Name: Indukcja i ocena uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w sercach szczurów z perfuzją Langendorffa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj modelowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w izolowanym sercu szczura z wykorzystaniem aparatury Langendorffa. Ta metoda umożliwia badanie czynności mięśnia sercowego i molekularnych zdarzeń wczesnej reperfuzji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja była wspierana przez South Carolina Clinical & Translational Research (SCTR) Institute, z akademicką siedzibą na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny, NIH/NCATS Grant Number UL1 TR000062. Dalsze wsparcie zostało udzielone przez nagrodę VA merit award BX002327-01 dla DRM. DJH był wspierany przez NIH/NCATS Grant Number TL1 TR000061 oraz przez NIH Grant Number T32 GM008716. SEA była wspierana przez grant NIH o numerze T32 HL07260.

Wszystkie wymienione tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny. Opisane tu eksperymenty są ostrymi eksperymentami niemającymi na celu przeżycia. W związku z tym nie stosuje się maści do oczu i nie jest wymagany sterylny sala operacyjna. Eutanazja jest osiągana przez wykrwawienie podczas pobierania serca.
1. Przygotowanie do eksperymentu
<ol>
	<li>Ustaw aparat perfuzyjny Langendorffa o stałym ciśnieniu lub stałym przepływie4.</li>
	<li>Przygotować 4 l modyfikowanego buforu Krebs Henseleit (w mM: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2MgSO4, 1 K2HPO4, 1,25 CaCl2, 25 NaHCO3, 11 D-glukozy, 0,2 kwasu oktanowego, pH = 7,4).
	<ol>
		<li>Zrób 10 zapasowych.
		<ol>
			<li>Rozpuścić NaCl, KCl,MgSO4 iK2HPO4 w 3 l ultraczystej wody.</li>
			<li>Rozpuścić CaCl2 w 500 ml ultraczystej wody w 40 ml 1 N HCl.</li>
			<li>Powoli dodawać roztwór CaCl2 do buforu wykonanego w ppkt 1.2.1.1. Dodaj tyle ultraczystej wody, aby uzyskać łącznie 4 l. Pozostaw do mieszania na 1 godzinę przed przefiltrowaniem przez filtr 0,8 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Rozpuść NaHCO 3 w 4 litrach ultraczystej wody. Pozostawić na 1 godzinę do wymieszania przed przefiltrowaniem przez filtr 0,8 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Połączyć 400 ml 10x bufor Krebs Henseleit z 400 ml 10x bufor NaHCO3. Dodaj tyle ultraczystej wody, aby uzyskać łącznie 4 l. Rozpuść glukozę i kwas oktanowy, mieszając. Przefiltruj przez filtr 0,8 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj system na serce.
	<ol>
		<li>Dodać 2 l przefiltrowanego buforu do 4-litrowej butelki umieszczonej 38 cali powyżej zaworu odcinającego przymocowanego do kaniuli aortalnej. Spowoduje to dostarczenie ciśnienia perfuzji 70-80 mmHg do serca, co jest zalecanym ciśnieniem perfuzji4.</li>
		<li>Włóż bełkotkę dyspersyjną do buforu w butelce.</li>
		<li>Przepuść bufor przez system, upewniając się, że wyeliminowałeś wszelkie pęcherzyki z wnętrza rurki.</li>
		<li>Włączyć gaz (95% O2/5% CO2) co najmniej 30 minut przed umieszczeniem serca w systemie. Użyj sondy przepływu gazu i analizatora gazometrii krwi, aby sprawdzić nasycenie tlenem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj materiały chirurgiczne i balon.
	<ol>
		<li>Do pobrania serca przygotuj jedną parę nożyczek chirurgicznych 6,75 cala, jedną parę nożyczek 4,5 cala, dwie pary hemostatów, dwa zestawy kleszczyków karamaltowych, dwie strzykawki z igłami 27 G, 2 sztuki jedwabnego szwu 0-guage (około 15 cm długości), jedną kaniulę kolczastą 1/16 cala i jedną kaniulę tchawiczą.</li>
		<li>Aby zmontować kaniulę tchawicy, przyklej krótki kawałek plastikowej rurki o średnicy 1/16 cala do łącznika Y.</li>
		<li>Aby zmontować aparat balonowy: przymocuj igłę do kawałka rurki 1/16 cala, a następnie przymocuj rurkę do obudowy przetwornika ciśnienia. Mała strzykawka przymocowana po drugiej stronie obudowy przetwornika ciśnienia pozwoli na napompowanie i opróżnienie balonu.
		<ol>
			<li>Wytnij kwadrat folii i umieść końcówkę igły do wbijania w środku. Owiń folię wokół igły do zgłębnika.</li>
			<li>Napełnij balon solą fizjologiczną i zawiąż dwoma szwami. Napompuj balon, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Objętość soli fizjologicznej w nadmuchanym balonie powinna wynosić około 200 μl, ale może się różnić w zależności od wielkości szczura.</li>
			<li>Alternatywnie użyj lateksowej gondoli na palce zamiast folii. Umieść igłębkę w łóżeczku na palec, napełnij solą fizjologiczną i zwiąż.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zbierz serce
<ol>
	<li>Skrępować szczura Sprague Dawley za pomocą dekapikonu lub innego ręcznego urządzenia przytrzymującego. Zważ szczura.</li>
	<li>Mieszaninę ketaminy/ksylazyny (0,85 mg/kg ketaminy i 0,15 mg/kg ksylazyny) należy podać we wstrzyknięciu dootrzewnowym w celu znieczulenia szczura. Ta dawka środka znieczulającego zapewni wystarczające znieczulenie przez 20-40 minut, ale zabieg powinien zostać zakończony tak szybko, jak to możliwe po potwierdzeniu znieczulenia.</li>
	<li>Potwierdź prawidłowy stopień znieczulenia, badając odruch szczypania palca u nogi.</li>
	<li>Tracheotomii
	<ol>
		<li>Usuń futro od połowy przedniej łapy do podstawy szczęki, używając hemostatów do podniesienia futra i nożyczek, aby wykonać nacięcie. Trzymaj futro uniesione, aby oddzielić je od leżącego pod spodem mięśnia, umożliwiając przecięcie wzdłuż skóry i usunięcie jej.</li>
