Name: Otrzymywanie wysokoporowatych koordynacyjnych powłok polimerowych na makroporowatych monolitach polimerowych w celu zwiększonego wzbogacenia fosfopeptydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Dowiedz się, jak przygotować hybrydowy materiał polimerowy do selektywnej ekstrakcji fosfopeptydów. Metoda łączy makroporowaty monolit z warstwami polimeru koordynacyjnego, zwiększając wydajność wzbogacania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wykonana w Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory i wspierana przez Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych, Wydział Obiektów Naukowych Użytkowników Departamentu Energii USA, na podstawie Kontraktu Nr. DE-AC02–05CH11231. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe F.M. w postaci stypendium ME-Fulbright oraz A.S. przez Wyższą Komisję Szkolnictwa Wyższego Pakistanu.

UWAGA: Zanim zaczniesz, sprawdź wszystkie odpowiednie karty charakterystyki materiałów (MSDS). Kilka substancji chemicznych stosowanych w procedurach syntezy i aplikacji jest toksycznych. Prosimy o przestrzeganie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa i stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego (fartuch laboratoryjny, spodnie na całej długości, buty z zakrytymi palcami, okulary ochronne, rękawice). Podczas pracy z ciekłym azotem do pomiarów adsorpcji azotu należy używać wszystkich kriogenicznych środków ochrony osobistej (rękawice izolowane, osłona twarzy).
1. Preparat monolitu z porowatego polimeru w formacie zbiorczym i kapilarnym
<ol>
	<li>Monolit polimerowy luzem do charakterystyki
	<ol>
		<li>Oczyść styren, diwinylobenzen i kwas metakrylowy przez kolumnę zasadowego tlenku glinu w celu usunięcia inhibitorów polimeryzacji. Umieścić 10 g zasadowego tlenku glinu w jednorazowej plastikowej strzykawce o pojemności 25 ml z zatyczką z włókna szklanego zapakowaną w końcówkę strzykawki. Przesączyć około 10 ml monomeru przez kolumnę.</li>
		<li>Monomery (50 mg styrenu, 100 mg diwinylobenzenu i 50 mg kwasu metakrylowego) oraz środki tworzące pory (300 mg toluenu i 300 mg izooktanu) umieścić w szklanej fiolce o pojemności 1 ml. Dodać inicjator polimeryzacji, 4 mg 2,2'-azobisisobutyronitrylu (AIBN, 1% w stosunku do monomerów).</li>
		<li>Homogenizować przez sonikację przez 10 minut. Usunąć rozpuszczony tlen poprzez bulgotanie azotu przez ciecz przez 10 minut. Uszczelnić nakrętkę fiolki folią parafinową i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C na 6 godzin w celu polimeryzacji mieszaniny.</li>
		<li>Schłodzić do temperatury pokojowej i ostrożnie rozbić fiolkę. Przenieś monolit polimerowy do gilzy do ekstrakcji celulozy. Umieścić gilzę ekstrakcyjną w komorze ekstrakcyjnej Soxhleta i zmontować ją w kolbie okrągłodennej, która zawiera objętość metanolu, która jest co najmniej trzykrotnie większa od objętości komory ekstrakcyjnej. Zamontuj skraplacz w górnej części komory ekstrakcyjnej. Ekstrakcję Soxhleta należy przeprowadzić, gotując metanol przez 16 godzin, zapewniając całkowite usunięcie nieprzereagowanych monomerów i środków tworzących pory.</li>
		<li>Suszyć przez noc w piecu próżniowym w temperaturze 60 °C. Potwierdzić obecność karboksylowych grup funkcyjnych w celu przyłączenia PCP za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR). Zmierz powierzchnię za pomocą porozymetrii adsorpcji azotu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Funkcjonalizacja kapilar krzemionkowych do przygotowania kolumn monolitycznych
	<ol>
		<li>Wyciąć 2 m pokrytej poliimidem kapilary ze stopionej krzemionki o średnicy wewnętrznej 100 μm. Podłącz go do szklanej strzykawki o pojemności 0,25-0,50 ml i przemyj kapilar acetonem. Usuń aceton, spłukując kapilar wodą.</li>
		<li>W celu aktywacji wewnętrznej powłoki krzemionkowej kapilary, za pomocą pompy strzykawkowej przepływa 0,2 M wodny roztwór NaOH o stężeniu 0,25 μl/min przez 30 minut. Płukać wodą, aż ściek stanie się neutralny.</li>
		<li>Użyj papierowych pasków pH, aby sprawdzić pH ścieków. W celu protonowania grup silanolowych w kapilarze należy przepompować 0,2 M wodny roztwór HCl przez kapilarnę z prędkością 0,25 μl/min przez 30 minut. Spłucz wodą, aż ściek stanie się neutralny. Spłucz etanolem.</li>
		<li>Pompować 20% (w/w) roztwór etanolu 3-(trimetoksysililo)metakrylanu propylu (pH 5 dostosowany kwasem octowym) z prędkością 0,25 μl/min przez 1 godzinę. Na tym etapie kapilara krzemionkowa jest funkcjonalizowana grupami winylowymi w celu przyłączenia monolitu polimerowego do wewnętrznej powierzchni kapilary.</li>
		<li>Spłucz acetonem, wysusz w strumieniu azotu i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej przed użyciem. Pokrój kapilatę na krótsze kawałki o długości 20 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie monolitycznych kolumn kapilarnych
	<ol>
		<li>Przygotować identyczną mieszaninę polimeryzacyjną jak dla monolitu polimerowego luzem (sekcja 1.1) w szklanej fiolce o pojemności 1 ml z gumową przegrodą. Dodać inicjator 1% AIBN w odniesieniu do monomerów. Homogenizować przez sonikację przez 10 minut.</li>
		<li>Mieszaninę polimeryzacyjną należy przeczyścić azotem, sprzęgając niefunkcjonalizowaną kapilarnę krzemionkową ze strumieniem azotu.
