Name: Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Naucz się techniki heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem metody mankietowej. Ten model umożliwia badanie uszkodzeń niedokrwienno-reperfuzyjnych oraz mechanizmów odrzucania przeszczepu w biologii transplantacyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.-A. Deutsch jest wspierany przez Dr. Rusche Forschungsprojekt (2014), Deutsche Stiftung für Herzforschung i Deutsche Gesellschaft für Thorax- Herz- und Gefäßchirurgie. M. Krane jest wspierany przez Deutsche Stiftung für Herzforschung (F/37/11), Deutsches Zentrum für Herz Kreislauf Forschung (DZHK B 13-050A; DZHK B 14-013SE) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR3770/7-1; KR3770/9-1)

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Niemieckie Centrum Kardiologiczne w Monachium i Rząd Bawarii, Niemcy (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Zwierzęta były trzymane w określonym obiekcie wolnym od patogenów i otrzymywały opiekę człowieka zgodnie z "Zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi" opracowanymi przez National Society for Medical Research oraz "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" dostarczonym przez National Academy of Sciences i opublikowanym przez National Institutes of Health (publikacja NIH nr 86-23, Poprawiona w 1985). 
UWAGA: Do zabiegu niezbędny jest kompletny zestaw sterylnych narzędzi mikrochirurgicznych, w tym dwa zakrzywione kleszcze i rozszerzacze naczyń (ryc. 2a). Okołooperacyjna profilaktyka antybiotykowa nie jest rutynowo konieczna, ale może być wskazana u zwierząt z obniżoną odpornością. Zwierzęta uśmiercano za pomocą terminalnej inhalacji izofluranu.
Przygotowanie dawcy i pobieranie przeszczepów
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę przez dootrzewnowe wstrzyknięcie midazolamu (5,0 mg/kg), medetomidyny (0,5 mg/kg) i fentanylu (0,05 mg/kg masy ciała). Umieść mysz w pozycji leżącej na polu operacyjnym i potwierdź tolerancję chirurgiczną za pomocą odruchu wycofania pedału.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę trzykrotnie chlorheksydyną i wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej. Cofnij jelita mokrą gazą w lewo, aby odsłonić żyłę główną dolną.</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 j.m. heparyny rozcieńczonej w 0,4 ml soli fizjologicznej przez żyłę główną dolną w celu przeciwdziałania zakrzepom. Naciąć naczynie 1 minutę po heparynizacji.</li>
	<li>Otwórz przeponę i wykonaj obustronną torakotomię, aby odsłonić serce. Przednia ściana klatki piersiowej jest odbita wyżej i utrzymywana na miejscu za pomocą zacisku.</li>
	<li>Usuń grasicę i tępo wypreparuj tkankę łączną między aortą a pniem płucnym. Naciąć prawą żyłę główną górną.</li>
	<li>Nakłuć zmobilizowaną aortę wstępującą na poziomie tułowia ramienno-głowowego za pomocą igły 30 G zamontowanej na strzykawce o pojemności 5 ml i powoli perfundować serce wstecznie, bez nadmiernego ucisku, za pomocą 3 ml zimnego roztworu kardioplegicznego o temperaturze 4 °C. Unikaj przedostawania się powietrza do krążenia wieńcowego. Wlej lodowaty roztwór soli fizjologicznej na przeszczep, aby jeszcze bardziej zwiększyć zatrzymanie akcji serca.</li>
	<li>Przeciąć aortę proksymalnie do początku pnia ramienno-głowowego.</li>
	<li>Podwiązaj dolne i obie żyły główne górne blisko serca z 8-0 jedwabiu i przeciąć je dystalnie do ligatur.</li>
	<li>Wypreparuj pień płucny tak dystalnie, jak to możliwe. Podwiązuj tętnice płucne w pobliżu rozwidlenia za pomocą 8-0 jedwabiu i przeciąć je dystalnie.</li>
	<li>Podwiązuj żyły płucne razem za pomocą jednego 8-0 jedwabna ligatura i transekt je.</li>
	<li>Usuń serce od dawcy i przechowuj je w lodowatym roztworze kardioplegicznym do czasu implantacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odbiorcy
<ol>
	<li>Przygotuj mankiety do zespoleń, przecinając rurkę poliimidową skalpelem nr 11 lub nożyczkami pod mikroskopem. Mankiet składa się z cylindrycznego korpusu i przedłużenia (1/3 obwodu) do umieszczenia zacisku naczyniowego, każdy o długości 1 mm (ryc. 2b).</li>
