Name: Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Naucz się izolacji leukocytów z ludzkiej pochwy macicy w celu badań immunologicznych na interfejsie matka-płód. Metoda zachowuje markery powierzchniowe komórek i umożliwia analizę cytometrią przepływową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver, NIH/DHHS. Prace te były również częściowo wspierane przez Inicjatywę Perinatalną Uniwersytetu Stanowego Wayne w zakresie zdrowia matki, dziecka i matki. Serdecznie dziękujemy Maureen McGerty (Wayne State University) za jej krytyczne odczytanie manuskryptu.

Ten protokół jest odpowiedni do izolacji leukocytów z decidua basalis i decidua parietalis w ramach przygotowań do immunofenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane do sortowania komórek, hodowli komórek, izolacji RNA i cytologii. Przed rozpoczęciem pracy z próbkami wymienionymi w niniejszym protokole należy uzyskać zgodę etyczną człowieka od Lokalnej Komisji Etyki Badań Naukowych i Instytucjonalnych Komisji Rewizyjnych. Pobieranie i wykorzystanie próbek ludzkich do celów badawczych zostało zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Narodowego Instytutu Zdrowia Dzieci i Rozwoju Człowieka Eunice Kennedy Shriver (NICHD), Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej (DHHS, Bethesda, MD, USA) oraz Wayne State University (Detroit, MI, USA). Uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich kobiet w ciąży przed pobraniem próbek tkanek. 
UWAGA: Podczas pracy z krwią zwierzęcą, komórkami lub czynnikami niebezpiecznymi, jak wspomniano w niniejszym protokole, konieczne jest przestrzeganie odpowiednich działań w zakresie bezpieczeństwa biologicznego i bezpieczeństwa laboratoryjnego.
1. Rozwarstwienie tkanek dziesiętnych człowieka
UWAGA: Płytka podstawowa jest podstawą pod łożyskiem i jest do niego przymocowana i reprezentuje powierzchnię matki. Błony owodniowe obejmują owodnię i kosmówkę. Płytka podstawowa zawiera decidua basalis, a kosmówka zawiera decidua parietalis (ryc. 1).
<ol>
	<li>Decidua Basalis
	<ol>
		<li>Wytnij fragment płytki podstawnej z jednego liścienia łożyska (ryc. 1A i 1B).</li>
		<li>Umieść go na sterylnej desce do krojenia kosmkami łożyskowymi skierowanymi do góry. Strona przedstawiająca kosmki łożyskowe jest zwykle krwawoczerwona z wyglądem owłosionej tkanki. Płytka podstawowa jest gładka i bladoczerwona.</li>
		<li>Użyj ostrych, cienkich nożyczek i kleszczy, aby usunąć tkankę kosmkową i naczynia krwionośne. Podczas procesu utrzymuj tkankę nasączoną 1x PBS (wolne od Ca2 + - i Mg2 + - ) (Rysunek 1C). Zbierz od 2 do 3 takich kawałków i dokładnie spłucz je 1x PBS, aby usunąć krew (Rysunek 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Decidua Parietalis
	<ol>
		<li>Wypreparuj fragment błon owodniowych (około 10 cm x 10 cm, ryc. 1E). Umieść go na tablicy kosmówką skierowaną do góry. Strona kosmówkowa zawiera krwawe skrzepy i jest zwykle jasnożółtawa.</li>
		<li>Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć jak najwięcej skrzepów krwi (ryc. 1E). Wypłucz membranę w sterylnym 1x PBS, aby usunąć nadmiar krwi z membrany, aż 1x PBS będzie czysty.</li>
		<li>Użyj jednorazowego sterylnego skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać warstwę dziesiętną z membrany. Nałóż sterylny 1x PBS na membranę podczas zakończenia tego procesu (Rysunek 1F). Zebrać tkanki dziesiętne i umieścić je w plastikowej probówce o pojemności 50 ml ze sterylnym 1x PBS (ryc. 1G).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mechaniczna dezagregacja i trawienie enzymatyczne
<ol>
	<li>Umyć tkankę wyciętą z decidua basalis (z kroku 1.1.3) lub decidua parietalis (z kroku 1.2.3) sterylnym 1x PBS w plastikowej probówce o pojemności 50 ml. Zebrać granulki tkanek przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant znajdujący się nad osadem tkankowym, nie naruszając osadu. 
