Name: Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Poznaj metodę klonowania i produkcji wektorów adenowirusowych o dużej pojemności przy użyciu endonukleaz homingowych. Technika ta umożliwia dostarczenie do 35 kb DNA obcego w terapii genowej chorób dziedzicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant DFG EH 192/5-1 (A.E.), unijny (E-rare-2) projekt Transposmart (A.E.), UWH Forschungsförderung (E.S. i W.Z) oraz program doktorancki Uniwersytetu Witten/Herdecke (P.B.). J.L. był wspierany przez stypendium Chińskiej Rady Stypendialnej, a T.B. i M.G przez fundację Else Kröner-Fresenius (EKFS).

<ol><li>Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus vectors for gene delivery.</a> Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).</li>
<li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus%3A+the+first+effective+in+vivo+gene+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector.</a> Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).</li>
<li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).</li>
<li>Morral, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+a+helper-dependent+adenoviral+vector+yield+supraphysiological+levels+of+alpha1-antitrypsin+with+negligible+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity.</a> Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).</li>
<li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-dependent+adenovirus+vectors+elicit+intact+innate+but+attenuated+adaptive+host+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo.</a> J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).</li>
<li>Ehrhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-deleted+adenoviral+vector+results+in+phenotypic+correction+of+canine+hemophilia+B+without+liver+toxicity+or+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia.</a> Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).</li>
<li>Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper+dependent+adenovirus+vectors%3A+progress+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects.</a> Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).</li>
<li>Mizuguchi, H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+recombinant+adenovirus+vector+by+an+improved+in+vitro+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method.</a> Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).</li>
<li>Mizuguchi, H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+constructing+E1-+and+E1%2FE4-deleted+recombinant+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors.</a> Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).</li>
<li>Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+adenoviral+helper-dependent+vector+results+in+long-term+therapeutic+levels+of+human+coagulation+factor+IX+at+low+doses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo.</a> Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).</li>
<li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiony tu protokół pozwala na oczyszczanie wektorów HCAdV na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5 w oparciu o wcześniej opisane procedury 4,12. Genom HCAdV w plazmidzie pAdFTC jest pozbawiony wszystkich genów adenowirusa i przenosi tylko 5'- i 3'- ITR oraz sygnał pakowania. W tej strategii HV AdNG163R-2 4 dostarcza wszystkich genów niezbędnych do wydajnej produkcji wirusa w trans. Oferuje to pojemność pakowania do 35 kb, co wyraźnie przewyższa AdV pierwszej i drugiej generacji lub szer...