		<li>Za pomocą hemostatyków podnieś tkankę gruczołową i wykonaj poziome nacięcie w powięzi dolnej do tkanki gruczołowej. Użyj hemostatów, aby rozprowadzić nacięcie, uważając, aby nie naciąć żył szyjnych.</li>
		<li>Za pomocą hemostatów uszczypnij mięsień leżący nad tchawicą, a za pomocą nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie w mięśniu tuż poniżej czubka hemostatyków. Za pomocą hemostatów rozłóż tkankę, aby odsłonić tchawicę.</li>
		<li>Ostrożnie włóż hemostatyki pod tchawicę, oczyszczając powięź podczas postępu, delikatnie przesuwając i cofając hemostatyki.</li>
		<li>Po pomyślnym umieszczeniu hemostatyków za tchawicą, ściśnij jedwabny szew 0-0 hemostatami i wykonaj hemisekcję tchawicy małymi, ostrymi nożyczkami.</li>
		<li>Włóż kaniulę tchawicy do półwyciętej tchawicy, pociągnij szew za tchawicę i zawiąż szew wokół kaniulowanej tchawicy, zakotwiczając szew w pachwinie Y kaniuli za pomocą węzła chirurgicznego.</li>
		<li>Za pomocą igły 27 G wstrzyknąć 1000 j./kg heparyny do żyły szyjnej i pozostawić do krążenia na 30 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Torakotomia
	<ol>
		<li>Usuń futro od połowy brzucha do połowy przedniej łapy, szczypiąc hemostatami i tnąc nożyczkami.</li>
		<li>Wykonaj poprzeczne nacięcie o średnicy 3/4 cala w ścianie mięśnia brzucha, tuż pod przeponą.</li>
		<li>Wykonaj pionowe nacięcie w górę ściany brzucha i ściany klatki piersiowej, przecinając wzdłuż mostka.</li>
		<li>Przyciąć membranę do tyłu obustronnie, a następnie rozłóż klatkę piersiową, aby odsłonić serce, zaciśnij klatkę piersiową hemostatykami, aby upewnić się, że pozostaje rozłożona.</li>
		<li>Za pomocą hemostatów delikatnie usuń grasicę, odsłaniając aortę wstępującą.</li>
		<li>Drażnić hemostatyki przez pętlę aorty, przesuwając i cofając hemostatyki oraz delikatnie rozsuwając powięź, aby umożliwić przejście końcówki hemostatyków.</li>
		<li>Użyj hemostatów, aby przeciągnąć jedwabny szew 0-0 za wstępującą aortą, zawiąż szew w luźny półkwadratowy węzeł.</li>
		<li>Przekręć kurek, aby rozpocząć przepływ bufora perfuzyjnego, wykonaj hemisekcję aorty i natychmiast włóż kaniulę do światła aorty. Szybko zapnij węzeł półkwadratowy i zakończ węzeł, dokładnie zaciskając.</li>
		<li>Użyj nożyczek, aby wyciąć serce z dala od wielkich naczyń, usuń serce z klatki piersiowej i przymocuj do kolumny perfuzyjnej.</li>
		<li>Odciąć nadmiar tkanki płucnej i pozwolić sercu na równowagę na kolumnie przez około 15 minut przed włożeniem balonu. Stosować bufor o normalnym natężeniu przepływu przez serce 10-20 ml/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Perfuzja Langendorffa i uraz reperfuzyjny niedokrwienny
<ol>
	<li>Umieszczenie balonu ciśnieniowego nn
	<ol>
		<li>Opróżnij balon podczas zwijania w kształt stożka i przekręć kurek, aby upewnić się, że balon pozostaje opróżniony.</li>
		<li>Wytnij lewe przedsionek małą parą nożyczek, aby odsłonić dostęp do zastawki mitralnej.</li>
		<li>Włóż balon przez lewy przedsionek i zastawkę mitralną do lewej komory.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do monitorowania ciśnienia (LabChart Pro).</li>
		<li>Napompuj balon, otwierając kran i delikatnie zwiększając ilość soli fizjologicznej w balonie, aż odczyt ciśnienia rozkurczowego z mikromanometru przekroczy zero.</li>
		<li>Aby sprawdzić reakcję długości i napięcia, powoli napompuj balon do ciśnienia rozkurczowego 75 mmHg, powoli opróżnij, powtórz raz.</li>
		<li>Ustaw ciśnienie rozkurczowe na 10 mmHg, modulując ilość soli fizjologicznej w balonie. Przekręć kurek, aby uszczelnić balon na tym poziomie napompowania i utrzymuj zamknięty układ ciśnienia między balonem niskiego napięcia a przetwornikiem ciśnienia.</li>
		<li>Opuść serce do podgrzewanej komory i przykryj komorę plastikiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podawanie uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego
	<ol>
		<li>Zatkać dno podgrzewanej komory i pozwolić, aby komora wypełniła się wylanym buforem.</li>
		<li>Gdy bufor zanurzy serce, przekręć kurek, aby zatrzymać przepływ buforu do serca, wywołując globalne niedokrwienie. Czas niedokrwienia może się różnić w zależności od celów eksperymentu.</li>
		<li>Po 30 minutach niedokrwienia przekręć kurek, aby przywrócić przepływ buforu do serca, inicjując reperfuzję.</li>
		<li>Pozwól na reperfuzję serca przez 1 godzinę przed zakończeniem eksperymentu. Użyj różnych czasów reperfuzji, w zależności od celów eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończenie eksperymentu i pobranie tkanki
	<ol>
		<li>Za pomocą bocznego zaworu odcinającego podać 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w temperaturze 4 °C do serca z szybkością 10 ml/min w celu zatrzymania pracy serca.</li>
		<li>Usuń serce z kolumny perfuzyjnej, odetnij pozostałą tkankę przedsionkową.</li>
		<li>Umieść serce w matrycy do krojenia tkanek ze stali nierdzewnej, przykryj Parafilm i umieść w temperaturze -80 °C na 8 minut lub do momentu, gdy serce uzyska konsystencję podobną do prawoślazu.</li>
		<li>Wyjmij blok z zamrażarki i włóż żyletki do matrycy do krojenia, aby pokroić serce na plastry o średnicy 2 mm. Bloki tkanek można również kupić w plastrach o rozmiarach innych niż 2 mm.</li>
		<li>Usuwaj plasterki pojedynczo i wrzuć do ciekłego azotu, aby błyskawicznie zamrozić w celu przeprowadzenia badań biochemicznych. Zachowaj trzeci plaster komory od wierzchołka do barwienia zawału.</li>