		<ol>
			<li>Wprowadzić kapilarę strumienia azotu przez gumową przegrodę fiolki i zanurzyć ją w mieszaninie polimeryzacyjnej, tak aby azot pęcherzykował się w cieczy. Pozostawić nasadkę fiolki lekko luźną, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia. Oczyszczaj przez 10 minut.</li>
			<li>Podnieść kapilarę strumienia azotu z mieszaniny polimeryzacyjnej do przestrzeni nad fiolką i szczelnie zamknąć nakrętkę. Wprowadzić funkcjonalizowaną kapilarnę przez przegrodę do mieszaniny polimeryzacyjnej. Nadmiar ciśnienia wytwarzanego w kapilarze przez azot wstrzykiwany do przestrzeni nadbrzeżnej pompuje mieszaninę polimeryzacyjną przez funkcjonalizowaną kapilarę.</li>
			<li>Zbierz kilka kropli mieszaniny polimeryzacyjnej ze ścieków kapilary, aby upewnić się, że jest ona całkowicie wypełniona i zamknij ją gumową przegrodą. Bardzo ostrożnie wyjąć kapilarę z fiolki i zamknąć wlot naczynia włosowatego gumową przegrodą.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mieszaninę zawartą w kapilarze polimeryzować w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C przez 6 godzin. Schłodzić w temperaturze pokojowej i odciąć kilka milimetrów obu końców kapilary. Usunąć nieprzereagowane monomery i środki tworzące pory, przepłukując kolumnę acetonitrylem za pomocą pompy HPLC z prędkością 3 μl/min przez 30 min. Sprawdź przeciwciśnienie kolumny kapilarnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wzrost PCP żelaza-benzenotrykarboksylanu (FeBTC)
<ol>
	<li>Wzrost MOPH FeBTC na monolicie polimerowym luzem w celu scharakteryzowania
	<ol>
		<li>Zmiel wcześniej wysuszony monolit za pomocą moździerza i tłuczka.</li>
		<li>Zanurzyć 100 mg monolitu w 5 ml 2 mM FeCl3·6H2O w etanolu na 15 minut. Przefiltrować próżniowo za pomocą filtra nylonowego (0,22 μm) i przemyć proszek etanolem. Zanurzyć monolit w 5 ml 2 mM kwasu 1,3,5-benzenetrikarboksylowego (BTC) w etanolu na 15 minut. Przefiltrować próżniowo za pomocą filtra nylonowego (0,22 μm) i przepłukać proszek etanolem.</li>
		<li>W razie potrzeby powtórz krok numer 2. Wzrost końcowej powłoki metaloorganicznej zostanie określony przez liczbę nałożonych cykli. Zazwyczaj wykonuje się od 10 do 30 cykli. Potwierdzić obecność nowych porów za pomocą porozymetrii adsorpcyjnej azotu. Zmierz ilość dodatkowych miejsc metalowych za pomocą analizy termograwimetrycznej (TGA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzrost MOPH FeBTC na kapilarnej monolitycznej kolumnie do wzbogacania fosfopeptydów
	<ol>
		<li>Za pomocą pompy strzykawkowej. Przepłukać monolit kapilarny 2 mM FeCl3·6H2O w etanolu przez 15 minut przy 2 μl/min. Myć etanolem przez 15 min w stężeniu 2 μl/min. Przepłukać monolit kapilarny 2 mM BTC w etanolu przez 15 minut z prędkością 2 μl/min. Myć etanolem przez 15 min w stężeniu 2 μl/min.</li>
		<li>Powtórz krok 1 zgodnie z potrzebami. Wzrost końcowej powłoki metaloorganicznej będzie określony przez liczbę wykonanych cykli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trawienie białek i wzbogacanie fosfopeptydów
<ol>
	<li>Trawienie białek
	<ol>
		<li>0,5 ml odtłuszczonego mleka rozpuścić w 1 ml wody i podzielić na 200 μl frakcji.</li>
		<li>Do trawienia białek dodać 160 μl 1 M wodorowęglanu amonu i 50 μl 45 mM ditiotreitolu do każdej frakcji w celu rozszczepienia wiązań dwusiarczkowych. Inkubować w temperaturze 50 °C w termomikserze przez 15 minut.</li>
		<li>Dodawać stopniowo 50 μl wodnego roztworu jodoacetamidu 100 mM, podczas gdy roztwór schłodzi się do temperatury pokojowej. Jodoacetamid zapobiegnie tworzeniu się nowych wiązań dwusiarczkowych.</li>
		<li>Inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 1 ml wody dejonizowanej. Dodać 2 μg trypsyny i trawić białka w termomikserze w temperaturze 37 °C przez 14 godzin.</li>
		<li>Zakończyć trawienie przez zakwaszenie 10 μl 1% kwasu trifluorooctowego i umieszczenie go w termomikserze na 5 minut w temperaturze pokojowej. Strawione białka przechowywać w temperaturze –20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacanie fosfopeptydów za pomocą kapilarnej kolumny MOPH.
	<ol>
		<li>Przepłukać kolumnę 100 μl mieszaniny acetonitrylu w proporcji 4:1 zawierającej 0,1% kwasu trifluorooctowego przez 10 minut przy natężeniu przepływu 1 μl/min. Pompować wytrawianie białka przez kolumnę z prędkością 2 μl/min przez 30 min.</li>