	<li>Znieczulić zwierzę i potwierdzić tolerancję chirurgiczną, jak opisano powyżej. Wstrzyknąć podskórnie (s.c.) 0,25 ml ciepłego roztworu soli fizjologicznej w celu uzupełnienia płynu.</li>
	<li>Usuń włosy z prawej części szyjki macicy za pomocą golarki elektrycznej i ułóż zwierzę w pozycji leżącej na ciepłej podkładce. Zabezpiecz nogi pasmami taśmy, unikając nadmiernego rozciągania przednich kończyn, ponieważ może to zagrozić oddychaniu. Zakryj oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu. Zdezynfekuj miejsce operowane trzykrotnie chlorheksydyną.</li>
	<li>Wykonaj poprzeczne nacięcie skóry od prawego kąta żuchwy do wcięcia szyjnego.</li>
	<li>Tępo zmobilizuj żyłę szyjną zewnętrzną. Kauteryzuj boczne gałęzie za pomocą kleszczy bipolarnych i przetransektuj je.</li>
	<li>Podziel żyłę szyjną zewnętrzną między ligatury na poziomie zbiegu z żyłą z gruczołem podżuchwowym.</li>
	<li>Przeciągnij zewnętrzną żyłę szyjną przez mankiet i zamknij naczynie proksymalnie, umieszczając zacisk naczyniowy na przedłużeniu mankietu. Usuń ligaturę i przepłucz światło naczynia solą fizjologiczną w stosunku 1:10.</li>
	<li>Umieść ścianę naczynia na mankiecie i przymocuj ją za pomocą ustawionego obwodu 8-0 jedwabna ligatura.</li>
	<li>Usuń powierzchowną część mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.</li>
	<li>Zmobilizuj prawą tętnicę szyjną wspólną i przeciąć naczynie między ligaturami poniżej rozwidlenia tętnicy szyjnej.</li>
	<li>Przeciągnąć tętnicę szyjną przez mankiet i zamknąć naczynie proksymalnie, umieszczając zacisk Yasargil na przedłużeniu mankietu. Usuń ligaturę i przepłucz światło naczynia solą fizjologiczną w stosunku 1:10.</li>
	<li>Delikatnie rozszerz światło tętnicy za pomocą rozszerzacza naczyń, nałóż ścianę naczynia na mankiet i przymocuj ją za pomocą ustawionego obwodu 8-0 jedwabna ligatura.</li>
	<li>Aby uzyskać wystarczającą ilość miejsca do implantacji przeszczepu, należy usunąć prawy płat gruczołu podżuchwowego.</li>
	<li>Utrzymuj wilgotne pole operacyjne aż do implantacji.</li>
</ol>
3. Implantacja przeszczepu
<ol>
	<li>Umieść przeszczep w odcinku szyjnym biorcy do góry nogami, z aortą zorientowaną przyśrodkowo i tętnicą płucną bocznie.</li>
	<li>Przeciągnij aortę przeszczepu przez mankiet z tętnicą szyjną i zabezpiecz zespolenie za pomocą obwodu 8-0 jedwabna ligatura.</li>
	<li>Naciąć pień płucny po jego przedniej stronie i przeciągnąć go przez mankiet z żyłą szyjną zewnętrzną. Ponownie zabezpieczyć zespolenie za pomocą obwodu 8-0 jedwabna ligatura.</li>
	<li>Usuń zacisk na zewnętrznej żyle szyjnej, a następnie odblokuj tętnicę szyjną. Serca natychmiast wypełniają się krwią. Aby zwiększyć reperfuzję, upuść ciepły roztwór soli o temperaturze 37 °C na przeszczep. Zwykle serce rozwija rytm zatokowy w ciągu jednej minuty. Zdejmij przedłużenie mankietu w miejscu żylnym.</li>
	<li>Należy zapewnić prawidłowe ułożenie przeszczepu, zespolenia muszą być wolne od naprężeń, a naczynia bez skręcania. Nie należy kauteryzować naczyń krwionośnych skóry, ponieważ może to utrudnić gojenie się ran. Krwawienie zwykle ustaje samoistnie. Zamknij skórę pojedynczym 8-0 szew ciągły.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 0,25 ml ciepłego roztworu soli fizjologicznej s.c. w celu wymiany płynu.</li>
	<li>Aby zantagonizować narkotyki, wstrzyknąć nalokson (1,2 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) i atipamezol (2,5 mg/kg masy ciała) s.c. Pozostawić zwierzę na ciepłej podkładce, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Obserwuj zwierzę przez co najmniej jedną dodatkową godzinę, aby zarejestrować wszelkie nietypowe zachowanie. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.</li>
	<li>Należy zastosować prewencyjną analgezję buprenorfiną (0,05 mg/kg s.c. trzy razy dziennie) lub alternatywną analgezją zgodnie z lokalnym protokołem instytucjonalnym przez co najmniej 72 godziny po zabiegu.</li>
	<li>Chirurg i weterynarz powinni regularnie widywać zwierzęta. W przypadku utraty masy ciała >15%, apatii, obrzęku lub chirurgicznej infekcji bocznej zwierzęta są poddawane eutanazji za pomocą końcowej inhalacji izofluranu.</li>
</ol>