Dla zastosowań terapeutycznych genów bardzo ważne jest unikanie cytotoksycznych i immunogennych skutków ubocznych spowodowanych ekspresją białek wirusowych, samego transgenu lub przez napływające białka wirusowe. Wektory adenowirusowe (AdV) są szeroko stosowane do wprowadzania obcego DNA do wielu różnych komórek w celu zbadania wpływu ekspresji transgenu 1,2. Najbardziej zaawansowana wersja AdV jest reprezentowana przez wektory adenowirusowe o dużej pojemności (HCAdV), pozbawione wszystkich sekwencji kodujących wirusa 3,4, a tym samym oferujące pojemność do 35 kb w połączeniu z niską immunogennością i niską toksycznością 5-8. Ze względu na dużą pojemność pakowania umożliwiają dostarczanie dużych lub wielu transgenów przy użyciu pojedynczej dawki wektora. W związku z tym stanowią one cenne narzędzie dla społeczności naukowej.
W przeciwieństwie do AdV pierwszej lub drugiej generacji, które nie mają wczesnych genów E1 i/lub E3, które można łatwo wytworzyć przy użyciu komercyjnych zestawów, budowa genomu wektora i produkcja wirusa HCAdV jest bardziej złożona. System budowy genomów HCAdV oparty jest na plazmidzie pAdFTC przenoszącym genom HCAdV pozbawiony wszelkich sekwencji kodujących wirusa oraz plazmidzie wahadłowym pHM5 9-12. Każdy gen zainteresowania o wielkości do 14 kilozasad (kb) może zostać sklonowany do wektora wahadłowego pHM5, w którym miejsce wielokrotnego klonowania jest otoczone miejscami rozpoznawania/rozszczepiania endonukleaz naprowadzających PI-SceI i I-CeuI. W związku z tym sklonowany gen będący przedmiotem zainteresowania może zostać uwolniony przez kolejne trawienia PI-SceI i I-CeuI w celu późniejszej ukierunkowanej insercji do tych samych miejsc restrykcyjnych obecnych w genomie HCAdV zawartym w plazmidzie pAdFTC. W pAdFTC miejsce insercji transgenu znajdujące się między miejscami podziału PI-SceI i I-CeuI jest otoczone przez DNA nadziewarki i niekodujące sekwencje adenowirusowe wymagane do pakowania genomu, takie jak odwrócone powtórzenia końcowe 5' i 3' (ITR) na obu końcach oraz sygnał pakowania za 5'ITR. Dodatkowy nadziewarz DNA zapewnia optymalny rozmiar końcowego genomu HCAdV w zakresie od 27 do 36 kb, aby zapewnić wydajne pakowanie podczas produkcji wirusa. Ponieważ pAdFTC jest dużym plazmidem o wielkości do 45 kb (w zależności od wielkości wstawionego transgenu), a użycie endonukleaz naprowadzających się z porównywalnie długimi miejscami rozpoznawania DNA wykazuje silne wiązanie DNA, podczas transferu transgenu z pHM5 do pAdFTC konieczne jest kilka etapów oczyszczania. Zaleca się ostrożne obchodzenie się z siłami ścinającymi.
ITR genomu HCAdV są otoczone przez miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych NotI, zlokalizowane bezpośrednio przed 5'ITR i poniżej 3'ITR 12. W związku z tym HCAdV może być uwalniany przez trawienie NotI w celu późniejszej transfekcji genomu wirusa do linii komórkowej producenta HCAdV. Należy zauważyć, że użycie enzymu restrykcyjnego NotI do uwalniania genomu wirusa z plazmidu pAdFTC oznacza, że wstawiony transgen jest pozbawiony miejsc rozpoznawania DNA NotI. Komórki produkcyjne oparte na komórkach HEK293 (116 komórek) stabilnie eksprymują rekombinazę Cre. W celu amplifikacji wirusa 116 komórek jest jednocześnie zakażonych wirusem pomocniczym (HV), dostarczając wszystkie geny AdV potrzebne do replikacji i pakowania w trans 3,4. HV to AdV pierwszej generacji z floksowanym sygnałem upakowania, który jest usuwany podczas amplifikacji wirusa przez rekombinazę Cre wyrażaną w 116 komórkach 4. Gwarantuje to, że genomy HCAdV zawierające nienaruszony sygnał opakowania są zamknięte.
Wstępne wzmacnianie HCAdV odbywa się poprzez przeprowadzanie szeregowych etapów pasażowania w 116 komórkach hodowanych na powierzchniach w naczyniach do hodowli tkankowych. Po każdym przejściu cząsteczki wirusa są uwalniane z zainfekowanych komórek, przeprowadzając trzy kolejne etapy zamrażania i rozmrażania. Z każdym pasażem coraz więcej komórek jest zakażanych 1/3 lizatu komórkowego z poprzedniego pasażu. Na koniec lizat z ostatniego etapu wstępnej amplifikacji jest używany do infekowania komórek produkcyjnych hodowanych w zawiesinie w kolbie przędzarkowej w celu amplifikacji na dużą skalę. Wiriony są oczyszczane z komórek zawiesiny przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu 4,12. Dzięki tej procedurze puste cząstki i w pełni zmontowane cząstki są rozdzielane na dwa odrębne pasma. W celu dalszego zagęszczenia cząstek HCAdV przeprowadza się drugi niestopniowy etap ultrawirowania. Następnie powstałe prążek zawierający HCAdV jest pobierany i dializowany w buforze fizjologicznym. Końcowe preparaty wektorowe są charakteryzowane pod względem liczby bezwzględnych cząstek wirusa, cząstek zakaźnych oraz poziomów zanieczyszczenia HV. Bezwzględne cząstki wirusa można określić przez lizę cząstek wirusa i pomiar absorbancji przy 260 nm lub przez wykonanie ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) 12. Zakaźność oczyszczonych cząstek wirusa można określić za pomocą qPCR mierzącego genomy HCAdV obecne w zakażonych komórkach 3 godziny po zakażeniu.

