. Powiększ obraz do stopnia, w którym cały wycinek zostanie sfotografowany, pozostając jednocześnie w zalecanym zakresie zoomu aparatu. Upewnij się, że płaszczyzna obiektywu aparatu jest równoległa do płaszczyzny języka i że wycinek na zdjęciu ma kształt koła.Zamiast wydłużonych zdjęć do przeglądu, należy upewnić się, że są one wysokiej jakości i przydatne do zliczania. Rozpocznij tę procedurę od przesłania na komputer zdjęć języka wykonanych temu samemu obiektowi. Do dalszej analizy wybierz tylko jedno zdjęcie, kierując się wyraźnym zdefiniowaniem struktur języka przy najwyższym powiększeniu oraz najmniejszym zniekształceniem kąta, tak aby język był szeroki i płaski względem kamery.Otwórz wybrany surowy obraz w oprogramowaniu open source ImageJ. Kliknij w zakładkę plugins, a następnie w menu rozwijanym przejdź do sekcji analyze i kliknij cell counter. Po otwarciu modułu cell counter kliknij initialize, aby powiązać obraz z licznikiem komórek. W celu zapewnienia spójności wyników oraz dla potrzeb kolejnych etapów zastosuj standardowe powiększenie 50%.Aby ocenić fp, przesuń ten obraz na lewą stronę ekranu, obok licznika komórek. Obraz ten będzie określany jako Kopiuj Otwórz drugą kopię surowego obrazu w celu pomiaru średnic kwantyfikowanych brodawek. Przesuń tę kopię na prawą stronę ekranu, aby uniknąć przypadkowej pomyłki między obiema kopiami.Drugi obraz będzie określany jako kopia B. W trakcie procesu oceny należy powiększać i pomniejszać obraz zgodnie z preferencjami osoby oceniającej. Korzystając z kopii B, kliknij narzędzie linii. Powiększ obraz w takim stopniu, aby precyzyjnie narysować średnicę w poprzek 10 mm wewnętrznego okręgu papieru filtracyjnego pod dowolnym kątem, a następnie kliknij „analyze” i „set scale”. W polu znanej odległości wpisz 10.Zweryfikuj poprawność skali, mierząc inny kąt i upewnij się, że zakres średnicy mieści się w przedziale od 9.8 do 10.2 milimetrów. Protokół Denver PAPALE (DPP) bierze pod uwagę kształt, kolor, rozmiar i cofnięcie każdej potencjalnej brodawki przy określaniu, czy jest ona fp. Procedura szkolenia w zakresie punktacji z wykorzystaniem klucza dychotomicznego nie zostanie pokazana w tym filmie, lecz jest dostępna w towarzyszącym tekście protokołu w celu rozpoczęcia oceny.Należy ocenić, czy potencjalna papilla przy 50% powiększeniu jest amorficzna lub bezkształtna. Sprawdzić, czy występuje powszechnie rozpoznawalny kształt geometryczny, taki jak owalny, kostkowy lub okrągły. W przypadku braku kształtu geometrycznego przejść do okna licznika komórek i kliknąć typ jeden.Kopia A. Kliknij kandydującą brodawkę, aby oznaczyć ją jako amorficzną i niebędącą fp. Klikanie typów od jeden do cztery w tym i w kolejnych krokach pozwala systemowi punktacji odnotować, że wszystkie kandydujące brodawki zostały rozpatrzone, oraz skategoryzować, która reguła została naruszona podczas odrzucenia struktury. Jeśli kandydująca brodawka ma określony kształt geometryczny, przejdź do następnego kroku w celu zbadania jej koloru, odwołaj się do kopii A i określ, czy na powierzchni języka występuje jakiekolwiek zróżnicowanie kolorystyczne.Jeśli występuje różnica w barwie, ale potencjalna brodawka jest niebieska, a otaczające ją brodawki są jaśniejsze, przejdź do okna licznika komórek i kliknij typ dwa na liczniku komórek w kopii A. Kliknij potencjalną brodawkę, aby oznaczyć ją jako niebieską (typ dwa), a nie jako fp. Jeśli różnica w barwie nie występuje lub jeśli jakakolwiek część potencjalnej