<ol><li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice.</a> Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).</li>
<li>Chen, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+of+cervical+heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice.</a> Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).</li>
<li>Martins, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+graft+function+in+rodent+models+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation.</a> Microsurgery. 28, 565-570 (2008).</li>
<li>Schramm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subepicardial+microcirculation+in+heterotopically+transplanted+mouse+hearts%3A+an+intravital+multifluorescence+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).</li>
<li>Gong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+modified+cervical+cardiac+transplant+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice.</a> Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).</li>
<li>Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+mouse+cervical+heart+transplantation+using+a+cuff+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique.</a> Transplantation. 51, 896-898 (1991).</li>
<li>Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+kidney+transplantation+in+mice%3A+technique+using+cuff+for+renal+vein+anastomosis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis.</a> PloS one. 8, e77278(2013).</li>
<li>Maglione, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+heterotopic+vascularized+pancreas+transplantation+in+mice+to+assess+ischemia+reperfusion+injury+and+graft+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis.</a> Surgery. 141, 682-689 (2007).</li>
<li>Sucher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+hind-limb+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic hind-limb transplantation in rats.</a> J Vis Exp : JoVE. , (2010).</li>
<li>Kamada, N., Calne, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+liver+transplantation+in+the+rat.+Technique+using+cuff+for+portal+vein+anastomosis+and+biliary+drainage%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage.</a> Transplantation. 28, 47-50 (1979).</li>
<li>Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+liver+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic liver transplantation in rats.</a> J Vis Exp : JoVE. , (2012).</li>
<li>Okazaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+orthotopic+vascularized+aerated+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation.</a> Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).</li>
<li>Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+obliterative+bronchiolitis+in+a+murine+model+of+orthotopic+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation.</a> J Vis Exp : JoVE. , (2012).</li>
<li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+venous+bypass+graft+arteriosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis.</a> Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).</li>
<li>Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+suture+versus+cuff+anastomosis+in+mouse+cervical+cardiac+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant.</a> Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).</li>
<li>Niimi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%3A+experience+of+3000+operations+by+one+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon.</a> J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).</li>
<li>Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+intraperitoneal+injection+anesthesia+in+mice%3A+drugs%2C+dosages%2C+adverse+effects%2C+and+anesthesia+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth.</a> Comp Med. 51, 443-456 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeprowadziliśmy ponad 200 przeszczepów serca z powodzeniem przekraczającym 90% w różnych warunkach eksperymentalnych. Dzięki opisanej tutaj technice cały zabieg może zostać wykonany w ciągu 60 minut przez doświadczonego chirurga. Przygotowując naczynia szyjki macicy przed pobraniem narządów, całkowity czas niedokrwienia przeszczepu można ograniczyć do 20 minut. Czas do implantacji (czas ciepłego niedokrwienia) jest znacznie krótszy przy użyciu techniki mankietowej w porównaniu z techniką szwów16.
<p clas...

