Name: Badania przesiewowe środków spożywczych na obecność integronów klasy 1 i kaset genowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metodę wykrywania integronów klasy 1 i kaset genowych w żywności za pomocą PCR i sekwencjonowania DNA. Protokół umożliwia identyfikację bakterii opornych na antybiotyki w surowych produktach spożywczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Michaela Hall, Larissy Bispo i Gustavo Tavaresa za pomoc techniczną.

Pokarmy, które są spożywane na surowo lub lekko ugotowane, są najbardziej niepokojące dla ludzkiego zdrowia. Przykłady obejmują warzywa sałatkowe, owoce, skorupiaki i skorupiaki.
1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Próbki należy pobierać w warunkach minimalizujących zanieczyszczenie i przechowywać w oddzielnych, czystych workach podczas transportu. Po pobraniu próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i przetworzyć w ciągu 24 godzin.</li>
</ol>
2. Wzbogacone przygotowanie kultury
<ol>
	<li>Owoce i warzywa:
	<ol>
		<li>Umieść około 10 g materiału w wytrzymałej plastikowej torbie. Jeśli przetwarzasz większy materiał, skoncentruj się na skórce owocu lub warzywa. Dodać 90 ml 0,1 M buforu fosforanowo-sodowego o pH 7,0 i miksować w blenderze łopatkowym przez 30 sekund. Alternatywnie materiał można mieszać ręcznie, jeśli blender łopatkowy nie jest dostępny.</li>
		<li>Zebrać płyn do dwóch probówek Falcon o pojemności 50 ml. Probówki wirówkowe o pojemności 4 000 x g przez 7 minut do osadzania bakterii.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad i zawiesić granulowane bakterie w 30 ml sterylnego bulionu Luria Bertani (LB).</li>
		<li>Inkubować na wytrząsarce O/N, trzymając jedną probówkę w temperaturze 25 °C, a drugą w temperaturze 37 °C. Kultury należy wstrząsać przy 200 oscylacjach na minutę (opm). Przechowywać kultury w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Owoce morza:
	<ol>
		<li>Wyciąć żołądek (ostrygi) lub przewód pokarmowy (krewetki) za pomocą sterylnych kleszczy i pęsety i umieścić w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl 0,1 M buforu fosforanu sodu o pH 7,0. Macerować próbkę, aby uzyskać homogenat.</li>
		<li>Dozować 5 ml bulionu LB do dwóch sterylnych probówek o pojemności 5 ml i zaszczepić każdą homogenatem owoców morza.</li>
		<li>Inkubować na wytrząsarce O/N, trzymając jedną probówkę w temperaturze 25 °C, a drugą 37 °C. Kultury należy wstrząsnąć w temperaturze 200 opm. Przechowywać kultury w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Badanie przesiewowe kultur dla integronów
UWAGA: Standardowe protokoły PCR są używane w całej tej metodologii, używając dostarczanych z enzymem i końcowego stężenia MgCl2 2,5 mM. W razie potrzeby Lorenz (2011)24 przedstawił metody optymalizacji PCR i rozwiązywania problemów we wcześniejszym wydaniu tego czasopisma.
<ol>
	<li>Preparat gotowanego DNA:
	<ol>
		<li>Dozuj 100 μl wzbogaconej kultury do sterylnej probówki PCR o pojemności 0,5 ml. Podgrzewać próbkę do temperatury 99 °C przez 10 minut, używając łaźni wodnej lub bloku grzewczego. Schładzaj na lodzie przez 2 minuty.</li>
		<li>Mikrowirówka przy 14 000 x g przez 5 minut w celu osadzania resztek komórek. Wróć do lodu. Próbki DNA można zamrozić w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne, ale muszą zostać rozmrożone na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania przesiewowe na obecność całków klasy 1 przy użyciu PCR: 