brodawki pozostała różowa bądź zabarwiona jaśniej, przejdź do następnego kroku w celu określenia rozmiaru. Korzystając z kopii B, powiększ obraz do stopnia, w którym można wyraźnie dostrzec obrys potencjalnej brodawki.Kliknij narzędzie linii i dokonaj pomiaru wzdłuż najdłuższego wymiaru wybranej brodawki. Kliknij, przeanalizuj, a następnie sprawdź, czy zmierzona długość wynosi 0,499 mm lub mniej. Wykonaj pomiar ponownie, aby zapewnić dokładność.Jeśli długość wciąż wynosi 0,499 mm lub mniej, kliknij typ trzy w oknie licznika komórek, a następnie kliknij kandydata, aby oznaczyć go jako zbyt mały i niebędący fp. Jeśli zmierzona długość wynosi 0,5 mm lub więcej, przejdź do badania jego recesji, aby ocenić, czy kandydująca brodawka ma wysokość jednolitą z resztą języka, czy jest wyniesiona. Jeśli brodawka znajduje się w zagłębieniu, określ jej wysokość w porównaniu do innych struktur w zagłębieniu, a nie względem powierzchni języka.Jeśli brodawka znajduje się niżej niż otaczające ją brodawki, należy kliknąć typ cztery w oknie licznika komórek, a następnie na kopii A kliknąć badaną brodawkę, aby oznaczyć ją jako zagłębioną i niebędącą fp. Jeśli badana brodawka ma wysokość jednolitą z resztą języka lub jest wyniesiona, należy kliknąć typ pięć i zaznaczyć, że jest to fp. Suma typu pięć stanowi surowy wynik FP.Zapisz surowy wynik FP w notatniku, aby zachować kopię, kliknij eksport obrazu w oknie licznika komórek i zapisz plik zgodnie z systemem nazewnictwa przyjętym w laboratorium. Pozwoli to na ponowne otwarcie kopii A w przyszłości i zachowanie kolorowych oznaczeń dla typów od jednego do pięciu. Nie zapisze to surowego wyniku FP do kontroli jakości.Każde zdjęcie musi zostać ocenione przez dwie osoby, a wyniki należy porównać. Jeśli wyższy surowy wynik FP mieści się w granicach 10% średniej niższego surowego wyniku FP, oba wyniki zostają uznane za wspólny wynik konsensusu FP. Jeśli dwa surowe wyniki FP różnią się o więcej niż 10%, należy wyświetlić na ekranie oba ocenione zdjęcia.Należy wykorzystać typy liczników od jednego do czterech, aby ułatwić dyskusję nad rozbieżnościami i uzgodnić ostateczny wynik konsensusowy. Jeśli nie uda się osiągnąć konsensusu, należy wprowadzić trzecią ocenę w celu oceny obrazu, a następnie przeprowadzić dialog z pozostałymi dwiema ocenami. Reprezentatywna fotografia została najpierw oceniona przez dwóch niezależnych oceniających z wykorzystaniem powszechnie stosowanej metodologii Millera i 3D do identyfikacji FP.Tę samą fotografię ocenili następnie dwaj sędziowie przy użyciu DPP. Kolor czerwony oznacza sędziego pierwszego, żółty sędziego drugiego, a zielony zgodność oceny obu sędziów. Przedstawione zliczenia są reprezentatywne dla wysokiej wariancji obserwowanej przy zastosowaniu oryginalnej metody w porównaniu z niższą wariancją uzyskaną dzięki porównaniu ocen wariantów dla 11 indywidualnych ocen z wykorzystaniem DPPA.Trening przed DPP przedstawiony w kolorze szarym oraz trening po DPP przedstawiony w kolorze czarnym wykazały znaczący spadek wariancji wyników po treningu DPP. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż pięć minut na obraz. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest robienie częstych przerw, aby zapewnić świeże spojrzenie na każde zdjęcie i upewnić się, że każda potencjalna brodawka została dostrzeżona.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak w spójny sposób kwantyfikować grzyby z brodawek, korzystając z klucza dychotomicznego.