Model transplantacji serca jest często używany do badania uszkodzeń I/R, odrzucenia przeszczepu allogenicznego, waskulopatii po przeszczepie i skuteczności środków immunomodulujących. Modele mysie łączą w sobie wiele zalet, takich jak znane podłoże immunologiczne i genetyczne, dostępność wielu szczepów wsobnych i transgenicznych oraz stosunkowo niskie koszty eksperymentalne.
W 1973 roku technika przeszczepu serca w jamie brzusznej u myszy została po raz pierwszy opisana przez Corry'ego iwsp.1. W tym modelu przeszczepy są rewaskularyzowane przez zespolenia końca do boku aorty wstępującej do aorty brzusznej biorcy oraz głównej tętnicy płucnej do żyły głównej dolnej. W 1991 roku technika szwów do przeszczepu szyjki macicy u myszy została opisana przez Chen i wsp. 2. W tym modelu wsteczna perfuzja tętnicy wieńcowej jest ustalana przez zespolenie tętnicy szyjnej biorcy z aortą wstępującą przeszczepu. Krew żylna spływa przez zatokę wieńcową do prawego przedsionka, prawej komory i jest wyrzucana przez tętnicę płucną do żyły szyjnej zewnętrznej biorcy (ryc. 1). W porównaniu z implantacją przeszczepu jamy brzusznej, model szyjki macicy jest mniej inwazyjny, a powierzchowne umiejscowienie przeszczepu umożliwia bardzo łatwy dostęp do dodatkowych badań kontrolnych (np. badania palpacyjnego, echokardiografii, przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej)3,4.
Pomimo ulepszeń technicznych5,6, bardziej powszechne zastosowanie tego modelu zostało ograniczone z powodu trudności technicznych w wykonywaniu zszywanych zespoleń małych naczyń z częstym występowaniem nieszczelności zespolenia i zakrzepicy. W 1991 roku Matsuura i wsp. Wprowadzono technikę mankietową, w której ściana naczynia jest naciągana na syntetyczny cylinder, co znacznie ułatwia model przeszczepu szyjki macicy7. Technika ta została następnie zastosowana w różnych eksperymentalnych modelach przeszczepów, w tym nerkinr 8, trzustkinr 9, kończyny10, wątrobynr 11,12, płuc13,14 i przeszczepu naczyniowego15. W porównaniu z techniką szwów wymagany czas na zespolenie, a co za tym idzie, czas ciepłego niedokrwienia jest krótszy, a powikłań naczyniowych w przypadku techniki mankietowej jest znacznie mniej16. Co więcej, umożliwia chirurgom z niewielkim przeszkoleniem w zakresie mikrochirurgii wykonanie operacji z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Wadą techniki mankietowej jest wstępne podwiązanie tętnicy szyjnej wspólnej, co może zmienić perfuzję mózgu.
W tym artykule wideo prezentujemy ulepszoną i uproszczoną technikę zakładania mankietów do przeszczepu szyjki macicy u myszy.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze JFC-7.2</td><td>S& T</td><td>P-00036</td><td>Końcówka zakrzywiona 0,20 mm</td></tr><tr><td>Dylatator naczyń D-5a</td><td>S& T</td><td>S-00124</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Adventita</td><td>S& T</td><td>S-00102</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk naczyniowy B-1V</td><td>S& T</td><td>S-00396</td><td></td></tr><tr><td>Yasargil Clip</td><td>Peter Lazic</td><td>65,097</td> Kleszczyki bipolarne o <td>długości 3,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>Micromed</td><td>148-100-011</td><td>końcówka 0,25 mm</td></tr><tr><td>Rurki poliamidowe</td><td>River Tech Medical</td><td></td><td>19-24 gauge</td></tr><tr><td>8,0 ligatury jedwabne</td><td>Catgut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK roztwór</td><td>Essential Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy jest cennym narzędziem w badaniach nad transplantacją i układem sercowo-naczyniowym. Technika mankietu znacznie upraszcza ten model, unikając trudnych zespoleń szwów małych naczyń, skracając w ten sposób czas ciepłego niedokrwienia. W porównaniu z implantacją przeszczepu jamy brzusznej, model szyjki macicy jest mniej inwazyjny, a wszczepiony przeszczep jest łatwo dostępny do dalszych badań kontrolnych. Zespolenia wykonuje się poprzez przeciągnięcie aorty wstępującej przeszczepu nad mankietem z tętnicą szyjną wspólną biorcy oraz poprzez przeciągnięcie głównej tętnicy płucnej nad mankietem z żyłą szyjną zewnętrzną. Dobór odpowiedniego rozmiaru mankietu i pełna mobilizacja naczyń są ważne dla udanej rewaskularyzacji. Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (I/R) można zminimalizować poprzez perfuzję przeszczepu roztworem kardioplegicznym i hipotermię. W tym artykule przedstawiamy szczegóły techniczne dotyczące uproszczonej i ulepszonej techniki mankietu, która powinna umożliwić chirurgom z podstawowymi umiejętnościami mikrochirurgicznymi wykonanie zabiegu z wysokim wskaźnikiem sukcesu.