	UWAGA: Mieszane kultury z inkubacji O/N są badane przesiewowo pod kątem integronów klasy 1 przy użyciu protokołu PCR HS463a/HS464 (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Rozmrozić wszystkie odczynniki PCR na lodzie, z dala od potencjalnych źródeł zanieczyszczenia DNA. Uzupełnić 48 μl PCR mastermix na próbkę, uwzględniając kontrole ujemne (tabela 2). Dozować 48 μl mieszanki wzorcowej PCR do każdej probówki za pomocą końcówek barierowych.</li>
		<li>Dodaj 2 μl rozmrożonego DNA do pojedynczych probówek PCR za pomocą końcówek barierowych. Uruchom odpowiedni program w termocyklerze PCR.</li>
		<li>Aby ocenić wyniki amplifikacji, należy poddać elektroforezie 7 μl produktu PCR na 2% żelu agarozowym i uruchomić w buforze TBE (90 mM TRIS-boranu, 2 mM EDTA). Dołącz marker masy cząsteczkowej, taki jak drabinka 100 pz.</li>
		<li>Po wybarwieniu żelu barwnikiem DNA i wizualizacji za pomocą transilluminatora UV. Sprawdzić, czy w kontroli ujemnej nie nastąpiła amplifikacja. Silne pasmo na poziomie około 470 pz dla każdej konkretnej próbki wskazuje, że mieszana kultura zawiera bakterie, które przenoszą integron klasy 1. Czyste kolonie będą teraz izolowane od każdej mieszanej kultury, która uzyskała pozytywny wynik PCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badania przesiewowe pojedynczych kolonii pod kątem integronów klasy 1
<ol>
	<li>Seryjne rozcieńczenia i płytki rozprowadzane: 
	UWAGA: Aby wyizolować pojedyncze kolonie z mieszanych kultur z dodatnim wynikiem PCR, mieszaną kulturę rozcieńcza się seryjnie 10-krotnie w buforze fosforanu sodu, a następnie posiewa w celu odzyskania pojedynczych kolonii.
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml mieszanej kultury do 9 ml 0,1 M buforu fosforanu sodu o pH 7,0 i wymieszać przez odwrócenie. Dodać 1 ml rozcieńczenia do kolejnych 9 ml buforu fosforanowego i powtarzać aż do osiągnięcia seryjnego rozcieńczenia 10-8.</li>
		<li>Rozprowadzić 100 μl rozcieńczeń 10-4 do 10-8 na agarze LB, w dwóch egzemplarzach. Inkubować płytki O/N w tej samej temperaturze, która jest używana do początkowej mieszanej kultury. Płytki można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne, jednak najlepiej jest przetwarzać pojedyncze kolonie dość szybko.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja pojedynczej kolonii i przygotowanie gotowanego DNA:
	<ol>
		<li>Wybierz pojedyncze kolonie z płytek do rozcieńczania seryjnego, wybierając jak najwięcej różnych typów kolonii, stosując kryteria takie jak wielkość, kształt i kolor kolonii. Użyj sterylnych wykałaczek, aby wybrać pojedyncze kolonie z płytki rozprowadzającej.</li>
		<li>Przyłóż wykałaczkę do kolonii, a następnie przenieś do probówki PCR zawierającej 100 μl sterylnej wody. Jeśli ma zostać przebadana duża liczba kolonii, kolonie można przygotować na tacy do mikromiareczkowania. Zakręć wykałaczką między palcami, aby usunąć niektóre komórki do wody.</li>
		<li>Za pomocą tej samej wykałaczki zaszczepij płytkę LB smugą kolonii. Duża liczba kolonii może być przechowywana na oznakowanych płytkach, jeśli każda smuga ma około 1 cm długości. Powtarzaj kroki od 1 do 3, aż wybierzesz odpowiednią liczbę izolatów.</li>
		<li>Inkubować płytki LB O/N w tej samej temperaturze, jaka jest używana do początkowej wzbogaconej kultury. Kultury mogą być następnie przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
