Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie uszkodzeń i naprawy DNA indukowanych w komórkach śledziony myszy przez przewlekłą ekspozycję in vivo na niskie dawki promieniowania beta lub gamma. Osiąga się to poprzez najpierw wystawienie myszy na wewnętrzne promieniowanie beta lub zewnętrzne promieniowanie gamma w celu wywołania potencjalnych zmian w uszkodzeniu i naprawie DNA. W drugim etapie cyty PLE są izolowane i napromieniowywane wysoką wymagającą dawką promieniowania gamma, która indukuje wykrywalne uszkodzenia DNA, aby umożliwić monitorowanie naprawy DNA.

Z biegiem czasu komórki śledziony są następnie znakowane fluorescencyjnie immunologicznie przeciwko gamma H, dwa, Ax, aby umożliwić ilościowe określenie uszkodzenia DNA. Ostatecznie uszkodzenia DNA spowodowane dawkami ostrego promieniowania gamma tak niskimi jak 10 stopni Celsjusza można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ochrony radioelektronicznej, takie jak to, czy niskie dawki promieniowania zwykle spotykane w środowisku zawodowym, medycznym lub publicznym faktycznie zwiększają prawdopodobieństwo szkodliwych skutków zdrowotnych, takich jak rak.

Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie ognisk gamma H, dwóch A X przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej, jest to, że nasza technika wymaga znacznie mniej czasu na analizę, dzięki czemu nadaje się do badań na dużej skali na zwierzętach, a także zmniejsza odchylenie związane z operatorem w kwantyfikacji gamma H i AX. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku personalizacji medycyny i radioterapii nowotworów oraz tego, że indywidualna wrażliwość radiowa pacjenta może być określana za pomocą limfocytów krwi obwodowej w celu dostosowania schematu dawkowania pacjenta w radioterapii. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w toksyczność promieniowania, może być również stosowana w innych badaniach, takich jak badanie toksyczności chemicznych zanieczyszczeń środowiska lub podstawowych mechanizmów powstawania i naprawy uszkodzeń DNA u myszy in vivo.

W przypadku wewnętrznego napromieniania beta należy traktować zwierzęta przez jeden miesiąc, korzystając z AD libitum dostępu do wody trytowej w celu zewnętrznego napromieniowania gamma. Umieść całą klatkę myszy w odpowiedniej odległości od źródła promieniowania gamma, aby dopasować dawkę ekspozycji na tryt. Rozpocznij i utrzymuj ekspozycję przez jeden miesiąc.

Użyj dozymetrów termoluminescencyjnych, aby zmierzyć całkowite dawki absorpcyjne pod koniec ekspozycji. W dniu pobrania śledziony umieść sitko do komórek w jednej małej pustej szalce Petriego na zwierzę i dodaj pięć mililitrów pożywki RPMI do każdej szalki. Następnie umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej na plecach i spryskaj sierść 70% etanolem, gdy zwierzę zostanie całkowicie przemoczone.

Użyj kleszczy, aby chwycić skórę przed otworem cewki moczowej i wykonaj małe nacięcie w okolicy krocza z tego nacięcia. Przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej do jamy klatki piersiowej, uważając, aby przeciąć tylko skórę, a nie ścianę mięśniową pod spodem. Odetnij skórę od linii środkowej.

Następnie chwytanie ściany brzucha kleszczami. Przeciąć wzdłuż środkowego dostępu mięśnia, aby otworzyć jamę brzuszną. Zlokalizuj śledzionę i lekko chwyć ją sterylnymi kleszczami.

Następnie delikatnie pociągnij za tkankę, jednocześnie usuwając tkankę łączną. Usuń około jednej dziesiątej śledziony do dalszych analiz. Następnie przenieś resztę tkanki do jednego z sitek komórkowych na okres do dwóch godzin po pobraniu wszystkich śledzion

Użyj sterylnych, zakrzywionych kleszczyków, aby zmielić każdą z tkanek w ich indywidualnych sitkach komórkowych. Gdy śledziony zostaną wystarczająco zhomogenizowane, usuń sitka i przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórkową do 15-mililitrowych probówek. Przepłucz każde z sitek dodatkowymi pięcioma mililitrami pożywki, ciągnąc popłuczyny z resztą zawiesin komórek i odwiruj komórki dwa razy Resus, zawieszając granulki w 10 mililitrach świeżego RPMI każdy po pierwszym wirowaniu.

Po drugim obrocie. Ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach RPMI i przenieść cztery mililitry powstałych zawiesin komórkowych do 25-mililitrowych kolb do hodowli tkankowych w celu inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla o wilgotności 80%. Przenieś pozostałą część zawiesiny komórek do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj komórki o temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Za pomocą pompy próżniowej ostrożnie zassać supernatanty i delikatnie zawiesić granulki w jednym mililitrze buforu TBS i ponownie odwirować komórki po ponownym odkurzeniu supinatu. Reese zawiesza granulki w 300 mikrolitrach TBS każdy. Następnie, wirując z małą prędkością, przy 700 mikrolitrach minus 20 stopni Celsjusza, 100% etanolu do każdej tuby.