Nasz zespół zdołał z sukcesem opanować opisaną technikę po około 20 operacjach treningowych. Najtrudniejszym etapem jest wywinięcie ściany tętnicy szyjnej nad mankietem, ponieważ łatwo ona wraca do poprzedniej pozycji, a wielokrotne próby mogą doprowadzić do przerwania ściany. Po okresie treningowym średni całkowity czas operacji wynosił 60 ± 8 min. Około 20 min jest wymaganych na pobranie tkanek od dawcy, 25 min na przygotowanie naczyń szyjnych oraz 15 minut na wykonanie anastomoz i zamknięcie skóry.
<p class="jove_...

Technika mankietowa skraca i ułatwia model heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy, unikając technicznie trudnych zespoleń szwów w małych naczyniach. Szczegóły techniczne przedstawione w tym artykule wideo powinny pozwolić naukowcom na ustalenie tego modelu w swoich laboratoriach.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...

Niniejszy film przedstawia eksperymentalny model szyjnego przeszczepu serca w celu zbadania uszkodzenia reperfuzyjnego u myszy syngenicznych lub odrzucenia przeszczepu u zwierząt allogenicznych. Pierwszym krokiem procedury jest pobranie serca od myszy dawcy. Przeszczep przechowuje się w roztworze kardioplegicznym w lodzie do czterech godzin, w zależności od warunków eksperymentalnych.Kolejnym krokiem jest przygotowanie prawych naczyń szyjnych myszy biorcy; ścianę naczyniową przeciętej zewnętrznej żyły szyjnej oraz tętnicy szyjnej odchyla się nad mankietem i mocuje za pomocą podwiązką. Ostatnim etapem procedury jest implantacja przeszczepu do myszy biorcy. Aorta wstępująca przeszczepu jest przeciągana nad mankietem wraz z tętnicą szyjną, a pień płucny jest anastomozy z zewnętrzną żyłą szyjną.Na koniec klamry zostają usunięte i rozpoczyna się reperfuzja. Zazwyczaj w sercu w ciągu jednej minuty rozwija się rytm zatokowy. W porównaniu do implantacji przeszczepu w jamie brzusznej, transplantacja serca w obszarze szyjnym jest mniej inwazyjna, a zwierzęta szybciej wracają do zdrowia.Ponadto dzięki zastosowaniu kalsów do anastomozy można całkowicie uniknąć szycia małych naczyń, co czyni ten model bardziej wykonalnym technicznie. Po wstępnym uspokojeniu myszy przy użyciu izofluranu, zpodaj znieczulenie poprzez iniekcję domięśniową środków anestetycznych i potwierdź tolerancję chirurgiczną, sprawdzając odruch wycofywania łapy. Następnie unieruchom mysz w pozycji grzbietowej na polu operacyjnym.Następnie trzykrotnie zdezynfekuj skórę za pomocą chlorheksydyny. Teraz wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha i odsunij jelita w lewo za pomocą mokrej gazy, aby odsłonić dolną część żyły głównej dolnej. Następnie do żyły głównej dolnej wstrzyknij 50 jednostek heparyny rozcieńczonej w 0,4 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec koagulacji.Minutę później, wewnątrz naczynia, otwórz przeponę i wykonaj obustronną torakotomię w celu odsłonięcia serca; odchyl przednią ścianę klatki piersiowej ku górze i unieruchom ją za pomocą zacisku. Następnie usuń grasicę i tępym sposobem rozdziel tkankę łączną między aortą a pniem płucnym, nacinając prawą tętnicę szyjną wspólną. Następnie za pomocą igły 30 G nakłuj zmobilizowaną aortę zstępującą na wysokości pnia