		<li>W celu przygotowania DNA z zawiesin bakteryjnych należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3.1. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych lizatów czystych kultur należy przeprowadzić PCR HS463a/HS464 zgodnie z opisem w sekcji 3.2. Izolaty, które zwrócą dodatni wynik PCR, zostaną wykorzystane do przygotowania genomowego DNA (sekcja 5) oraz do dalszych analiz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ekstrakcja genomowego DNA pojedynczych kolonii integron-dodatnich za pomocą bicia koralików25
<ol>
	<li>Zaszczepić 5 ml bulionu LB próbką czystej kultury wyizolowanej w sekcji 4.2. Inkubować O/N, wstrząsając w tej samej temperaturze, która została użyta do początkowej wzbogaconej kultury.</li>
	<li>Osadzać komórki w temperaturze 4 000 x g przez 7 minut, a następnie usunąć supernatant. Zawiesić granulowane komórki w 1 ml roztworu CLS-TC w probówce do szybkiego przygotowania Lysing Matrix E. Za pomocą maszyny do ubijania kulek przetwarzaj próbkę z prędkością 5,5 m/s przez 30 sekund.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 14 000 x g przez 5 minut i odzyskać 700 μl supernatantu do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 700 μl matrycy wiążącej rozcieńczonej w stosunku 1:5 6 M tiocyjanianem guanidyny i mieszać w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę, odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 800 μl soli i etanolu (70% etanolu, 0,1 M octanu sodu) i wirować, aż granulka zostanie całkowicie zawieszona. Myć przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odwirować przy 14 000 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Upewnij się, że cały supernatant został usunięty, w razie potrzeby używając mikropipety, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić matrycę granulek w 200 μl TE (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7,6), pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Wirować przy 14 000 x g przez 3 minuty i przenieść 160 μl eluowanego DNA do sterylnej probówki. Uruchom podwielokrotność ekstrakcji genomowego DNA na 2% w/v żelu agarozowym, aby sprawdzić wydajność i integralność ekstrakcji DNA. Oczyszczone genomowe DNA jest przechowywane w temperaturze -20 °C i rozmrażane na lodzie, gdy jest to wymagane do testów PCR.</li>
</ol>
6. Diagnostyczne PCR i sekwencjonowanie DNA
UWAGA: Genomowe DNA przygotowane w sekcji 5 będzie używane do wszystkich diagnostycznych PCR oraz do potwierdzenia pozytywnego testu na integrony klasy 1.
<ol>
	<li>Rozmrozić genomowe DNA na lodzie, krótko zawirować próbkę DNA i pulsacyjnie wirować z prędkością 14 000 x g przez 20 sekund. Powtórzyć PCR dla genu integrazy integronowej klasy 1 przy użyciu HS463a/HS464 (Tabela 1), potwierdzając, że izolat jest dodatni dla amplikonu 471 pz (sekcja 3.2).</li>
	<li>Identyfikacja pozytywnych kultur na poziomie gatunku jest osiągana poprzez analizę genu małej podjednostki rRNA (16S rDNA). Amplifikować gen 16S za pomocą starterów f27/r1492 (Tabela 1). Sprawdź produkty PCR za pomocą elektroforezy. Wszystkie cele bakteryjne powinny generować amplikon 16S o wartości około 1450 pz.</li>
	<li>Sekwencjonuj amplikon genu 16S rRNA, aby określić tożsamość gatunku, ale ponieważ prawdopodobnie będzie wiele dodatnich PCR z kroku 6.2, a wiele z tych dodatnich będzie tymi samymi gatunkami bakterii, najpierw rozróżnimy różne gatunki za pomocą trawienia restrykcyjnego produktu 16S PCR.
	<ol>