<table><tbody><tr><td>CeuI</td><td>New England Biolabs</td> Przegląd <td>ograniczeń</td><td>R0699S</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>Przegląd ograniczeń</td><td>R0696S</td></tr><tr><td>Ligaza T4 New</td><td>Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>ligacja</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>Przegląd ograniczeń R0604S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>Przegląd ograniczeń R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna jelit cieląt ()</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>defosforylacja strawionych plazmidów</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>wybór CRE wyrażających 116 komórek</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych Hek293T</td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli komórkowych Minimal Essential Medium (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s bufor fosforanowy sól fizjologiczna (DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>mycie komórek, ponowne zawieszenie komórek</td></tr><tr><td>Butelka CLS430281 do przechowywania 250 ml</td><td>Zakażenie</td><td></td><td>116 komórek hodowanych w zawiesinie</td></tr><tr><td>500 ml PP CentrifugeTubes</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>sedymentacja komórek z hodowli zawiesinowej</td></tr><tr><td>Kolba obrotowa</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>wzrost 116 komórek w zawieszenie</td></tr><tr><td>Ultra Clear Ultra Probówki do ultrawirówek</td> Wirowanie w <td></td><td>gradinie gęstości</td><td>344059 Beckmann Coulter</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td> Wirowanie <td>w gradinie gęstości</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Wirowanie</td><td>w gradionym kącie gęstości</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrapor Membrana</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>rurki dializacyjne</td></tr><tr><td>Gotowe do użycia kasety do dializy&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>dializa</td></tr><tr><td>one shot DH10B elektrokompetentna E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>transformacja reakcji ligacji</td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>SuperFect Odczynnik do transfekcji</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>transfekcja 116 komórek</td></tr><tr><td>opti MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>transfekcja 116 komórek</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 dotykowy&nbsp;</td><td>Maszyna do qPCR</td> <td>Biorad</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/Chloroform/Alkohol izoamylowy&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>wirowanie w gradimencie gęstości</td></tr><tr><td>octan sodu 99%</td> <td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>Wytrącanie DNA</td></tr><tr><td>LB średnie&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>bakteryjne podłoże wzrostowe</td></tr><tr><td>etanol&nbsp; 99,8% czysty</td><td>Carl Roth</td><td>9065,5&nbsp;</td><td>Wytrącanie i mycie DNA</td></tr><tr><td>SDS 99,5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>liza&nbsp; bufor</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>liza&nbsp; bufor</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>bufor do dializy&nbsp; bufor</td></tr><tr><td>glicerynowy 99,5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>bufor do dializy</td></tr><tr><td>MgCl2 98,5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>Bufor do dializy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>opcjonalny bufor dializacyjny</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>opcjonalny bufor do dializy</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>opcjonalny bufor do dializy</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>Opcjonalny bufor do dializy</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki</td><td>Sarstedt</td><td>72,730,005</td><td>Przechowywanie preparatów wirusowych w temperaturze -80 &; Z</td></tr></tbody></table>

klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Wektory adenowirusowe o dużej pojemności (HCAdV) pozbawione wszystkich sekwencji kodujących wirusy stanowią jeden z najbardziej zaawansowanych wektorów dostarczania genów ze względu na ich wysoką zdolność pakowania (do 35 kb), niską immunogenność i niską toksyczność. Jednak w wielu laboratoriach stosowanie HCAdV jest utrudnione ze względu na skomplikowaną procedurę budowy genomu wektorowego i produkcji wirusa. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół efektywnego klonowania i produkcji HCAdV w oparciu o plazmid pAdFTC zawierający genom HCAdV. Budowa genomów HCAdV opiera się na systemie wektorów klonujących wykorzystującym endonukleazy naprowadzające (I-CeuI i PI-SceI). Każdy gen o wielkości do 14 kb może zostać subklonowany do wektora wahadłowego pHM5, który zawiera miejsce wielokrotnego klonowania otoczone przez I-CeuI i PI-SceI. Po uwolnieniu transgenu za pośrednictwem I-CeuI i PI-Sce I-Sz wektora wahadłowego, transgen może zostać wprowadzony do wektora klonowania HCAdV pAdFTC. Ze względu na duży rozmiar plazmidu pAdFTC i długie miejsca rozpoznawania użytych enzymów związanych z silnym wiązaniem DNA, konieczne jest ostrożne obchodzenie się z fragmentami klonowania. W celu produkcji wirusa genom HCAdV jest uwalniany przez trawienie NotI i transfekowany do linii komórkowej producenta opartej na HEK293 stabilnie eksprymującej rekombinazę Cre. Aby dostarczyć wszystkie geny adenowirusa do amplifikacji adenowirusa, wymagana jest koinfekcja wirusem pomocniczym zawierającym sygnał pakowania otoczony miejscami loxP. Wstępną amplifikację wektora przeprowadza się w komórkach produkcyjnych hodowanych na powierzchni, a amplifikację wektora na dużą skalę przeprowadza się w kolbach obrotowych z komórkami produkcyjnymi hodowanymi w zawiesinie. W celu oczyszczenia wirusa przeprowadza się dwa etapy ultrawirowania oparte na gradientach chlorku cezu, a następnie dializę. Tutaj przedstawiono porady, triki i skróty opracowane w ciągu ostatnich lat pracy z tym systemem wektorowym HCAdV.