ramienno-głowowego i powoli wykonaj wsteczną perfuzję serca, stopniowo podając 3 ml lodowatego roztworu kardioplegicznego.Nie należy wywierać nadmiernego nacisku. Nie należy wstrzykiwać powietrza. Aby dodatkowo pogłębić zatrzymanie akcji serca, należy wkraplać lodowatą sól fizjologiczną na przeszczep.Następnie przetnij aortę proksymalnie w stosunku do odejścia pnia ramienno-głowowego i podwiąż żyłę główną dolną oraz obie żyły główne górne blisko serca. Po założeniu podwiązań, używając jedwabiu ATO, przetnij każde naczynie dystalnie względem podwiązań. Następnie uwolnij pień płucny tak dystalnie, jak to możliwe, i podwiąż tętnice płucne blisko ich rozwidlenia.Za pomocą jedwabnych nici ose przetnij również te naczynia dystalnie w stosunku do podwiązań. Ostatnimi naczyniami do podwiązania są żyły płucne, które można podwiązać wspólnie za pomocą jednej jedwabnej nici ose. Następnie przetnij te żyły i wyjmij serce z organizmu dawcy.Przechowywać serce w lodowatym roztworze kardioplegicznym do momentu rozpoczęcia procedury pod mikroskopem. Przygotować mankiety do anastomozy, przecinając rurkę poliamidową nożyczkami lub ostrzem skalpela nr 11. Po przygotowaniu biorcy do operacji w taki sam sposób jak dawcy, wykonać podskórny zastrzyk z 0,25 ml ciepłego roztworu soli fizjologicznej w celu uzupełnienia płynów.Następnie ogolić sierść w prawym regionie szyi i ułożyć mysz na plecach na ogrzewanej podkładce, przytwierdzając kończyny taśmą, dbając jednak o to, by nie nadmiernie rozciągać przednich kończyn, co mogłoby upośledzić oddychanie. Następnie nałożyć maść oftalmiczną i trzykrotnie zdezynfekować miejsce operacyjne, wykonując kilka przemyć chlorheksydyną. Teraz rozpocząć operację, wykonując poprzeczne nacięcie skóry od prawego kąta żuchwy do wcięcia jarzmowego.Następnie należy tępo uwolnić żyłę szyjną zewnętrzną, przypalić odgałęzienia boczne kleszczykami bipolarnymi, a następnie je przeciąć. Przeciąć żyłę szyjną zewnętrzną pomiędzy podwiązkami w miejscu zbiegu z żyłą z gruczołu podżuchwowego. Po wyizolowaniu należy przeciągnąć żyłę szyjną zewnętrzną przez mankiet.Następnie zamknij naczynie proksymalnie, zakładając zacisk naczyniowy na przedłużeniu mankietu. Teraz usuń podwiązkę i przemyj światło naczynia od 1 do 10 µL soli fizjologicznej z heparyną. Zakończ mocowanie do mankietu, wywijając ścianę naczynia na zewnątrz i stabilizując naczynie za pomocą wcześniej przygotowanej okrężnej podwiązki z jedwabiu.Następnie usuń powierzchowną część mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowatego. Kolejnym krokiem jest mobilizacja prawej tętnicy szyjnej wspólnej. Następnie, poniżej rozwidlenia tętnicy szyjnej, załóż dwie ligatury i przetnij naczynie pomiędzy nimi.Teraz przeciągnij tętnicę szyjną przez mankiet i załóż zacisk naczyniowy na odcinku proksymalnym względem mankietu. Aby zamknąć naczynie, usuń ligaturę i przemyj światło naczynia 1-10 µL soli fizjologicznej z heparyną. Następnie ostrożnie rozszerz światło za pomocą rozszerzacza naczyń.Następnie, podobnie jak wcześniej, należy dokończyć mocowanie naczynia do mankietu. Najtrudniejszą częścią procedury jest wywinięcie objętości naczynia tętnicy udowej nad mankiet, ponieważ łatwo ona wraca