		<li>Trawić podwielokrotność 16S PCR za pomocą enzymu restrykcyjnego Hinf1. Każdy enzym, który rozpoznaje miejsca rozszczepienia 4 pz, wystarczy, ale Hinf1 generuje dobrą różnorodność od celów 16S i jest niezawodnym, niedrogim enzymem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić 30 μl koncentratu mineralnego (Tabela 2) w sterylnej probówce i dodać 20 μl nieoczyszczonego produktu 16S PCR. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Sprawdzić trawienie na 2% żelu agarozowym.</li>
	<li>Oceń wzorce trawienia wytwarzane przez Hinf1. Izolaty o tym samym profilu restrykcyjnym 16S prawdopodobnie należą do tego samego gatunku. Zamiast sekwencjonować każdy produkt 16S PCR, sekwencjonuj co najwyżej trzech przedstawicieli każdego wzorca ograniczenia Hinf1.</li>
	<li>Oczyść produkty 16S PCR za pomocą komercyjnego zestawu. Można użyć jednoniciowego zestawu egzonukleazy, ale metody oparte na kolumnach lub wytrącaniu również dobrze sprawdzają się w usuwaniu nieinkorporowanych starterów i jednoniciowych DNA. Sekwencjonować amplikony 16S za pomocą startera r910 (Tabela 1), ustawiając reakcje zgodnie ze specyfikacją urządzenia do sekwencjonowania.</li>
	<li>Użyj wynikowej sekwencji DNA, aby przesłuchać bazę danych DNA NCBI za pomocą funkcji blastn (<a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a>). Tożsamość nukleotydów większa niż 97% jest zwykle uznawana za tożsamość gatunkową.</li>
</ol>
7. Mapowanie i charakterystyka całkowników i tablic kasetowych
UWAGA: Integrony klasy 1 pochodzące z ekosystemów zdominowanych przez człowieka prawdopodobnie będą najpowszechniejszymi integronami we wszystkich twoich próbkach. Wszystkie te integrony mają niedawne pojedyncze pochodzenie i dlatego mają wysoce konserwatywną sekwencję DNA5.
<ol>
	<li>Rozróżnij integrony klasy 1 pochodzące ze źródeł ludzkich od tych, które występują naturalnie w próbkach środowiskowych, wykonując PCR z zestawem starterów intI1F165/intI1R47610 (Tabela 1). 
	UWAGA: Integrony klasy 1 z bakterii klinicznych lub komensalnych wygenerują produkt ~ 300 pz, podczas gdy integrony klasy środowiskowej 1 nie wytworzą żadnego produktu.</li>
	<li>Scharakteryzuj integrony kliniczne poprzez amplifikację macierzy kasetowej za pomocą zestawu starterów HS458/HS459. Ten PCR wzmocni obszar między intI1 a konserwatywnym segmentem 3' na końcu większości macierzy kasetowych. Ponieważ liczba i tożsamość kaset jest zmienna, rozmiar produktu PCR również będzie się różnić.</li>
	<li>Oczyść amplikony i zsekwencjonuj DNA za pomocą każdego ze starterów amplifikacyjnych. Użyj sekwencji, aby przesłuchać bazy danych DNA za pomocą funkcji blastn (<a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a>).</li>
	<li>Upewnij się, że nazewnictwo kaset jest zgodne ze znormalizowaną nomenklaturą9, ponieważ wiele depozycji danych dla kaset z genami integronowymi używa niespójnych lub niejednoznacznych nazw. Szczególną uwagę należy zwrócić na nowe kasety genów, ponieważ mogą one kodować nowe fenotypy, w tym geny nadające zwiększoną zdolność przenoszenia, patogenność lub zjadliwość8,21. 
	UWAGA: Przedkliniczne formy integronu klasy 1 nadal krążą w środowisku naturalnym. W szczególności najbardziej interesujące są te, które są związane z aktywnymi transpozonami Tn402 26. Tablice kasetowe tych integronów nie będą wzmacniane za pomocą zestawu starterów HS458/HS459, ale mogą być wzmacniane za pomocą zestawu starterów MRG284/MRG285 (Tabela 1), generując amplikony o zmiennej wielkości w zależności od zawartości kasety. Produkty PCR powinny zostać oczyszczone, a DNA zsekwencjonowane zgodnie z opisem w ppkt 7.2.</li>
</ol>