	UWAGA: W tym momencie, granulki są bardzo luźne, ponieważ zawierają czerwone krwinki. Jeżeli objętość osadu wynosi około lub mniej niż 3 ml, należy zawiesić osad w 6 ml roztworu do oddzielania komórek podgrzanego do temperatury 37 °C. Jeśli osad jest większy niż 3 ml objętości, dodaj więcej roztworu do odrywania komórek (dodać około 2-krotność objętości próbek tkanek).</li>
	<li>Przenieść homogenizowane tkanki (decidua basalis + roztwór do odrywania komórek lub decidua parietalis + roztwór do odrywania komórek) do probówki C.</li>
	<li>Umieść rurkę C w automatycznym dysocjatorze i uruchom odpowiedni program. 
	UWAGA: Program dla decidua basalis trwa 17 sekund z łączną liczbą 668 rund na bieg. Program decidua parietalis trwa 37 sekund, a łączna liczba rund wynosi 235 razy. Programy te zostały dostosowane do izolowania leukocytów z decidua basalis lub decidua parietalis z dobrą wydajnością i żywotnością komórek.</li>
	<li>Po mechanicznej dezagregacji tkanek należy je roztrawić dostępnym w handlu roztworem do odrywania komórek, takim jak akutaza; (koktajl zawierający enzymy proteolityczne i kolagenolityczne) przez 45 minut w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem.</li>
</ol>
3. Izolacja leukocytów
<ol>
	<li>Po inkubacji dodać 10 ml 1x PBS do mieszaniny wytrawiającej i przepuścić przez sitko o wielkości 100 μm do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. W zależności od lepkości mieszanki wytrawiającej, może być konieczne użycie kilku sitek komórkowych do jednej mieszanki.</li>
	<li>Napełnij probówkę 1x PBS i odwiruj przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń 1x PBS nad osadkami komórek i ponownie zawiesij granulki w 5 ml lodowatego buforu FACS. 
	UWAGA:Aby zbadać leukocyty wielojądrzaste i jednojądrzaste razem, przejdź do kroku 6.1; aby zbadać leukocyty jednojądrzaste, przejdź do kroku 3.3.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki o gradiencie gęstości 20% (1,077 + 0,001 g/ml) do plastikowej probówki o pojemności 15 ml i powoli nakładać zawiesinę komórek na podłoże o gradiencie gęstości. Podczas nakładania warstw próbki ważne jest, aby nie mieszać podłoża gradientu gęstości z zawiesiną komórkową.</li>
	<li>Wirówka z odchylanym rotorem o sile 500 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C bez hamulca. Bardzo ważne jest, aby wyłączyć hamulec, aby uniknąć mieszania się komórek i utraty gradientu. Leukocyty zostaną znalezione na granicy faz między pożywką gradientu gęstości a buforem FACS.</li>
	<li>Bardzo ostrożnie usuń górną warstwę zawierającą bufor FACS i resztki komórek za pomocą pipety. Pasmo na granicy zawiera dziesiętne komórki jednojądrzaste i część leukocytów wielojądrzastych.</li>
	<li>Przenieś komórki na granicy faz całkowicie do nowej plastikowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj co najmniej 3 razy większą objętość bufora FACS.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby granulować komórki. Odessać supernatant i przemyć komórki buforem FACS. Granulować komórki za pomocą kolejnego wirowania przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Aby przeprowadzić hodowlę komórkową, patrz krok 4. Aby przeprowadzić sortowanie komórek, zobacz krok 5. Aby przeprowadzić immunofenotypowanie, patrz Krok 6.</li>