		<li>Usunąć tkankę z ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykorzystania w eksperymentach biochemicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie zawału
	<ol>
		<li>Trzecią komorę inkubować w 10 ml 1% w/v chlorku trifenylotetrazolu (TTC) w temperaturze 37 °C przez 15 min. 
		Uwaga: Inkubację w TTC można przeprowadzać przez 15 lub 30 minut bez zmiany skuteczności15.</li>
		<li>Przenieś wycinek tkanki z TTC do 10% buforowanej formaliny i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez noc. Aby uzyskać optymalne wyniki, serca należy wyjąć z formaliny i zobrazować w ciągu 24 godzin4.</li>
		<li>Sfotografuj poplamiony plasterek i użyj oprogramowania, takiego jak ImageJ, aby oszacować rozmiar zawału zgodnie z protokołem producenta. Rób zdjęcia tak szybko, jak to możliwe po utrwaleniu, ponieważ barwnik z czasem wyblaknie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bainey, K. R., Armstrong, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+perspectives+on+reperfusion+injury+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction.</a> American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).</li>
<li>Beyersdorf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+controlled+reperfusion+strategies+in+cardiac+surgery+to+minimize+ischaemia%2Freperfusion+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage.</a> Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).</li>
<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchugen+am+%C3%BCberlebenden+S%C3%A4ugethierherzen%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archives%22%5BJournal%5D)">Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen.</a> Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+myocardial+protection+from+ischemic+arrest+by+intracoronary+tetrodotoxin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).</li>
<li>Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+with+ischemia%3A+A+delay+of+lethal+cell+injury+in+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.</a> Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).</li>
<li>Kolwicz, S. C., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiac+function+and+energetics+in+isolated+mouse+hearts+using+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy.</a> The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).</li>
<li>Fishbein, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phase+acute+myocardial+infarct+size+quantification%3A+Validation+of+the+triphenyl+tetrazolium+chloride+tissue+enzyme+staining+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique.</a> American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).</li>
<li>Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+class+I+but+not+class+IIb+histone+deacetylases+exerts+cardiac+protection+from+ischemia+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).</li>
<li>Yellon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+heat+stress+in+the+ischaemic+and+reperfused+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).</li>
<li>Khaliulin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+preconditioning+of+isolated+rat+hearts--a+potent+cardioprotective+mechanism+involving+a+reduction+in+oxidative+stress+and+inhibition+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temperature preconditioning of isolated rat hearts--a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).</li>
<li>Molojavyi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ketamine+and+its+isomers+on+ischemic+preconditioning+in+the+isolated+rat+heart%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart).</a> Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).</li>
<li>Asfour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+fluorescence+imaging+of+isolated+biventricular+working+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts.</a> The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+langendorff-perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts.</a> The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li>
<li>Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hour+reperfusion+is+enough+to+assess+function+and+infarct+size+with+TTC+staining+in+langendorff+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).</li>
<li>Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isolated+perfused+heart%3A+Characteristics+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).</li>
<li>Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA,, Peart, J. N., Headrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+coronary+function+in+the+langendorff-perfused+mouse+heart+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model.</a> Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).</li>
<li>Xie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+blunts+ischemia%2Freperfusion+injury+by+inducing+cardiomyocyte+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy.</a> Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wyizolowane perfundowane serce szczura może być z powodzeniem wykorzystane do badania wpływu interwencji farmakologicznej na wstępne kondycjonowanie serca w niedokrwiennym uszkodzeniu reperfuzyjnym9. Istnieją jednak pewne podstawowe etapy procedury, które muszą zostać ustandaryzowane, aby zapewnić powtarzalne wyniki. Utrzymanie temperatury w systemie na poziomie 37,4 °C ma kluczowe znaczenie, ponieważ nawet łagodna hipotermia i hipertermia mogą powodować kondycjonowanie serca10,11. Całkowity czas, j...