<ol><li>Bush, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tackling antibiotic resistance.</a> Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).</li>
<li>Davies, J., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+evolution+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Origins and evolution of antibiotic resistance.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).</li>
<li>Costa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+is+ancient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance is ancient.</a> Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+consequences+of+antibiotic+use+for+the+resistome%2C+mobilome+and+microbial+pangenome%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome.</a> Front. Microbiol. 4, 4(2013).</li>
<li>Gillings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+class+1+integrons+and+the+rise+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance.</a> J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).</li>
<li>Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relative+strength+of+tandem+promoters+for+the+antibiotic-resistance+genes+of+several+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons.</a> Gene. 142 (1), 49-54 (1994).</li>
<li>Partridge, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+attI1+site+of+class+1+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definition of the attI1 site of class 1 integrons.</a> Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrons%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrons: Past, Present, and Future.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).</li>
<li>Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cassettes+and+cassette+arrays+in+mobile+resistance+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+class+1+integron-integrase+gene+as+a+proxy+for+anthropogenic+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.</a> ISME J. In press, (2014).</li>
<li>Gaze, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impacts+of+anthropogenic+activity+on+the+ecology+of+class+1+integrons+and+integron-associated+genes+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment.</a> ISME J. 5, 1253-1261 (2011).</li>
<li>Gerzova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microbiota+composition+and+presence+of+selected+antibiotic+resistance+genes+in+carriage+water+of+ornamental+fish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish.</a> PLoS ONE. 9, e103865(2014).</li>
<li>Power, M., Emery, S., Gillings, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+the+wild%3A+dissemination+of+antibiotic+resistance+determinants+via+a+species+recovery+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program.</a> PLoS ONE. 8, e63017(2013).</li>
<li>Stokes, H. W., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+flow%2C+mobile+genetic+elements+and+the+recruitment+of+antibiotic+resistance+genes+into+Gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).</li>
<li>Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+diversity+of+conjugative+plasmids+in+integron-carrying+bacteria+from+wastewater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments.</a> FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+and+composition+of+a+plasmid+metagenome+from+a+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant.</a> J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).</li>
<li>Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+systems%3A+maintaining%2C+mixing+and+mobilising+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22TREE%22%5BJournal%5D)">Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance.</a> TREE. 26 (6), 278-284 (2011).</li>
<li>Stalder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impact+of+hospital+effluent+on+dissemination+of+the+integron+pool%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool.</a> ISME J. 8, 768-777 (2014).</li>
<li>Allen, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Call+of+the+wild%3A+antibiotic+resistance+genes+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.</a> Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).</li>
<li>Wellington, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+natural+environment+in+the+emergence+of+antibiotic+resistance+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria.</a> Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+a+Tn402-like+class+1+integron+with+a+novel+cassette+array+via+flanking+miniature+inverted-repeat+transposable+element-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures.</a> Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).</li>
<li>Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underappreciated+role+of+regionally+poor+water+quality+on+globally+increasing+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance.</a> Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).</li>
<li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistome%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistome: what's new.</a> Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li>
<li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li>
<li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+the+environment%3A+A+link+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li>
<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
<li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+DJ+%22Nucleic+Acid+Techniques+in+Bacterial+Systematics%22">Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics</a>. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).</li>
<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic istotnego do ujawnienia.