</ol>
4. Zastosowania – Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki z kroku 3.7 w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640. Policz żywe komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i roztworu błękitu trypanowego 0,4%.</li>
	<li>Zsumuj ilość pożywki hodowlanej RPMI, aby uzyskać stężenie komórek 1 x 106 komórek/ml. Komórki są teraz gotowe do hodowli.</li>
</ol>
5. Zastosowania – Izolacja makrofagów do pierwotnej hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Aby wyizolować komórki CD14+, oznacz magnetycznie komórki z kroku 3.7 mikrogranulkami CD14 (20 μl kulek na 107 komórek), inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C i oddziel komórki CD14+ od innych typów komórek za pomocą pola magnetycznego. Po 2 płukaniach buforem MACS i usunięciu pola magnetycznego należy wymyć magnetycznie zatrzymane komórki CD14 + za pomocą bufora MACS.</li>
	<li>Po odwirowaniu ponownie zawiesić osady komórkowe w pożywce hodowlanej RPMI 1640. Ogniwa są gotowe do posiewu (rysunek 2).</li>
</ol>
6. Zastosowania – Immunofenotypowanie
<ol>
	<li>Aby użyć komórek do immunofenotypowania, ponownie zawiesić komórki z kroku 3.7 w 1 ml 1x PBS. Policz żywe komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i roztworu błękitu trypanowego 0,4%.</li>
	<li>Oznacz komórki możliwym do utrwalenia barwnikiem żywotności (ryc. 3). Umyj komórki dwukrotnie buforem FACS i ponownie zawieś komórki w buforze do barwienia. Inkubować z blokerem FcR przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj przeciwciała zewnątrzkomórkowe sprzężone z fluorochromami. Na przykład w tym protokole należy użyć przeciwciał anty-CD3, anty-CD19, anty-CD14, anty-CD15 i anty-CD56 (Tabela 1). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Po 2 płukaniach 1x PBS komórki zostaną przeanalizowane w 500 μl buforu barwiącego za pomocą cytometru przepływowego. Przedstawienie strategii bramkowania zastosowanej do analizy subpopulacji leukocytów znajdujących się w tkankach dziesiętnych przedstawiono na rycinie 4.</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Charakterystyka właściwości funkcjonalnych i fenotypowych naciekających leukocytów na granicy faz człowiek-matka-płód jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów immunologicznych, które prowadzą do zaburzeń ciąży. Opisano kilka technik izolowania leukocytów z ludzkiej granicy matczyno-płodowej przez cały okres ciąży 10,14,25,28,37,42,43. Jednak każda z tych technik jest inna, wykorzystuje różne enzymy lub kombinacje enzymów, wymaga różnych czasów dysocjacji, nie określa ilości tkanki i, co najważniejsze, nie zaw...

Ciąża charakteryzuje się trzema odrębnymi fazami immunologicznymi: 1) implantacja i wczesne łożyskowanie związane z reakcją prozapalną (tj. implantacja przypomina 'otwartą ranę'); 2) drugi trymestr i większość trzeciego trymestru ciąży, kiedy homeostaza immunologiczna jest osiągana poprzez przeważający stan przeciwzapalny na granicy matczyno-płodowej; i 3) poród, stan prozapalny1-7. Komórki odpornościowe odgrywają ważną rolę w regulacji odpowiedzi zapalnej na granicy matczyno-płodowej, gdzie ich liczebność i lokalizacja zmieniają się w czasie ciąży6-9.