Wyjaśnienie zdarzeń leżących u podstaw reakcji serca zarówno na niedokrwienie, jak i reperfuzję jest niezbędne do poprawy leczenia zawału mięśnia sercowego1 i zabiegów kardiochirurgicznych, które wymagają zacisku krzyżowego aorty2. Podczas gdy modele in vivo uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego pozwalają na bardzo przydatną analizę punktów końcowych, nie są one tak skuteczne w badaniu funkcjonalnych skutków uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego w czasie rzeczywistym. Ponadto modele reperfuzji niedokrwiennej in vivo na ogół powodują znaczną zmienność wielkości zawału, a bezpośrednie dostarczanie leku do serca w czasie reperfuzji jest trudne. Wykorzystanie izolowanego układu serca Langendorffa do badania uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego pozwala na ocenę funkcjonalną leczenia farmakologicznego w czasie rzeczywistym, ujednolicenie obszaru tkanki zawału i natychmiastowe dostarczenie leku bezpośrednio do mięśnia sercowego.
Po raz pierwszy opisany przez Oscara Langendorffa w 1895 roku3, izolowane serce Langendorffa jest solidnym modelem do badania uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia, był używany w badaniach nad reperfuzją niedokrwienia przez ostatnie 40 lat4,5. W tym przypadku wprowadza się pewne modyfikacje w celu optymalizacji izolowanego serca do analizy funkcjonalnej. Kaniulacja in situ aorty podczas bicia serca zapewnia, że serce nie doświadcza wstępnego kondycjonowania niedokrwiennego, które zmieniłoby wyniki prób reperfuzji niedokrwiennej6. Aby to ułatwić, wykonuje się tracheotomię, która umożliwia wentylację i zapewnia stabilność fizjologiczną szczura podczas operacji. Serce jest następnie przymocowane do szklanej spiralnej kolumny z płaszczem wodnym, przez którą bufor Krebs Henseleit jest dostarczany przez perfuzję wsteczną bezpośrednio do aorty. Balon wypełniony solą fizjologiczną jest wprowadzany do lewej komory i podłączany do przetwornika ciśnienia, co pozwala na pomiar ciśnienia w czasie rzeczywistym z wnętrza komory i obliczanie wielu parametrów funkcjonalnych. Na zakończenie eksperymentu serce jest przepłukiwane zimną solą fizjologiczną w celu zatrzymania skurczu i błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie, aby umożliwić dalszą analizę poziomów DNA, RNA i białek. Tak zmodyfikowane perfuzja serca Langendorffa służy jako skuteczny system do bezpośredniego monitorowania fizjologicznego efektu interwencji farmakologicznych w dowolnym momencie ostrego uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sód Wodorowęglan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oktanowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu Medyczny</td> przetwornik ciśnienia <td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Masterflex</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Głowica pompy Masterflex Easy Load</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana kąpiel wodna obiegowa</td> Moduł przepływu rur Lauda <td>M3</td><td></td><td>Modułowa konsola</td></tr> badawcza <tr><td></td><td>Transonic TS410</td><td></td><td>Transonic</td></tr><tr><td></td><td></td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik przepływu Inline</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Urządzenie do akwizycji danych</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych LabChart</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja i ocena uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w sercach szczurów z perfuzją langendorffa