Identyfikacja integronów i związanych z nimi kaset genowych jest potencjalnie kluczowym krokiem w przewidywaniu pojawienia się nowych patogenów oportunistycznych, śledzeniu szlaków patogenów w łańcuchu pokarmowym człowieka oraz identyfikacji nowych determinantów oporności i wirulencji8,21,26. Celem pracy było opisanie uproszczonego podejścia do badań przesiewowych próbek pod kątem integronów klasy 1, scharakteryzowanie ich układów kasetowych i identyfikacja gatunków bakterii, w których występują. Kluczowe krok...

Odkrycie antybiotyków było jednym z największych osiągnięć naukowychXX wieku. Jednak stosowanie i nadużywanie antybiotyków doprowadziło do szybkiej ewolucji bakterii opornych na antybiotyki, które obecnie stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego w XXIwieku. Wzrost liczby szczepów bakteryjnych opornych na większość opcji leczenia zwiększa prawdopodobieństwo, że wkraczamy w erę, w której leki przeciwdrobnoustrojowe nie są już skuteczne1,2.
Genetyczna maszyneria, która nadaje odporność na antybiotyki, to starożytny system, wyprzedzający ludzi i presję selekcji antybiotyków o miliony lat3. Ruchome elementy genetyczne, takie jak plazmidy, transpozony, wyspy genomowe, integracyjne elementy sprzężone i integrony, mogą rozprzestrzeniać geny oporności na antybiotyki (ARG) zarówno w obrębie gatunków bakterii, jak i między nimi4. Spośród nich integrony odegrały kluczową rolę w rozprzestrzenianiu się ARG, pomimo faktu, że opierają się na plazmidach i transpozonach do mobilizacji i insercji do genomów bakteryjnych5. Integrony wychwytują kasety genów za pomocą integrazy integronowej, a następnie wyrażają kasety za pomocą promotora kodowanego przez integron6,7 (ryc. 1). Kasety genowe Integron to małe ruchome elementy składające się z pojedynczych otwartych ramek odczytu (ORF), których produkty mogą nadawać oporność na antybiotyki lub środki dezynfekujące8. Integrony klasy 1 to integrony najczęściej odzyskiwane z izolatów klinicznych5, w których łącznie pozyskały ponad 130 różnych kaset genów opornościna antybiotyki 9.
Rozprzestrzenianie się integronów klasy 1 na związane z człowiekiem bakterie komensalne i chorobotwórcze generuje strumienie ludzkich odchodów, które zawierają dużą ilość tych elementów genetycznych10. Szacuje się, że każdego roku w Wielkiej Brytanii11 bakterii zawierających integrony klasy 1 uwalnianych jest do osadów ściekowych11 . Nic więc dziwnego, że integrony klasy 1 nadające oporność na antybiotyki są obecnie wykrywane w mikrobiocie dzikich ptaków, ryb i innych rodzimych dzikich zwierząt12-14. Uwalnianie integronów z powrotem do środowiska stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego, ponieważ nadal dochodzi do pozyskiwania nowych kaset genowych i złożonych rearanżacji z innymi ruchomymi elementami, szczególnie w oczyszczalniach ścieków i innych zbiornikach wodnych15-18. Środowisko naturalne staje się wówczas żyznym gruntem rekrutacyjnym dla nowych determinantów oporności i oportunistycznych patogenów19,20. Nowe bakterie zawierające integrony i nowe ARG mogą powrócić do społeczności ludzkiej poprzez skażoną wodę i żywność21,22. Nadzór nad środowiskowymi ARG jest kluczową strategią dla zrozumienia oporności na antybiotyki i zarządzania nią w przyszłości23. W szczególności należy zwrócić uwagę na środki spożywcze, które są spożywane na surowo lub lekko ugotowane, ponieważ stanowią one największe zagrożenie dla przenoszenia nowych elementów ruchomych i patogenów.
W tym protokole przedstawiono uproszczone podejście do wykrywania, identyfikacji i charakterystyki integronów klasy 1 i związanych z nimi kaset genowych w produktach spożywczych (Rysunek 2). Wykorzystując kombinację hodowli i reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), integrony można szybko wykryć w złożonych zbiorowiskach bakteryjnych i pojedynczych izolatach. Podano metody identyfikacji gatunków bakterii oraz konformacji i tożsamości kaset genów związanych z integronem. Metoda jest odpowiednia dla szerokiej gamy pokarmów roślinnych i zwierzęcych, a dla każdego z tych rodzajów żywności podano przykłady typowych przepływów pracy.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Bezbarwny Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Stosowany we wszystkich PCR</td></tr><tr><td>RNAzy (rybonukleaza A z trzustki bydlęcej)</td> <td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Stosowany we wszystkich PCR</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny HinFI</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Stosowany do trawienia produktów 16S rDNA PCR. Enzym jest dostarczany z optymalnym buforem i</td></tr><tr><td>drabinką BSA 100 pz</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Stosowany jako wzorzec rozmiaru na wszystkich żelach agarozowych</td></tr><tr><td>GelRed DNA barin</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>UWAGA: Podczas pracy z tym materiałem należy nosić środki ochrony osobistej</td></tr><tr><td>Tiocyjanian guanidyny</td> Life <td>Technologies</td><td>AM9422</td><td>UWAGA: Podczas obchodzenia się z tym materiałem należy nosić środki ochrony osobistej</td></tr><tr><td>CLS-TC Rozwiązanie</td>: <td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Roztwór do ponownego zawieszania stosowany na początku ekstrakcji genomowego DNA</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep probówki</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tube wymagane do mechanicznego rozbijania ścian komórkowych bakterii. Ten kod jest używany dla opakowań po 500 tubek, dostępne są mniejsze ilości.</td></tr><tr><td>Macierz wiążąca</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>Rozcieńczony w stosunku 1:5 6 M tiocyjanianem guanidyny i stosowany w metodzie ekstrakcji genomowego DNA.</td></tr><tr><td>Maszyna Fast Prep</td><td>MP Biomedicals</td><td>Liczba dostępnych opcji</td><td>MP Biomedicals posiada wiele maszyn FastPrep dostępnych do zakupu. Więcej informacji można znaleźć na stronie <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe środków spożywczych na obecność integronów klasy 1 i kaset genowych