		<li>Nieufosforylowane peptydy należy ponownie przepłukać mieszaniną acetonitrylu w stosunku 4:1 zawierającą 0,1% kwas trifluorooctowy przez 10 minut przy natężeniu przepływu 1 μl/min. Płukać wodą przez 10 minut przy natężeniu przepływu 1 μl/min.</li>
		<li>Eluować fosfopeptydy za pomocą roztworu buforowego fosforanu o pH 7 o pH 7 o stężeniu 250 mM pompowanym z prędkością 1 μl/min przez 15 minut. Zebrać eluent do fiolki i odsolić roztwór przy użyciu standardowego protokołu19. Przygotować kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy o stężeniu 2 mg/ml i użyć go jako matrycy do spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF-MS). Pobrać 2 μl kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego do końcówki w celu wymycia fosfopeptydów i namiejscowania ich bezpośrednio na płytce MALDI.</li>
		<li>Przeanalizować plamki za pomocą MALDI-TOF-MS i zregenerować kolumnę poprzez dokładne przepłukanie wodą, a następnie metanolem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, H., Eddaoudi, M., O’Keeffe, M., Yaghi, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+an+exceptionally+stable+and+highly+porous+metal-organic+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of an exceptionally stable and highly porous metal-organic framework.</a> Nature. 402, 276-279 (1999).</li>
<li>Kitagawa, S., Kitaura, R., Noro, S. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+porous+coordination+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Functional porous coordination polymers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 43, 2334-2375 (2004).</li>
<li>Furukawa, H., Cordova, K. E., O’Keeffe, M., Yaghi, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemistry+and+applications+of+metal-organic+frameworks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemistry and applications of metal-organic frameworks.</a> Science. 341, 974(2013).</li>
<li>Ma, S., Zhou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+storage+in+porous+metal-organic+frameworks+for+clean+energy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Gas storage in porous metal-organic frameworks for clean energy applications.</a> Chem. Commun. 46, 44-53 (2010).</li>
<li>Li, J. R., Sculley, J., Zhou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-organic+frameworks+for+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Metal-organic frameworks for separations.</a> Chem. Rev. 112, 869-932 (2012).</li>
<li>Lee, J., Farha, O. K., Roberts, J., Scheidt, K. A., Nguyen, S. T., Hupp, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-organic+framework+materials+as+catalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Metal-organic framework materials as catalysts.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1450-1459 (2009).</li>
<li>Gu, Z. Y., Yang, C. X., Chang, N., Yan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-organic+frameworks+for+analytical+chemistry%3A+From+sample+collection+to+chromatographic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Metal-organic frameworks for analytical chemistry: From sample collection to chromatographic separation.</a> Acc. Chem. Res. 45, 734-745 (2012).</li>
<li>Ahmad, R., Wong-Foy, A. G., Matzger, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+coordination+polymers+as+selective+sorbents+for+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microporous coordination polymers as selective sorbents for liquid chromatography.</a> Langmuir. 25, 11977-11979 (2009).</li>
<li>Yang, C. X., Yan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-organic+framework+MIL-101%28Cr%29+for+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+substituted+aromatics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal-organic framework MIL-101(Cr) for high-performance liquid chromatographic separation of substituted aromatics.</a> Anal. Chem. 83, 7144-7150 (2011).</li>
<li>Fu, Y. Y., Yang, C. X., Yan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+coordination+status+of+the+open+metal+sites+in+metal-organic+frameworks+for+high+performance+separation+of+polar+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Control of the coordination status of the open metal sites in metal-organic frameworks for high performance separation of polar compounds.</a> Langmuir. 28, 6802-6810 (2012).</li>
<li>Gu, Z. Y., Yan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-organic+framework+MIL-101+for+high-resolution+gas-chromatographic+separation+of+xylene+isomers+and+ethylbenzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metal-organic framework MIL-101 for high-resolution gas-chromatographic separation of xylene isomers and ethylbenzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 1477-1480 (2010).</li>