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Zdarzenia biochemiczne związane z uszkodzeniem reperfuzyjnym niedokrwiennym w ostrym otoczeniu mają ogromne znaczenie dla rozwoju nowych opcji leczenia zawału mięśnia sercowego i powikłań karochirurgicznych klatki piersiowej. Zdolność niektórych leków do wstępnego kondycjonowania mięśnia sercowego przed uszkodzeniem reperfuzyjnym spowodowanym niedokrwieniem doprowadziła do wielu badań klinicznych, z niewielkim sukcesem. Izolowany model serca umożliwia ostrą obserwację funkcjonalnych skutków uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego w czasie rzeczywistym, w tym skutków różnych interwencji farmakologicznych podawanych w dowolnym momencie przed lub w obrębie okna uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Ponieważ krótkie okresy niedokrwienia mogą przygotować serce przed uszkodzeniem niedokrwiennym, wykonuje się kaniulację aorty in situ, aby umożliwić funkcjonalną ocenę nieuwarunkowanego mięśnia sercowego. Balon wypełniony solą fizjologiczną umieszcza się w lewej komorze, aby umożliwić pomiar wytwarzania ciśnienia w czasie rzeczywistym. Uszkodzenie niedokrwienne jest symulowane przez zatrzymanie przepływu bufora perfuzyjnego, po którym następuje reperfuzja. Czas trwania zarówno niedokrwienia, jak i reperfuzji można modulować w celu zbadania zdarzeń biochemicznych w dowolnym punkcie czasowym. Chociaż izolowany model serca Langendorffa nie pozwala na uwzględnienie zdarzeń ogólnoustrojowych wpływających na niedokrwienie i reperfuzję, jest doskonałym modelem do badania ostrych zdarzeń czynnościowych i biochemicznych w oknie uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego, a także wpływu interwencji farmakologicznej na kondycjonowanie wstępne i końcowe serca. Celem tego protokołu jest pokazanie, jak wykonać kaniulację aorty in situ i wycięcie serca, a następnie uszkodzenie niedokrwienia/reperfuzji w modelu Langendorffa.