U ludzi interfejs matka-płód reprezentuje obszar bezpośredniego kontaktu między tkankami matki (decidua) i płodu (kosmówka lub trofoblast). Interfejs ten obejmuje: 1) decidua parietalis, która wyściela jamę macicy, która nie jest pokryta łożyskiem i jest w zestawieniu z kosmówką; i 2) decidua basalis, znajdujący się w płytce podstawnej łożyska, gdzie jest atakowany przez trofoblasty śródmiąższowe10 (ryc. 1). Bliskość tych obszarów kontaktu stwarza warunki do ekspozycji płodu na antygeny układu odpornościowego matki11-13. Nic dziwnego, że leukocyty stanowią do 30-40% komórek dziesiętnych8,9,14,15 oprócz typowych komórek zrębowych i komórek gruczołowych8,14,16. Rola leukocytów na styku matka-płód obejmuje wiele procesów, które obejmują ograniczenie inwazji trofoblastu17, przebudowę tętnic spiralnych18,19, utrzymanie tolerancji matczynej12,20 i rozpoczęcie porodu21-26. Leukocyty zarówno adaptacyjnych, jak i wrodzonych kończyn układu odpornościowego, tj. limfocytów T, makrofagów, neutrofili, limfocytów B, komórek dendrytycznych i komórek NK, zostały zidentyfikowane w tkankach dziesiętnych, a ich proporcje i stan aktywacji wykazały, że zmieniają się przestrzennie i czasowo w czasie ciąży6-10,12,14,24,27-30. Zaburzenia w populacji i/lub funkcji leukocytów są związane ze spontanicznym poronieniem31, stanem przedrzucawkowym32, wewnątrzmacicznym ograniczeniem wzrostu32,33 i przedwczesnym porodem7,24. W związku z tym badanie cech fenotypowych i funkcjonalności leukocytów na granicy ludzkiej matki i płodu ułatwi wyjaśnienie szlaków immunologicznych rozregulowanych w zaburzeniach ciąży.
Jednym z najpotężniejszych narzędzi używanych do określania fenotypu i funkcjonalnych właściwości leukocytów jest cytometria przepływowa, technologia pozwalająca na ilościową analizę wielu parametrów jednocześnie34-36. Aby przeanalizować leukocyty za pomocą cytometrii przepływowej, wymagana jest izolacja leukocytów w zawiesinie jednokomórkowej. Dlatego potrzebna jest metoda oddzielania naciekających leukocytów od granicy matczyno-płodowej w celu zbadania ich właściwości fenotypowych i funkcjonalnych.
Opisano kilka metod izolowania leukocytów z ludzkiej granicy matczyno-płodowej10,14,25,27,37-39. Podczas gdy niektórzy stosują dezagregację mechaniczną10,25,27,38, inni używają trawienia enzymatycznego37,40 do dysocjacji tkanek. Ponieważ dezagregacja mechaniczna daje niższą wydajność i zmniejszoną żywotność41, a dysocjacja enzymatyczna może wpływać na żywotność i zatrzymywanie markerów na powierzchni komórki42, opisana tutaj metoda łączy delikatną dysocjację mechaniczną z enzymatyczną obróbką wstępną w celu zwiększenia wydajności izolowanych leukocytów bez uszczerbku dla żywotności komórek. Wykazano, że podobna kombinacja metod jest skuteczna w izolacji leukocytów z tkanek dziesiętnych na granicy matczyno-płodowej39. Dlatego opisany tutaj protokół obejmuje mechaniczną dezagregację za pomocą automatycznego dysocjatora tkanek, który zwiększa spójność, jednocześnie oszczędzając czas i pracę w porównaniu z tradycyjnym mieleniem za pomocą przeciwstawnych skalpeli, żyletek lub nożyczek chirurgicznych10,28. Enzymem wybranym do dysocjacji tkanek była Accutaza. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanej kolagenazy43, dypazy44 i trypsyny45, Accutaza (roztwór do odrywania komórek) łączy w sobie zarówno ogólne działania proteolityczne, jak i kolagenolityczne, które przyczyniają się do wydajnej, ale delikatnej dysocjacji46,47. Po dysocjacji leukocyty są wzbogacane z całkowitej populacji komórek dziesiętnych przez wirowanie w gradiacji gęstości. Wcześniej stosowano różne podłoża o gradiencie gęstości, z których najczęstszymi są Percoll (zawiesina koloidalnych cząstek krzemionki)48 i Ficoll (polimer sacharozy o wysokiej syntetycznej masie cząsteczkowej)49. Wykazano już wcześniej wyższą skuteczność izolacji za pomocą polimeru sacharozy50, a opisany tu protokół dodatkowo dowodzi, że to podłoże o gradionym gradiencie gęstości wytwarza wystarczająco wysoką czystość leukocytów jednojądrzastych.