do pierwotnej pozycji. Dlatego ważne jest całkowite zmobilizowanie tętnicy w celu dobrania odpowiedniego rozmiaru mankietu oraz delikatne rozszerzenie światła naczynia przed wywinięciem.W ramach przygotowania do przeszczepu należy usunąć prawy płat gruczołu ślinowego podżuchwowego i utrzymywać pole operacyjne w stanie wilgotnym. Umieść przeszczep w szyjnym obszarze biorcy odwrócony górą do dołu, tak aby aorta była skierowana przyśrodkowo, a tętnica płucna bocznie. Następnie naciągnij aortę przeszczepu nad mankiet z tętnicą szyjną i zabezpiecz anastomozę okrężną ligaturą z jedwabiu 8-0.Następnie wykonaj nacięcie pień płucny od strony przedniej i naciągnij go na mankiet wraz z żyłą szyjną zewnętrzną. Użyj kolejnej ligatury, aby zabezpieczyć ten anastomoza. Teraz zdejmij zacisk z żyły szyjnej zewnętrznej, a następnie z tętnicy szyjnej; serce powinno szybko napełnić się krwią, aby usprawnić reperfuzję; polewaj graft ciepłą solą fizjologiczną.Zazwyczaj serce zacznie bić w rytmie zatokowym w ciągu minuty. Teraz należy usunąć przedłużenie mankietu w miejscu żylnym i sprawdzić przeszczep. Anastomoza musi być wolna od napięć, a naczynia nie powinny wykazywać żadnych skręceń.Nie należy koagulować naczyń skóry. Ponieważ może to upośledzić gojenie rany, krwawienie powinno ustąpić samoistnie; następnie należy zamknąć skórę pojedynczym szwem ciągłym. Po zabiegu należy wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie 0,25 mL ciepłej soli fizjologicznej.Następnie wstrzyknij podskórnie koktajl leków w celu zniesienia działania środków odurzających. Pozostaw zwierzę na ciepłej podkładce do czasu, aż będzie w stanie utrzymać pozycję grzbietną. Obserwuj zwierzę przez co najmniej godzinę przed uznaniem go za w pełni obbudzone.Po wyzdrowieniu mysz powinna być przetrzymywana pojedynczo przez co najmniej trzy dni. Należy podawać leki przeciwbólowe przez minimum 72 godziny. Należy również codziennie ważyć zwierzę, aby sprawdzić, czy nie występuje znaczny spadek masy ciała, oraz monitorować ogólny stan zdrowia zwierzęcia.Stosując opisany protokół, u syngenicznych myszy Black 6 wykonano przeszczepy do badania histopatologicznego. Przeszczepy barwiono hematoksyliną i eozyną oraz Sirius Red. Jako kontrolę wykorzystano sekcje zwierząt, którym nie wykonano przeszczepu.Przedłużone niedokrwienie. Reperfuzja doprowadziła do silnej reakcji zapalnej z obrzękiem tkanki. Przekrwienie, naciek leukocytów (oznaczone gwiazdkami) oraz zamknięcie mikronaczyniowe.Intensywne czerwone barwienie wykazało wyraźne odkładanie kolagenu w przestrzeniach śródmiąższowych, wskazane strzałkami. Takie odkładanie kolagenu nie wystąpiło w grupach kontrolnych. Ten model transplantacji stanowi interesujące narzędzie w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym oraz transplantologią.Szczególnie użyteczne jest zbadanie procesu niedokrwienia i reperfuzji mięśnia sercowego przed rozpoczęciem właściwych eksperymentów. Należy upewnić się, że technika ta jest wykonywana z powtarzalnymi wynikami operacyjnymi, ponieważ w przeciwnym razie może ona stanowić główne źródło błędu w anastomozy; w związku z tym czas ciepłego niedokrwienia powinien być ograniczony do mniej niż 20 minut.