denver-papillae-protocol-for-objective-analysis-of-fungiform-papillae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wiedza na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transdukcji smaku poczyniła ostatnio znaczne postępy, głównie dzięki wykorzystaniu modeli zwierzęcych. Jednakże szeroka rozpiętość czułości i specyficzności smakowej wśród ssaków uzasadnia prowadzenie badań na tkankach ludzkich. Opisujemy technikę biopsji służącą do pobierania żywych komórek smakowych z brodawek języka człowieka.

Technika pobierania brodawek grzybiastych (smakowych) z ludzkiego języka

Naszym celem było opracowanie powtarzalnego protokołu izolacji i długoterminnego utrzymywania kultur komórek ludzkich brodawek smakowych grzybiastych. Komórki z ludzkich brodawek grzybiastych uzyskane drogą biopsji zostały pomyślnie utrzymane w kulturze przez ponad osiem pasażów (12 miesięcy) bez utraty żywotności.

Izolacja i hodowla komórek ludzkich brodawek smakowych grzybiastych

W tym filmie opisujemy izolację nabłonka brodawek okołokolacyjnych (CVP) od mysiego języka.

Izolacja nabłonka brodawek obwodowych (CVP) z modelu mysiego: procedura enzymatyczna mająca na celu oddzielenie nabłonka CVP od języka myszy

Doustna chemorecepcja kwasów tłuszczowych i związek z dietą i preferencjami dotyczącymi tłustych potraw może umożliwić identyfikację mechanizmów związanych z rozwojem otyłości i dlaczego zmiany w diecie mogą być trudne dla wielu osób.

Pomiar doustnych progów kwasów tłuszczowych, percepcji tłuszczu, upodobania do tłustych potraw i gęstości brodawek u ludzi

Badania nad rozwojem podniebienia są motywowane występowaniem rozszczepu podniebienia, wady wrodzonej, która stanowi ogromne obciążenie dla zdrowia i może pozostawić trwałe zniekształcenie. Demonstrujemy tutaj technikę hodowli półek podniebiennych, którą można wykorzystać do badania różnych szlaków sygnałowych zaangażowanych w rozwój i fuzję podniebienia.

Metoda badania fuzji podniebienia z wykorzystaniem statycznej hodowli narządów

Zmiany w mikrobiomie jamy ustnej w dzieciństwie budzą coraz większe zainteresowanie. Porównanie różnych badań mikrobiomu ujawnia brak ustandaryzowanych protokołów pobierania próbek. Ograniczona przestrzeń sprawia, że pobieranie próbek dźwiękowych bruzd poddziąsłowych u dzieci jest wyzwaniem. Próbkowanie punktowe na papierze jest tutaj szczegółowo przedstawione jako metoda z wyboru dla tego obszaru.

Pobieranie biofilmu w jamie ustnej do analizy mikrobiomu u zdrowych dzieci

Ten protokół mierzy ludzkie reakcje smakowe i obejmuje krótką ocenę anatomiczną, krótki test smaku oraz metodę walidacji przy użyciu zgłoszonego przez badanego genotypu odczucia i receptora smaku.

Egzamin smakowy: krótki i zatwierdzony test

Ten artykuł opisuje metody przygotowania tkanek, barwienia i analizy całych grzybów, obwodowych i podniebiennych kubków smakowych, które konsekwentnie dają całe i nienaruszone kubki smakowe (w tym włókna nerwowe, które je unerwiają) i utrzymują relacje między strukturami wewnątrz kubków smakowych a otaczającą je brodawką.

Barwienie całego wierzchu, wizualizacja i analiza grzybokształtnych, obwodowych i podniebienia kubków smakowych

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Poznaj protokół Denver Papillae do obiektywnej analizy brodawek grzybiczych na języku. Ta metoda wykorzystuje barwienie niebieskim barwnikiem, klucz dikotomiczny i cyfrowe zdjęcia do standaryzacji pomiarów w badaniach nad percepcją smaku.

Protokół Denver Papillae do obiektywnej analizy brodawek grzybiczych

Przeglądaj więcej filmów