Przedstawiono reprezentatywne przykłady klonowania, amplifikacji i oczyszczania preparatów HCAdV. Przedstawiono przegląd strategii klonowania (Rysunek 1) oraz reprezentatywne przykłady klonowania i uwalniania genomu HCAdV poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi (Rysunek 2). Pokazano typowy obraz restrykcyjny po uwolnieniu kasety ekspresyjnej GOI z pHM5 za pomocą trawienia PI-SceI i I-CeuI oraz następującej po nim ekstrakcji fenolowo-ch...

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie wysokopoemocjonalnego wektora adenowirusowego z delecją genów, służącego do dostarczania i ekspresji terapeutycznych transgenów w żywych komórkach lub organizmach. Metoda ta może pomóc w dziedzinie terapii genowej w dostarczaniu dużych transgenów, które nie mieszczą się w innych wektorach wirusowych. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że adenowirusy o wysokiej pojemności są pozbawione genów wirusowych.Za pomocą tych wektorów można dostarczyć do 35 kb obcego DNA. Zastosowanie tej techniki obejmuje terapię chorób dziedzicznych, ponieważ pomaga w dostarczaniu konstrukcji terapeutycznych służących do korekcji lub dodawania genów. Metoda ta stanowi zaawansowane narzędzie do biodostarczania transgenów terapeutycznych i może być stosowana zarówno w hodowlach komórkowych, jak i w organizmach żywych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ amplifikacja i oczyszczanie wektora wymagają pewnego doświadczenia. Podczas oczyszczania wektora niezbędna jest odpowiednia precyzja. Próbkę rozcieńczonego dziesięciokrotnie zlinearyzowanego plazmidu ekspresyjnego genomu adenowirusa o wysokiej pojemności należy sprawdzić za pomocą elektroforezy żelowej.Powinny być możliwe do wykrycia dwa fragmenty: fragment o wielkości 9 kb stanowiący szkielet plazmidu pAd-FTC oraz drugi fragment DNA o wielkości od 28 do 36 kb, obejmujący genom wysokopojemnego adenowirusa wraz z genem zainteresowania. Następnie, zgodnie ze standardowymi procedurami, należy przeprowadzić transfekcję komórek linii 116 w szalce o średnicy 60 mm przy konfluencji 50-80%, stosując 5 µg zlinearyzowanego genomu wysokopojemnego adenowirusa. 16-18 godzin po transfekcji należy ostrożnie usunąć pożywkę i dodać 3 ml świeżej pożywki.Następnie zainfekuj komórki wirusem pomocniczym AdNG 163R2, stosując pięć jednostek transdukcyjnych na komórkę. Inkubuj w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Przez pierwszą godzinę inkubacji wstrząsaj płytką co 20 minut, aby równomiernie rozprowadzić wirus pomocniczy do wszystkich komórek.48 godzin po infekcji zebrać komórki, wypłukując je z naczynia hodowlanego za pomocą pożywki hodowlanej. Odstawić 0,5 ml alikwot komórek z pasażu zero do izolacji genomowego DNA. Następnie wielokrotnie zamrażać i rozmrażać 2,5 ml alikwot komórek z pasażu zero poprzez zanurzanie w ciekłym azocie.Lub umieszczenie komórek w zamrażarce o temperaturze -80 °C, a następnie przeniesienie ich do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C 3-4 razy. Wymieszać 2,5 ml lizatu z jednym ml świeżej pożywki i dodać wirusa pomocniczego w ilości 2 jednostek transformujących na komórkę. Odessać pożywkę z 60 mm szalki zawierającej komórki 116 przy 90-95% konfluencji i dodać mieszaninę wirusową do komórek.Inkubuj komórki przez 48 godzin w taki sam sposób jak wcześniej. Następnie zbierz komórki i powtórz procedury zamrażania/rozmrażania oraz infekcji dwukrotnie, aby uzyskać lizaty z pierwszego i drugiego pasażu. Po uzyskaniu lizatu z drugiego pasażu zmieszaj 2,5 mililitrów lizatu z 17,5 mililitrów świeżej pożywki i dodaj dwie jednostki transformujące na komórkę wirusa pomocniczego.Odsaj przełożkę z 150 milimetrowej szalki z komórkami 116, osiągając 80 do 100% konfluencji, a następnie zainfekuj komórki mieszaniną wirusową. 48 godzin po infekcji pobierz lizat z trzeciego pasażu, stosując zaprezentowaną przed chwilą procedurę. Aby rozpocząć ten krok, dodaj 900 mililitrów uprzednio ogrzanej przełożki do 3-litrowej kolby do hodowli w mieszadle.Usunąć medium z co najmniej 10 poszczególnych szalek o średnicy 150 mm zawierających komórki 16 cells przy konfluencji 90 do 100%. Następnie wypłukać komórki 10 mL świeżego, uprzednio ogrzanego medium. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.Następnie przenieście komórki bezpośrednio do kolby z mieszadłem. Inkubujcie kolbę na mieszadle magnetycznym w inkubatorze do hodowli tkanek przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Ustawcie mieszadło magnetyczne na 70 RPM, aby zapobiec przyleganiu komórek do szklanych powierzchni.24 godziny po przygotowaniu kolby z hodowlą w mieszalniku typu spinner, dodać 500 mililitrów świeżej pożywki. Powtórzyć ten krok po kolejnych 24 godzinach. 