Aparat z balonem w lewej komorze umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym ciśnienia generowanego przez kurczącą się lewą komorę (Rysunek 1). Jak opisano wcześniej7, zapis tego ciśnienia może służyć do obliczenia wielu parametrów funkcji komory. Obliczenia te można przeprowadzić zarówno w fazie wyjściowej, jak i w fazie reperfuzji, wyciągając średnią z wielu zapisów w każdej grupie i porównując je w celu ustalenia, czy interwencja farmakologiczna doprowadziła do prekondycjonowania serca, c...

Izolowane serce szczura jest trwałym modelem uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. W tym miejscu opisujemy proces pobierania bijącego serca od szczura poprzez kaniulację aorty in situ, perfuzję Langendorffa serca, symulowane uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne i barwienie zawału, aby potwierdzić zakres urazu niedokrwiennego.

Indukcja i ocena uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w sercach szczurów z perfuzją Langendorffa

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie niedokrwienia oraz uszkodzenia reperfuzyjnego ex vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie szczura i otwarcie klatki piersiowej w celu kaniulacji aorty w odcinku C2, co zapobiega przedwarunkowaniu niedokrwiennemu mięśnia sercowego. Następnie serce zostaje usunięte i podłączone do aparatury perfuzyjnej Langendorfa.Ostatnim krokiem jest wywołanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego poprzez zatrzymanie przepływu buforu na określony czas, a następnie przywrócenie przepływu. Ostatecznie do wykazania wpływu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego na funkcję mięśnia sercowego wykorzystuje się pomiar generowanego ciśnienia komorowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie niedokrwienia i reperfuzji serca, takie jak to, jakie zdarzenia molekularne zachodzą podczas dynamicznych pierwszych kilku godzin uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego.W pierwszej kolejności, po potwierdzeniu znieczulenia szczura, należy obliczyć wymaganą dawkę środka anestetycznego. tracheotomie należy rozpocząć od nacięcia skóry od połowy przedniej części klatki piersiowej do podstawy żuchwy. Używając kleszczyków hemostatycznych, odsunąć brzegi rany, aby odsłonić strukturę mięśniową.Następnie za pomocą kleszczyków hemostatycznych unieś tkankę gruczołową i użyj nożyczek, aby wykonać dolne nacięcie powięzi. Rozchyl odsłoniętą tkankę drugą parą kleszczyków hemostatycznych. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić żyły szyjnej.Następnie za pomocą nożyczek i kleszczyków hemostatycznych wykonaj nacięcie poprzeczne w mięśniu pokrywającym tchawicę. Następnie użyj kleszczyków, aby odsłonić tchawicę, ostrożnie umieszczając je pod nią i usuwając przy tym powięź. Następnie za pomocą kleszczyków chwyć nici jedwabne 0,0 za tchawicą.Następnie za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie. Przeprowadź dyssekcję tchawicy. Wprowadź kaniulę tchawiczą i zamocuj ją szwem, nie wiążąc szwu bezpośrednio do rozwidlenia w kształcie litery Y kaniuli.Następnie za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 27 G wstrzyknij do żyły szyjnej 1000 jednostek heparyny na kilogram masy ciała. Odczekaj 30 s przed przystąpieniem do torakotomii. Rozpocznij torakotomię, usuwając skórę między środkiem brzucha a środkiem klatki piersiowej za pomocą kleszczyków hemostatycznych i nożyczek.Następnie wykonaj nacięcie ściany brzusznej o szerokości trzech czwartych cala tuż poniżej przepony. Kontynuuj nacięcie pionowo wzdłuż mostka. Następnie przetnij przeponę obustronnie, aby odsłonić klatkę piersiową.Następnie należy rozszerzyć klatkę piersiową i odsunąć żebra za pomocą kleszczyków hemostatycznych, odsłaniając serce. Kaniulacja aorty jest najkrytyczniejszym etapem procedury. Kaniulę należy wprowadzić precyzyjnie i szybko związać, aby zapobiec wystąpieniu krótkiego okresu niedokrwienia serca, co mogłoby zmienić wyniki późniejszej reperfuzji po niedokrwieniu.Przeprowadzenie eksperymentu z użyciem kleszczyków hemostatycznych. Ostrożnie usunąć grasicę, aby uzyskać