Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie interakcji między bakteriami a śródbłonkiem i podśródbłonkiem w warunkach zwykłego stresu. Osiąga się to poprzez fluorescencyjne znakowanie bakterii w celu wizualizacji ich w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii wideo jako drugiego etapu. Komora przepływowa in vitro służy do badania różnych czynników zaangażowanych w adhezję przepływających bakterii do składników komórkowych lub matrycowych.

Następnie interakcje zidentyfikowane w modelu in vitro są badane w modelu perfuzji krezkowej in vivo, aby przetestować ich znaczenie w złożonym organizmie, wyniki pokazują, że Staphylococcus reus jest w stanie przylegać do aktywowanych komórek śródbłonka i do podśródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że obejmuje ona zarówno model in vitro, jak i in vivo, które są komplementarne do badania patogenezy zakażeń wewnątrznaczyniowych w warunkach zwykłego stresu. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób zakaźnych i biologii naczyniowej, takie jak to, w jaki sposób infekcyjne zapalenie wsierdzia i infekcje przerzutowe są ustalane pod wpływem zwykłego stresu fizjologicznego, demonstrując procedurę za pomocą Malin wygląda na technika specjalizującego się w pracy ze zwierzętami z naszego laboratorium Zacznij od przygotowania barwnika fluorescencyjnego używanego do śledzenia bakterii.

Dodaj 150 mikrolitrów z podstawowego karboksylowego roztworu fluorescencyjnego do 850 mikrolitrów wody laboratoryjnej i wymieszaj. Przechowywać roztwór chroniony przed światłem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebny. Następnie granulka, pięciomililitrowa kultura S reus.

Bakterie wyhodowane przez noc w bulionie sojowym tryptycznym przemyć raz PBS, a następnie ponownie zawiesić. Nowa granulka w 800 mikrolitrach PBS dodaje 200 mikrolitrów roztworu barwnika do zawieszonych komórek do eksperymentów perfuzyjnych in vitro lub 400 mikrolitrów roztworu barwnika. W przypadku eksperymentów in vivo przykryj probówki folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu barwnika i inkubuj na wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodać do mieszaniny 6% roztwór albuminy surowicy bydlęcej w PBS, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Sprawdź stężenie komórek za pomocą cytometrii optycznej i rozcieńcz bakterie do PBS w różnych stężeniach w zależności od ich zastosowania. Po rozcieńczeniu należy chronić probówki przed światłem i umieścić je na lodzie.

Rozcieńczyć czynnik von Vanda w wodzie klasy laboratoryjnej do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr. Rozcieńczyć również kolagen w izotonicznym roztworze glukozy do końcowego stężenia 160 mikrogramów na mililitr. Następnie upuść 200 mikrolitrów każdej powłoki na pasek paraformu.

Umieść szkiełka nakrywkowe na kropelkach, aby pokryć je białkami. Inkubować szkiełko nakrywkowe w nawilżonym pojemniku przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie podnieś szkiełka nakrywkowe z paraformy za pomocą igły i zamontuj szkiełko nakrywkowe w dolnej części komory przepływowej do eksperymentów z komórkami śródbłonka, pokryj plastikowe szkiełka jednym mililitrem 1% roztworu żelatyny w PBS i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie wysiewaj ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej na pokrytych żelatyną plastikowych zrazach i rozwijaj je do 70 do 80% płynności. Zamontuj szkiełko nakrywkowe pokryte białkiem lub plastikowe szkiełko pokryte komórkami śródbłonka w dolnej części komory przepływowej. Następnie podłącz rurkę wlotową i wylotową do górnej części komory przepływowej i podłącz rurkę wylotową do pojemnika na odpady.

Delikatnie umieść górną część komory przepływowej na dolnej części i zmontuj komorę przepływową. Unikając przy tym tworzenia się pęcherzyków powietrza. Wstrzyknąć jeden mililitr pożywki przez komorę, aby upewnić się, że komora nie przecieka i usunąć nadmiar roztworu powlekającego.

Następnie ustaw pompę infuzyjną na strzykawkę o pojemności jednego mililitra tak, aby przepływała z prędkością 75 mikrolitrów na minutę. Pracując w ciemnym pomieszczeniu, napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra jednym mililitrem fluorescencyjnie znakowanych bakterii i umieść ją w pompie infuzyjnej. Podłączyć wylot strzykawki do wlotu komory przepływowej.

Uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, uruchomić pompę infuzyjną na 10 minut z prędkością 75 mikrolitrów na minutę. Po 10 minutach wyjąć pierwszą strzykawkę i podłączyć jednomililitrową strzykawkę zawierającą PBS lub DMEM do rurki wlotowej. Rozpocznij infuzję, odciągaj pokarm i płucz przez 10 minut, aby zmyć wszelkie niezwiązane bakterie.