Stąd, protokół opisany tutaj łączy mechaniczną dezagregację tkanek z automatycznym dysocjatorem tkanek, trawienie enzymatyczne z roztworem oddzielającym komórki, oraz separację leukocytów za pomocą pożywki o gradiencie gęstości (1,077 + 0,001 g/ml) w celu wyizolowania leukocytów z ludzkich tkanek dziesiętnych. Udowodniono, że protokół ten zachowuje antygeny powierzchniowe komórek wraz z ich żywotnością. Wyizolowane leukocyty mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do immunofenotypowania z cytometrią przepływową i badań funkcjonalnych in vitro.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dysparsekcja</td></tr><tr><td>Sterylne narzędzia do preparacji: nożyczki chirurgiczne, kleszcze i pęsety z cienką końcówką&nbsp;</td><td>Dowolny dostawca</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Duże i małe szalki Petriego</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Dysocjacja</silny></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td>(roztwór do odrywania komórek)</td></tr><tr><td>Sterylne probówki stożkowe o pojemności 2 ml z bezpiecznym zamkiem</td><td>Dowolna </td><td></td><td></td>dostawca</tr><tr><td>stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 i mikro; m sitka komórkowe</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki z polistyrenu z okrągłym dnem</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>RPMI pożywka hodowlana 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10% FBS i 1% P/S)</td></tr><tr><td>Szkiełka z tworzywa sztucznego</td><td>Inkubator</td><td>177437</td><td></td>Thermo</tr><tr><td></td><td>Scientific Corporation Łaźnia</td> wodna <td>HEPA Class 100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Mikroskop Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Separation</td></tr><tr><td>MS kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separator komórek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m filtry do separacji wstępnej</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe safe-lock</td><td>Bufor MACS dowolnego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 2 mM EDTA i 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4"><silne>odczynniki</td></tr><tr><td>FcR blokujące</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc Block)</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-antygenowe powierzchni komórek ludzkich&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Tabela 1)</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD barwnik żywotności</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Lyse/Fix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>bufor FACS&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,1% BSA, 0,05% azydek sodu i 1X PBS, pH = 7,4)</td></tr> <tr><td>Bufor barwiący&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Pożywka o gradinie gęstości 20% (1,077 + 0,001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Dodatkowe instrumenty</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Wirówka BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>System próżniowy</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny dysocjator tkanek&nbsp;</td><td>Dysocjator</td><td></td> <td>Miltenyi Biotec</td> gentleMACS</tr></tbody></table>

izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Ciąża charakteryzuje się infiltracją leukocytów w tkankach rozrodczych i na styku matki i płodu (decidua basalis i decidua parietalis). Ten interfejs jest anatomicznym miejscem kontaktu między tkankami matczynymi i płodowymi; Dlatego jest to immunologiczne miejsce działania w czasie ciąży. Naciekające leukocyty na granicy matczyno-płodowej odgrywają kluczową rolę w implantacji, utrzymaniu ciąży i czasie porodu. Dlatego charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna tych leukocytów zapewni wgląd w mechanizmy, które prowadzą do zaburzeń ciąży. Opisano kilka protokołów w celu wyizolowania naciekających leukocytów z decidua basalis i decidua parietalis; Jednak brak spójności odczynników, enzymów i czasów inkubacji utrudnia porównanie tych wyników. Opisane w niniejszym artykule jest nowatorskie podejście, które łączy zastosowanie delikatnych technik dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej w celu zachowania żywotności i integralności markerów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych w leukocytach wyizolowanych z tkanek ludzkich na granicy matczyno-płodowej. Oprócz immunofenotypowania, hodowli komórkowych i sortowania komórek, przyszłe zastosowania tego protokołu są liczne i zróżnicowane. Zgodnie z tym protokołem wyizolowane leukocyty można wykorzystać do określenia metylacji DNA, ekspresji genów docelowych, funkcjonalności leukocytów in vitro (tj. Fagocytozy, cytotoksyczności, proliferacji komórek T i plastyczności itp.) oraz produkcji reaktywnych form tlenu na granicy matczyno-płodowej. Dodatkowo, korzystając z opisanego protokołu, laboratorium to było w stanie opisać nowe i rzadkie leukocyty na granicy matczyno-płodowej.