dostęp do aorty wstępującej. Przesunąć kleszczyki hemostatyczne przez pętlę aortalną przez powięź.Następnie przeciągnij nić jedwabną 0 0 przez otwór i zawiąż luźny węzeł nadpalcowy. Teraz rozpocznij przepływ buforu perfuzyjnego przez kaniulę. W kolejnym etapie przeprowadź preparację aorty i niezwłocznie wprowadź kaniulę do światła aorty.Zabezpiecz kaniulę, zaciągając węzeł i wiążąc go na węzeł prosty. Za pomocą nożyczek oddziel serce od wielkich naczyń. Po uwolnieniu wyjmij je i podłącz do kolumny perfuzyjnej.Odciąć nadmiar tkanki płucnej. Po około 15 minutach serce zostanie wyrównane przy normalnym przepływie buforu wynoszącym od 10 do 20 ml/min. Gdy serce zostanie wyrównane z kolumną, można wprowadzić balon.W pierwszej kolejności wypuść powietrze z balonu, zwijając go w kształt stożka. Po opróżnieniu balonu zablokuj przepływ. Następnie uzyskaj dostęp do zastawki mitralnej poprzez wycięcie lewego przedsionka serca.Po trzecie, wprowadź balon przez zastawkę mitralną do lewej komory. Następnie rozpocznij monitorowanie ciśnienia skurczowego i rozkurczowego za pomocą oprogramowania LabChart Pro i pompuj balon, aż ciśnienie przekroczy zero. Następnie sprawdź odpowiedź długości na naprężenie.Powoli pompuj balon, aż ciśnienie osiągnie 75 mmHg. Następnie powoli go spuść i powtórz tę czynność. Obniż ciśnienie z powrotem do 10 mmHg, zmieniając ilość soli fizjologicznej w balonie.Następnie zablokuj balon przy tym ciśnieniu i utrzymuj zamknięty układ ciśnieniowy między balonem a przetwornikiem. Na koniec umieść serce w podgrzewanej komorze i szczelnie owiń je folią spożywczą. Komora powinna być zamknięta, aby wypełniła się buforem fuzyjnym.Po zanurzeniu serca należy zatrzymać przepływ buforu. Powoduje to wystąpienie globalnego niedokrwienia przez wymagany czas, który w tym przypadku wynosi 30 minut.Po 30 minutach przerwij niedokrwienie, przywracając przepływ buforu do serca i odblokowując komorę. Pozwól na reperfuzję przez wybrany czas, a następnie zakończ eksperyment, co w tym przypadku nastąpi po godzinie reperfuzji poprzez boczny otwór kurka odcinającego. Podaj 10 milliliters lodowatego PBS w ciągu jednej minuty.Doprowadzi to do zatrzymania akcji serca. Następnie należy wyjąć serce z kolumny i odciąć wszelkie pozostałości tkanki przedsionków. Osuszyć serce, przenieść je do matrycy do krojenia i pokryć perfilem.Zamrozić serce w temperaturze -80 °C przez osiem minut lub do momentu, aż uzyska konsystencję pianki marshmallow. Za pomocą żyletek podzielić serce na sekcje o grubości 2 mm lub, według preferencji, usuwać każdy plaster indywidualnie i zamrażać go w ciekłym azocie. Do badań biochemicznych zamrożone plastry należy następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.Do barwienia obszaru zawału należy pozostawić jeden plaster niezamrożony w ciekłym azocie. Zgodnie z opisanym protokołem, aparat z balonikiem w lewej komorze umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym ciśnienia generowanego przez kurczącą się lewą komorę.W zdrowym sercu ciśnienie rozkurczowe mieści się w zakresie od 70 do 130 mmHg. Po niedokrwieniu ciśnienie skurczowe ulega obniżeniu, a końcowe ciśnienie rozkurczowe wzrasta. W przypadku podania zwierzętom przed wycięciem organu środka prekondycjonującego, takiego jak inhibitor HDAC klasy I i IIB saha, ciśnienie wyjściowe może być zróżnicowane, a skutki uszkodzenia reperfuzyjnego ulegają złagodzeniu.Inne parametry funkcji lewej komory można również uzyskać bezpośrednio lub obliczyć na podstawie wyników z oprogramowania. Podczas badania uszkodzonego serca za pomocą TTC, które barwi tkankę metabolicznie aktywną na czerwono, okazało się, że serca poddane urazowi reperfuzyjnemu po niedokrwieniu wykazywały znacznie niższą aktywność metaboliczną, co wskazywało na obecność tkanki zawałowej po wykonaniu tej procedury. Do odpowiedzi na pytania takie jak: jakie są biochemiczne i genetyczne skutki niedokrwienia, urazu reperfuzyjnego oraz leczenia farmakologicznego w sercu, można wykorzystać techniki takie jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym, western blotting oraz spektrometria mas.