Po wypłukaniu pozostaw włączoną pompę infuzyjną i wykonaj co najmniej 15 czarno-białych zdjęć, używając czasu naświetlania 1,5 sekundy w losowych miejscach, rozprowadzonych na powlekanej powierzchni komory przepływowej. Korzystanie z programu do analizy obrazu, takiego jak Obraz J.Odejmij tło, aby usunąć gładkie, ciągłe tła z obrazu i zdefiniować próg, aby ustawić dolną i górną wartość progu, która dzieli obrazy w skali szarości na interesujące obiekty. Następnie zmierz obszar ograniczony do nowo utworzonego progu i zapisz tę wartość znaną jako obszar fluorescencyjny dla każdej próbki.

Testowane szybko na ośmiotygodniowych myszach w noc poprzedzającą eksperyment w celu zmniejszenia wypróżnień. Dzień eksperymentu należy rozpocząć od wstrzyknięcia 0,1 miligrama buprenorfiny na kilogram masy ciała jako środka przeciwbólowego. Następnie znieczul mysz i nałóż maść na oczy.

Umieść mysz na termokontrolowanej poduszce grzewczej pod lunetą sekcyjną i sprawdź, czy mysz nie wykazuje odruchu płatków. Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie równolegle do żyły szyjnej. Usuń prawą stronę mięśnia szyjnego, a następnie odizoluj żyłę szyjną od otaczającej tkanki.

Wprowadzić dwa francuskie cewniki dożylne do prawej żyły szyjnej i zabezpieczyć go na miejscu za pomocą szwów. Następnie wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej, aby otworzyć jamę otrzewnej. Umieść mysz na prawym boku na przezroczystej płytce i zabezpiecz kaniulę taśmą.

Delikatnie wyciągnij jelita za pomocą wacików i rozprowadź krezkę. Aby uwidocznić tętniczkę krezkową i krążenie uliczne. Umieść gorący okład na myszy, aby zapobiec hipotermii i upuść 500 mikrolitrów 0,9% NACL na jelita co 30 minut, aby zapobiec odwodnieniu tkanki.

Użyj bawełnianych wacików, aby unieruchomić naczynia i uwidocznić je pod odwróconym mikroskopem. Następnie miejscowo nanieść pięć mikrolitrów 10-milimolowego roztworu jonojono-czterech wapnia rozpuszczonego w DMSO. Spowoduje to aktywację uwalniania Von Villa Brandt, czynnika z komórek śródbłonka w naczyniach.

Po 10 sekundach wstrzyknij 100 mikrolitrów fluorescencyjnie znakowanych bakterii przez cewnik szyjny. W tym momencie zacznij robić zdjęcia poklatkowe, pobieraj zdjęcia poklatkowe za pomocą narzędzia do akwizycji na pasku narzędzi, używając 40 cykli po 1000 obrazów na sekundę. Po zakończeniu pozyskiwania obrazu należy poddać mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucji.

Zapisz obrazy w odpowiednim formacie pliku obrazu, a następnie przetwórz obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu J, jak opisano wcześniej, aby podkreślić rolę czystego naprężenia w adhezji bakteryjnej, perfuzje Staphylococcus aureus przeprowadzono przy różnych szybkościach ścinania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych współczynnikiem Von Vbr. Wraz ze wzrostem samych wskaźników rośnie adhezja bakterii, co wskazuje, że duże siły ścinające nie hamują, ale wzmacniają przyczepność bakterii do białka. Przy braku czynnika von Vanda adhezja gronkowca złocistego do kolagenu zmniejszała się wraz ze wzrostem szybkości ścinania.

Jednakże, gdy czynnik von Vanda był obecny w pożywce, adhezja bakterii wzrastała wraz ze wzrostem szybkości ścinania, komórki śródbłonka aktywowane za pomocą jono-czterecha wapnia do uwalniania czynnika Vand wykazywały znacznie większą adhezję bakteryjną niż komórki nieaktywowane. Dodatkowo, bakterie utworzyły typowe wzory przypominające sznurki fluorescencyjnie znakowanych klastrów bakteryjnych, które były ustawione w kierunku czystej siły, co sugeruje wiązanie bakterii wzdłuż liniowo rozciągniętej cząsteczki VWF w celu przetestowania wpływu czynnika Von Vbr in vivo komórek śródbłonka krążenia krezkowego zostały aktywowane w celu uwolnienia czynnika von Vbr, Następnie do krwiobiegu wprowadzono fluorescencyjnie znakowane komórki bakteryjne. Bakterie lokalnie przylegały do aktywowanej ściany naczynia i tworzyły agregaty.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak badać interakcję z bakteriami i ścianą naczynia na naprężenie ścinające poprzez fluorescencyjne znakowanie bakterii i wizualizację ich zarówno w komorze przepływowej in vitro, jak i w modelu profuzji krezki in vivo intra vital. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się infekcjami sercowo-naczyniowymi do zbadania interakcji między patogenami a ścianą naczynia w infekcyjnym zapaleniu wsierdzia i infekcjach przerzutowych.