72 godziny po przygotowaniu hodowli, dodać do kolby jeden litr świeżej pożywki, tak aby uzyskać całkowitą objętość trzech litrów zawiesiny komórkowej.Po 24 godzinach zebrać komórki w zawiesinie 1:6 poprzez wirowanie przez 10 minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant i resuspender osad w 150 mL pożywki, pipetując w górę i w dół około 8–10 razy. Przenieść komórki do butelki do przechowywania o pojemności 250 mL wyposażonej w sterylną mieszadło magnetyczne.Następnie przeprowadza się koinfekcję komórek lizatem z trzeciego pasażu oraz dwiema jednostkami transformującymi wirusa pomocniczego na komórkę. W tym przypadku całkowita liczba komórek wynosi około 9×10⁸, zatem dodaje się 1,8×10⁹ jednostek transformujących. Mieszaninę komórek i wirusa miesza się na mieszadle magnetycznym w inkubatorze do hodowli tkankowych przez dwie godziny przy 60 RPM.Upewnij się, że butelka do przechowywania nie jest całkowicie zamknięta, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Dwie godziny po infekcji przenieś całą objętość mieszaniny komórkowej z wirusem z powrotem do trylitrowej kolby do hodowli w mieszadle. Dodaj 1850 mililitrów świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki i inkubuj w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 48 godzin przy 70 RPM.Po 48 godzinach przenieść zawiesinę komórek z wirusem do probówek wirówek o pojemności 500 ml. Następnie wirować przez 10 minut przy 890 ×g w temperaturze pokojowej. Odlać medium i resuspender osad komórkowy w całkowitej objętości 28 ml DPBS.Przechowywać zawiesinę wirusową w komórkach w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia oczyszczania wirusa. Aby przygotować lizat wirusowy do oczyszczania w gradiencie chlorku cezu, zawiesinę wirusową w komórkach zamrozić i rozmrozić cztery razy. Następnie lizat wirusowy wirować przy 500 ×g przez osiem minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy zebrać naskładnik zawierający wysokotitracyjny adenowirus. Należy ostrożnie i powoli pipetować roztwory chlorku cezu do probówek w następującej kolejności: 0,5 ml roztworu o gęstości 1,5 g/cm³, 3 ml roztworu o gęstości 1,35 g/cm³ oraz 3,5 ml roztworu o gęstości 1,25 g/cm³. Na wierzch warstwy o gęstości 1,25 g/cm³ należy nanieść około 4,5 ml oczyszczonego naskładnika wektora.Odwiruj gradienty w ultrawirówce z wykorzystaniem rotora z kątem rozwarcia w temperaturze 12 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny przy 226 000 ×g, aby oddzielić wirionowe cząstki adenowirusa zawierające genom o wysokiej pojemności od cząstek pustych oraz szczątków komórkowych. Po wirowaniu na górze probówek utworzy się rozproszony pas szczątków komórkowych. Poniżej niego można zaobserwować dwa białe pasy.Górny prążek zawiera puste cząsteczki, natomiast dolny prążek to adenowirusy o wysokiej wydajności. Ostrożnie usuń warstwy szczątków komórkowych i pustych cząsteczek. Następnie pobierz jeden mililitr z dolnych prążków z każdej probówki.Przenieś wirusa do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Do zebranych cząsteczek wirusa dodaj do 24 ml roztworu chlorku cezu o gęstości 1,35 g/cm³ i dokładnie wymieszaj. Napełnij probówki do wirowania po brzegi roztworem wirusa w chlorku cezu o gęstości 1,35 g/cm³.Następnie odwiruj próbki przez noc w ultrawirówce przy prędkości 226 000 ×g w temperaturze 12 °C, używając rotora z kątem lub rotora odchylającego (swing-out) z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem. Usuń górne warstwy z powierzchni za pomocą pipety. Następnie, używając nowej końcówki do pipety, pobierz adenowirusy o wysokiej wydajności obecne w wyraźnym dolnym prążku.Na koniec przeprowadzić dializę zebranych cząsteczek wirusa w celu wymiany buforu. Następnie oznaczyć miano końcowego preparatu zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Ten histogram przedstawia bezwzględną liczbę cząsteczek dla pojedynczego preparatu wektora, wyznaczoną za pomocą trzech różnych metod: miana OD mierzonego za pomocą gęstości optycznej, miana infekcyjnego oraz zanieczyszczenia wirusem pomocniczym mierzonego za pomocą qPCR.Tutaj przedstawiono stosunek całkowitej liczby zakaźnych cząsteczek adenowirusów o wysokiej pojemności do poziomów zanieczyszczenia wirusem pomocniczym, zmierzonych za pomocą qPCR. Jeśli w wektorze znajduje się gen markera fluorescencyjnego, można przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną w celu monitorowania preamplifikacji wektora oraz oceny zakaźności końcowego preparatu wektora. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat produkcji adenowirusów o wysokiej pojemności z usuniętymi genami.W szczególności jak wprowadzić transgen oraz jak amplifikować i oczyszczać wektory.