Preprocessing tkanek ludzkich na styku matka-płód (decidua basalis i decidua parietalis) przedstawiono na Rysunku 1. Procedura ta obejmuje preparowanie płyty podstawnej, która zawiera decidua basalis (Rysunek 1A-D). Decidua basalis jest uzyskiwana poprzez usunięcie kosmków łożyska (strona płodowa) z płyty podstawnej (Rysunek 1C). Decidua parietalis jest zbierana poprzez delikatne skrobanie błonyt chorionu (Rysunek 1E-F)....

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie leukocytów z ludzkiej błony podstawna, basalis i paralampularią. Osiąga się to poprzez wstępne wycięcie tkanek błony podstawnej z łożyska. Następnie tkanka decydualna jest dysocjowana poprzez zagregowanie mechaniczne i trawienie enzymatyczne.Następnie zawiesinę komórkową filtruje się przez sito komórkowe o oczkach 100 µm, przepłukane roztworem XPBS, a następnie wiruje przy 300 G przez pięć minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadu komórkowego. Na koniec zawiesinę komórkową nanosi się na wierzch roztworu gradientu gęstości i wiruje, po czym zbiera się warstwę przejściową zawierającą leukocyty. W ten sposób wyizolowane leukocyty mogą zostać wykorzystane do immunofenotypowania, hodowli komórkowych oraz badań funkcjonalnych.Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak dysocjacja mechaniczna czy trawienie enzymatyczne, jest połączenie mechanicznej desegregacji tkanki z automatycznym asocjatorem tkanek oraz trawienia tematycznego z użyciem Accutane i izolacji leukocytów przy użyciu gradientu kałowego. Wykazano, że protokół ten pozwala na zachowanie antygenów powierzchniowych komórek oraz ich żywotności, a jego zastosowania rozszerzają się na zrozumienie funkcjonalnych i fenotypowych właściwości naciekających leukocytów w obrębie interfejsu matczyno-płodowego w związku z patogenezą powikłań prenatalnych. Gromadzenie i wykorzystywanie próbek ludzkich do celów badawczych zostało zatwierdzone przez rady rewizyjne instytucji: Eunice Kennedy Shriver, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services oraz Wayne State University.Od wszystkich ciężarnych kobiet przed pobraniem próbek tkanek uzyskano pisemną świadomą zgodę. Na początek należy wyciąć fragment płyty podstawowej z jednego z płatów łożyska. Umieść go na sterylnej desce do cięcia tak, aby zakrwawione, czerwone i włókniste kosmki łożyska były skierowane do góry.Płyta podstawna jest gładka i ma bladoczerwony kolor; utrzymując tkankę namoczoną w 1xPBS, należy użyć ostrych, precyzyjnych nożyczek i pincety, aby usunąć tkankę kosmkowatą oraz naczynia krwionośne. Należy zebrać dwa do trzech fragmentów i dokładnie wypłukać je w PBS, aby usunąć krew. W celu wyizolowania części decydualnej, należy wyciąć fragment o wymiarach 10 cm na 10 cm.Umieść go na podstawce tak, aby chorion, zawierający skrzepy krwi i zazwyczaj mający jasnożółty kolor, był skierowany do góry. Następnie, używając pęsety o cienkich końcach, usuń jak najwięcej skrzepów krwi. Następnie, używając sterylnego 1x PBS, płucz błonę, aż dopływający PBS będzie przejrzysty.Używając jednorazowego sterylnego skrobaka do komórek i nakładając PBS na błonę, delikatnie zeskrob warstwę decydualną. Zbierz tkanki decydualne i umieść je w plastikowej probówce o pojemności 50 ml z jałowym PBS, aby mechanicznie rozbić decyduę Bali lub decyduę paral. Rozpocznij od przemycia tkanki w probówce 50 ml przy użyciu sterylnego 1x PBS.Następnie odwiruj tkankę z prędkością 300 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Ostrożnie odessij nadsącz, nie naruszając osadu. Po ponownym zawieszeniu tkanki w roztworze odrywającym zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś homogenizowane tkanki do probówki typu C.Umieść probówkę w automatycznym dysocjatorze i uruchom odpowiedni program. Po