heterotopic-cervical-heart-transplantation-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model heterotopowego przeszczepienia serca u myszy został uznany przez wielu badaczy za istotną metodę badania mechanizmów odrzutu i odpowiedzi immunologicznej. Jednak techniki z nią związane wciąż stanowią wyzwanie. Dzięki modyfikacji standardowych metod z sukcesem przeprowadziliśmy ponad 1000 przeszczepów.

Heterotopowe przeszczepienie serca u myszy

Model przeszczepu mysiego serca szyjnego doskonale nadaje się do badań immunologicznych i niedokrwiennych uszkodzeń reperfuzyjnych. Zmodyfikowaliśmy procedurę przy użyciu techniki mankietu bez szwów i przeprowadziliśmy ponad 1000 udanych przeszczepów przy użyciu tego podejścia. Niniejszym podajemy dodatkowe szczegóły tej techniki, aby uzupełnić film.

Mysi model przeszczepu szyjki macicy przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Technika jest demonstrowana dla procedury mikrochirurgicznej do heterotopowego przeszczepu serca u myszy, w tym uproszczone metody pobierania dawców i zespolenia naczyń biorców.

Zmodyfikowana metoda heterotopowego przeszczepu serca myszy

W manuskrypcie opisano kroki wymagane do przeprowadzenia heterotopowego przeszczepu serca u myszy.

Mysia heterotopowa technika przeszczepu serca

Tutaj opisujemy przedkliniczny model ortotopowego przeszczepu serca na dużych zwierzętach (świniach), który został mocno ugruntowany i wykorzystany do zbadania nowych strategii kardioprotekcyjnych.

Przedkliniczny model ortotopowego przeszczepiania serca od świń

Pokazano nowatorską technikę rekonstrukcji obwodu krwi w heterotopowym modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej.

Rekonstrukcja obwodu krwi w modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej

W obecnym protokole, model przeszczepu serca myszy jest używany do badania mechanizmu odrzucania przeszczepu alloprzeszczepu serca. W tym heterotopowym modelu przeszczepu serca poprawia się efektywność operacji, a przeżycie przeszczepów serca jest zapewnione dzięki zespoleniu implantacji serca w szyjce macicy od końca do końca przy użyciu zmodyfikowanej techniki Cuff.

Zmodyfikowana technika mankietowa dla heterotopowego modelu przeszczepu szyjki macicy serca u myszy

Modele transplantacji serca u myszy stanowią cenne narzędzia badawcze do badania immunologii transplantacyjnej. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje heterotopowy przeszczep serca szyjki macicy u myszy, który polega na umieszczeniu mankietów na wspólnej tętnicy szyjnej biorcy i pniu tętnicy płucnej dawcy, aby umożliwić laminarny przepływ krwi.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem mankietów naczyniowych

Protokół ten przedstawia bezmankietową, opartą na szwach heterotopową technikę przeszczepu serca szyjnego u myszy, zaprojektowaną tak, aby umożliwić niezawodne umieszczenie drugiego heterotopowego przeszczepu serca w celu oceny specyficznej dla dawcy tolerancji immunologicznej w warunkach fizjologicznych przy minimalnej interferencji ze strony obcego materiału.

Model szyjny bez mankietów oparty na przeszczepie szyjki macicy dla wtórnego heterotopowego przeszczepu serca w celu oceny specyficznej dla dawcy tolerancji immunologicznej u myszy

Ten protokół przedstawia uproszczoną technikę anastomozy szwu końcowo-bocznego do przeszczepu serca szyjnego u myszy, zapewniając solidny i możliwy do powtórzenia model do badania immunologii przeszczepów.

Przeszczepienie heterotopowe serca mysiego w okolicy szyjnej z zastosowaniem techniki anastomozy końca z boku w celu badania immunologii przeszczepów

Naucz się techniki heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem metody mankietowej. Ten model umożliwia badanie uszkodzeń niedokrwienno-reperfuzyjnych oraz mechanizmów odrzucania przeszczepu w biologii transplantacyjnej.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy

Przeglądaj więcej filmów