cloning-large-scale-production-high-capacity-adenoviral-vectors-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

W ciągu ostatnich 15 lat, wektory pochodzące od psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) udowodniły swoją skuteczność w transdukcji komórek in vitro i in vivo i są szeroko stosowane w szczepieniach i terapii genowej. W tym miejscu opisujemy procedurę konstruowania, wytwarzania i oczyszczania wektorów CAV2, w wyniku której powstają zawiesiny wirusa o wysokim mianie.

Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Pomimo wyjątkowych właściwości mechanicznych i biochemicznych jedwabiu pająków, materiał ten nie może być pozyskiwany w dużych ilościach metodami konwencjonalnymi. W niniejszej pracy opisujemy efektywną strategię przędzenia sztucznych włókien jedwabiu pająka, co stanowi istotny proces dla badaczy analizujących produkcję jedwabiu pająków oraz jego zastosowanie jako biomateriałów nowej generacji.

Produkcja syntetycznego jedwabiu pajęczego w skali laboratoryjnej

Elektrody jonoselektywne (ASSISE) w całości w stanie stałym, zbudowane z przetwornika z polimeru przewodzącego (CP), zapewniają kilka miesięcy funkcjonalnego życia w płynnych mediach. W tym miejscu opisujemy proces produkcji i kalibracji ASSISE w formacie lab-on-a-chip. Wykazano, że ASSISE zachował profil nachylenia zbliżony do nernstiańskiego po długotrwałym przechowywaniu w złożonych pożywkach biologicznych.

Biochip z wieloma analitami (MAB) oparty na elektrodach jonoselektywnych w stanie stałym (ASSISE) do badań fizjologicznych

Poznaj metodę klonowania i produkcji wektorów adenowirusowych o dużej pojemności przy użyciu endonukleaz homingowych. Technika ta umożliwia dostarczenie do 35 kb DNA obcego w terapii genowej chorób dziedzicznych.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Przeglądaj więcej filmów