Odwróć rurki kilka razy, aby dalej mieszać. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do 12 miesięcy. Wywołanie pęknięć podwójnej nici DNA w celu rzucenia wyzwania maszynerii naprawczej.

Hodowla naświetlacza z dwoma grami promieniowania gamma przy dawce równej lub mniejszej niż 200 mini gramów na minutę. Natychmiast po rzucie wyzwania należy umieścić hodowlę z powrotem w inkubatorze CO2. Godzinę później przenieś napromieniowaną hodowlę do komory bezpieczeństwa biologicznego i użyj pipety, aby delikatnie zawiesić komórki.

Przenieś jeden mililitr powstałej zawiesiny komórek do 1,5-mililitrowej probówki na lodzie, a następnie odwiruj komórki. Użyj pompy próżniowej, aby ostrożnie zassać supinat, a następnie delikatnie zawiesić granulki w jednym mililitrze TBS. Następnie, po drugim myciu TBS, utrwal komórki w etanolu, jak właśnie pokazano, do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu analizy immunofluorescencyjnej komórek.

Najpierw dodaj 0,5 mililitra lodowatego TBS do odpowiednich probówek z próbkami. Następnie wir podwielokrotny Eloqua, stały minus 20 stopni Celsjusza przechowywał cyty SPL przez pięć sekund. Następnie przenieś 0,5 mililitra komórek do odpowiednich probówek i delikatnie je odwiruj, ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze lodowatego TBS zawierającego 1% FBS i ogniwach odśrodkowych.

Ponownie, a następnie inkubować próbki w jednym mililitrze buforu TST na probówkę na lodzie przez 20 minut. Po odwirowaniu komórek, ponownie, ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach pierwszorzędowego przeciwciała anty gamma H two ax. Następnie umieść probówkę na obracającej się wytrząsarce pod kątem od 45 do 60 stopni na 1,5 godziny w temperaturze 300 razy G i temperaturze pokojowej pod koniec inkubacji.

Umyj próbki dwa razy w jednym mililitrze lodowatego TBS zawierającego 2% FBS. Następnie ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach świeżo przygotowanego przeciwciała wtórnego na platformie wytrząsającej. Po godzinie umyj komórki w jednym mililitrze lodu zwanym TBS zawierającym 1% FBS, a następnie przemyj w jednym mililitrze lodu zwanym samym TBS.

Na koniec ponownie zawieś granulki w 0,5 mililitra TBS zawierającego jodek PROPIDIUM Na tych wykresach pokazano reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej Komórki zostały najpierw bramkowane na podstawie ich elektronicznej strony objętościowej. Barwienie jodem propidynowym metodą rozproszenia potwierdziło, że zarówno próbki kontrolne, jak i prowokacyjne wykazywały normalny rozkład cyklu komórkowego. Podczas gdy pomiar sygnału gamma H two ax wykazał ponad dwukrotny wzrost pękania podwójnej nici DNA w dwóch szarych napromieniowanych komórkach w porównaniu z nieleczonymi kontrolami, względne poziomy gamma H dwa AX w cytach myszy, godzinę po ekspozycji ex vivo na niskie lub wysokie dawki promieniowania gamma są pokazane zgodnie z oczekiwaniami.

Po dwóch szarych prowokacjach wykryto silną trzykrotną indukcję podwójnych pęknięć nici. Niewielki, ale statystycznie istotny wzrost zaobserwowano po ekspozycji na 0,1 greja, co wskazuje na wystarczającą czułość metody. Oznaczony wzór fluorescencji przypominający ogniska obserwowany przez mikroskopię wskazuje, że sygnał pochodzi z pojedynczych pęknięć podwójnej nici DNA w chromatynie CH, potwierdzając specyficzność barwienia.

W tym miejscu pokazano poziom pęknięć podwójnej nici DNA wykazywany przez cyty PLE pobrane od myszy wystawionych na miesiąc trytytowanej wody. Chociaż leczenie spowodowało 10% wzrost podstawowego poziomu gamma H 2 A X, zmiana nie była statystycznie istotna. Ponadto brak różnic w zmierzonym powstawaniu i utracie gamma H dwie osi.

Po prowokacji reprezentującej kinetykę DNA, naprawę hamulców dwuniciowych zaobserwowano między komórkami myszy poddanych tritiacji wodzie i kontroli. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przestrzeganiu zasad i przepisów ustanowionych przez lokalne stowarzyszenie ochrony przed promieniowaniem oraz o skorzystaniu z certyfikowanego laboratorium lub obiektu, w którym można przeprowadzać projekty na dużą skalę przy użyciu zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych źródeł promieniowania. Po opanowaniu techniki te wymagają tylko około półtora dnia na 10 myszy, jeśli są wykonywane prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać analizy cytometrycznej przepływu ekspresji Gamma H dwa A X do pomiaru pęknięć i naprawy nici podwójnej DNA indukowanej in vivo przez ekspozycję na niskie dawki promieniowania trytu lub gamma. Oprócz tej procedury można wykonać inne metody, takie jak M FISH w limfocytach krwi, test mikrojądrowy szpiku kostnego i R-T-Q-P-C-R do pomiaru ekspresji genów odpowiedzi na stres w celu oceny zagrożeń dla zdrowia związanych z narażeniem na niskie dawki promieniowania.