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Oporność na antybiotyki jest jednym z największych zagrożeń dla zdrowia w XXIwieku. Nabywanie genów oporności poprzez boczny transfer genów jest głównym czynnikiem rozprzestrzeniania się różnych mechanizmów oporności. Wśród elementów DNA ułatwiających transfer boczny, integrony klasy 1 są w dużej mierze odpowiedzialne za rozprzestrzenianie się determinantów oporności na antybiotyki wśród patogenów Gram-ujemnych. W sumie integrony te nabyły i rozpowszechniły ponad 130 różnych genów oporności na antybiotyki. Przy ciągłym stosowaniu antybiotyków, integrony klasy 1 stały się wszechobecne w komensalach i patogenach ludzi i ich udomowionych zwierząt. W związku z tym można je teraz znaleźć we wszystkich strumieniach ludzkich odchodów, gdzie nadal nabywają nowe geny i mają potencjał, aby powrócić do ludzi poprzez łańcuch pokarmowy. Protokół ten szczegółowo opisuje uproszczone podejście do wykrywania integronów klasy 1 i związanych z nimi kaset genów oporności w środkach spożywczych przy użyciu hodowli i PCR. Korzystając z tego protokołu, naukowcy powinni być w stanie: zbierać i przygotowywać próbki do tworzenia wzbogaconych kultur i badań przesiewowych pod kątem integronów klasy 1; izolować pojedyncze kolonie bakteryjne w celu identyfikacji izolatów integron-dodatnich; identyfikować gatunki bakterii, które zawierają integrony klasy 1; i scharakteryzować te integrony i związane z nimi kasety genowe.