induction-assessment-ischemia-reperfusion-injury-langendorff-perfused

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Szczurzy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI) jest przydatny do badania skutków zawału dla patofizjologicznych i fizjologicznych funkcji serca.

Ostry zawał mięśnia sercowego u szczurów

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Rezerwa przepływu wieńcowego (CFR), jest zdefiniowana jako stosunek maksymalnego przepływu krwi wieńcowej do spoczynkowego przepływu krwi wieńcowej. Przedstawiamy protokół oceny CFR u szczurów za pomocą ultradźwięków, który daje możliwość przewidywania czynników ryzyka sercowo-naczyniowego przy braku obturacyjnej choroby wieńcowej.

Ocena rezerwy przepływu wieńcowego po reperfuzji niedokrwiennej mięśnia sercowego u szczurów

Tutaj opisujemy prostą i powtarzalną metodę, która może wywołać zawał mięśnia sercowego lub uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego u myszy poprzez precyzyjne podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej za pomocą mikromanipulacji.

Indukcja zawału mięśnia sercowego i uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego u myszy

Model niedokrwienno-reperfuzyjny serca szczura został ulepszony dzięki zastosowaniu samodzielnie wykonanego retraktora, rurki z polichlorku winylu i unikalnej metody wiązania. Wyniki elektrokardiogramu, chlorku trifenylotetrazolu i barwienia histologicznego oraz analizy procentowej przeżycia wykazały, że ulepszona grupa modelowa ma wyższe wskaźniki sukcesu i przeżycia niż już istniejąca grupa modelowa.

Ulepszony model niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u gryzoni

Obecne badanie demonstruje wysoce powtarzalny model zwierzęcy ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u królików przy użyciu mini-torakotomii lewej dla przypadków przeżycia lub sternotomii linii środkowej dla przypadków nieprzeżytych.

Model uszkodzenia niedokrwiennego i reperfuzyjnego u królików

Ten artykuł demonstruje możliwość osiągnięcia dłuższych czasów perfuzji (4 h) mysich przeszczepów serca bez utraty funkcji poprzez zastosowanie niższych (30-35 mmHg) niż fizjologicznych (60-80 mmHg) ciśnień perfuzji podczas Langendorffa.

Zmodyfikowana perfuzja Langendorffa w celu wydłużenia czasu perfuzji przeszczepów serca gryzoni

Ten protokół opisuje proces przygotowania do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną wspólną.

Zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Przedstawiono wydajny model ostrej niewydolności nerek związanej z okresem okołoperacyjnym i opieką krytyczną. Wykorzystując hipoperfuzję całego organizmu wywołaną zatrzymaniem krążenia, możliwe jest niemal całkowite odtworzenie zmian histologicznych i funkcjonalnych charakterystycznych dla klinicznego AKI.

Normotermiczne zatrzymanie krążenia i reanimacja krążeniowo-oddechowa: mysi model uszkodzenia reperfuzyjnego wynikającego z niedokrwienia

Poznaj modelowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w izolowanym sercu szczura z wykorzystaniem aparatury Langendorffa. Ta metoda umożliwia badanie czynności mięśnia sercowego i molekularnych zdarzeń wczesnej reperfuzji.

Indukcja i ocena uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w sercach szczurów z perfuzją Langendorffa

Przeglądaj więcej filmów