dysocjacji tkanek przy użyciu dostępnego komercyjnie roztworu do oddzielania komórek, np. Accutane, inkubuj próbkę w temperaturze 37°C przy łagodnym mieszaniu przez 45 minut w celu przeprowadzenia trawienia. Po inkubacji dodaj 10 ml PBS do mieszaniny trawiennej i przefiltruj ją przez sitko komórkowe o oczkach 100 µm do probówki o pojemności 50 ml. W zależności od lepkości preparatu, do przefiltrowania jednej partii trawionej tkanek może być konieczne użycie kilku sitek.Napełnić probówkę PBS i odwirować przy 300 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant i użyć pięciu mililitrów lodowatego buforu fax do resuspensji osadu komórkowego. W celu zbadania leukocytów jednojądrowych dodać pięć mililitrów medium do gradientu gęstości 20% do plastikowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Następnie powoli nanieś zawiesinę komórkową na wierzch, dbając o to, aby warstwy się nie zmieszały. Odwiruj próbkę w wirówce z rotorem z koszyczkami odchylanymi przy 500 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, bez hamowania. Leukocyty znajdą się na granicy faz między medium gradientu gęstości a buforem FACS. Następnie ostrożnie odpipetuj górną warstwę zawierającą bufor FACS i szczątki komórkowe. Granica faz zawiera pozostałe komórki mononuklearne oraz część leukocytów polimorfonuklearnych.Przenieś tę warstwę do nowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj do probówki co najmniej trzy objętości buforu FACS, a następnie wiruj przy 300 G przez pięć minut. Aby spalić komórki, odessać supernatant i drugi raz przemyć komórki buforem FACS przed przejściem do hodowli komórkowej.Sortowanie i immunofenotypowanie zgodnie z protokołem tekstowym; rycina przedstawia morfologię wyizolowanych makrofagów pobranych z decidua pariahs w ciążyścisłej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek. Wyizolowane makrofagi zachowują zdolność do uwalniania cytokin po trzech dniach hodowli. Wydajność żywych komórek wyizolowanych z decidua, baus i decidua paral określono po separacji w gradiencie gęstości.Przy zastosowaniu metody oceny żywotności z użyciem barwnika wiążącego, jak pokazano tutaj, żywotność każdej populacji komórek wynosiła powyżej 90%. Przedstawiono tutaj strategię bramkowania do analizy leukocytów polimorfonuclearnych i mononuklearnych w ramach widocznego bramkowania, obejmującą limfocyty T, neutrofile, makrofagi, komórki NK, komórki NK T oraz limfocyty B. W przypadku ciąży doniesionej rycina ta przedstawia neutrofile, makrofagi, limfocyty T i limfocyty B wyizolowane z pozostałych komórek po ciąży doniesionej.Na koniec, na tym zestawie wykresów przedstawiono komórki NK, NKT i T wyizolowane z pozostałych komórek z ciąży przeterminowanej. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć trzy godziny. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby dokładnie oczyścić tkankę, unikając zanieczyszczenia krwią, oraz stale monitorować tkankę i koktajl enzymatyczny podczas trwania procesu.

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej.  Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.

Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Mleko matki przenosi ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), chociaż tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matki dziennie, chociaż komórki te są niedostatecznie zbadane. Tutaj opisujemy izolację leukocytów mleka matki i analizę ich zdolności fagocytarnej.

Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Naucz się izolacji leukocytów z ludzkiej pochwy macicy w celu badań immunologicznych na interfejsie matka-płód. Metoda zachowuje markery powierzchniowe komórek i umożliwia analizę cytometrią przepływową.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Przeglądaj więcej filmów