Przesiewowe badanie kultur mieszanych i izolatów bakteryjnych pod kątem obecności intI1
Zestaw starterów HS463a/HS464 PCR może być wykorzystany do wykrywania obecności genu integrazji integronu klasy 1, intI1 (Rysunek 1). Ten zestaw starterów sprawdza się w wykrywaniu intI1 w kulturach mieszanych i jest również stosowany do przesiewania kolonii bakteryjnych pobranych z płyt z wysianą kulturą (Rysunek 2). Izolaty dodatnie powinny dawać pojedynczy...

Ten protokół opisuje wykrywanie integronów klasy 1 i związanych z nimi kaset genowych w produktach spożywczych.

Badania przesiewowe środków spożywczych na obecność integronów klasy 1 i kaset genowych

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie usprawnionego podejścia do wykrywania integronów klasy 1 oraz powiązanych z nimi kaset genowych w produktach spożywczych. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie wzbogaconej kultury bakteryjnej z wybranego produktu spożywczego. Drugim krokiem jest przesiewowe badanie kultury w kierunku obecności integronów klasy 1 przy użyciu techniki PCR oraz izolacja pojedynczych kolonii z mieszanej kultury dodatniej pod kątem obecności integronów.Po przesiewowym badaniu pojedynczych kolonii pod kątem obecności integronów, należy wyizolować genomowe DNA z tych kolonii do diagnostycznej reakcji PCR, aby zróżnicować gatunki bakteryjne i wykryć obecność kaset genowych. Ostatnim krokiem jest oczyszczenie produktów PCR i przekazanie ich do analizy sekwencji DNA. Ostatecznie analiza sekwencji DNA służy do charakterystyki kaset genowych w obrębie integronu klasy 1 oraz identyfikacji gatunków, w których one występują.Oporność na antybiotyki jest jednym z głównych problemów, z jakimi mierzy się medycyna w XXI wieku. Jednym ze sposobów zarządzania opornością na antybiotyki jest wykrywanie i śledzenie genów oporności na antybiotyki w środowisku, n

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Tutaj prezentujemy protokół użycia istniejących wcześniej konstruktów delecji kasety oporności na antybiotyki jako podstawy do tworzenia mutantów delecyjnych w innych szczepach E. coli. Takie mutacje delecji mogą być mobilizowane i wprowadzane do odpowiedniego locus szczepu biorcy za pomocą transdukcji bakteriofaga P1.

Wytwarzanie delecji genów w Escherichia coli przez transdukcję P1 z kasetami oporności na antybiotyki podlegającymi akcyzie

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT), który wzbudził szerokie zainteresowanie w dziedzinie wykrywania patogenów. W tym miejscu przedstawiamy zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP jako szybką, niezawodną i solidną metodę badań przesiewowych Salmonelli w żywności zwierzęcej i potwierdzania przypuszczalnej obecności Salmonelli w izolacji hodowli.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Campylobacter jest główną przyczyną bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit przenoszonego przez żywność na całym świecie. Pomimo tego, że zakłady wprowadzają środki mające na celu zmniejszenie rozpowszechnienia w swoich obiektach, skażone produkty konsekwentnie docierają do konsumentów. Technika opracowana w ciągu ostatnich dwunastu lat rozwiązuje problemy związane z ograniczeniami istniejących metod izolowania i wykrywania Campylobacter spp. z surowego mięsa.

Wykrywanie i izolacja Campylobacter spp. z surowego mięsa

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

To badanie ustanawia zestaw standardowych procedur operacyjnych (SOP) do skutecznego badania przesiewowego i izolowania bakterii jelitowych zdolnych do rozszczepiania C-glikozydów.

Badania przesiewowe i izolacja bakterii jelitowych rozszczepiających glikozydy C

Poznaj metodę wykrywania integronów klasy 1 i kaset genowych w żywności za pomocą PCR i sekwencjonowania DNA. Protokół umożliwia identyfikację bakterii opornych na antybiotyki w surowych produktach spożywczych.

Badania przesiewowe środków spożywczych na obecność integronów klasy 1 i kaset genowych

Przeglądaj więcej filmów