<li>Chang, N., Gu, Z. Y., Yan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeolitic+imidazolate+framework-8+nanocrystal+coated+capillary+for+molecular+sieving+of+branched+alkanes+from+linear+alkanes+along+with+high-resolution+chromatographic+separation+of+linear+alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Zeolitic imidazolate framework-8 nanocrystal coated capillary for molecular sieving of branched alkanes from linear alkanes along with high-resolution chromatographic separation of linear alkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13645-13647 (2010).</li>
<li>Yu, L. Q., Xiong, C. X., Yan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+temperature+fabrication+of+post-modified+zeolitic+imidazolate-90+as+stationary+phase+for+open-tubular+capillary+electrochromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Room temperature fabrication of post-modified zeolitic imidazolate-90 as stationary phase for open-tubular capillary electrochromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1343, 188-194 (2014).</li>
<li>Fu, Y. Y., Yang, C. X., Yan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+metal-organic+framework+UiO-66+into+porous+polymer+monoliths+to+enhance+the+liquid+chromatographic+separation+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Incorporation of metal-organic framework UiO-66 into porous polymer monoliths to enhance the liquid chromatographic separation of small molecules.</a> Chem. Commun. 49, 7162-7164 (2013).</li>
<li>Lin, C. L., Lirio, S., Chen, Y. T., Lin, C. H., Huang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+hybrid+metal-organic+framework-polymeric+monolith+for+solid-phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">A novel hybrid metal-organic framework-polymeric monolith for solid-phase extraction.</a> Chem. Eur. J. 20, 3317-3321 (2014).</li>
<li>Svec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+polymer+monoliths%3A+Amazingly+wide+variety+of+techniques+enabling+their+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Porous polymer monoliths: Amazingly wide variety of techniques enabling their preparation.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 902-924 (2010).</li>
<li>Monolithic HPLC Columns. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phenomenex.com/onyx">http://www.phenomenex.com/onyx</a> (2015).</li>
<li>Bia Separations. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.biaseparations.com/">http://www.biaseparations.com/</a> (2015).</li>
<li>Shekhah, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+route+for+the+synthesis+of+metal-organic+frameworks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Step-by-step route for the synthesis of metal-organic frameworks.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 15118-15119 (2007).</li>
<li>Shekhah, O., Fu, L., Belmabkhout, Y., Cairns, A. J., Giannelis, E. P., Eddaoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+implementation+of+the+stepwise+layer-by-layer+growth+of+MOF+thin+films+on+confined+surfaces%3A+mesoporous+silica+foam+as+a+first+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Successful implementation of the stepwise layer-by-layer growth of MOF thin films on confined surfaces: mesoporous silica foam as a first case study.</a> Chem. Commun. 48, 11434-11436 (2012).</li>
<li>Saeed, A., Maya, F., Xiao, D. J., Naham-ul-Haq, M., Svec, F., Britt, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+a+highly+porous+coordination+polymer+on+a+macroporous+polymer+monolith+support+for+enhanced+immobilized+metal+ion+affinity+chromatographic+enrichment+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Growth of a highly porous coordination polymer on a macroporous polymer monolith support for enhanced immobilized metal ion affinity chromatographic enrichment of phosphopeptides.</a> Adv. Funct. Mater. 24, 5797-5710 (2014).</li>
<li>Krenkova, J., Lacher, N. A., Svec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+selectivity+via+nanochemistry%3A+Monolithic+capillary+column+containing+hydroxyapatite+nanoparticles+for+separation+of+proteins+and+enrichment+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Control of selectivity via nanochemistry: Monolithic capillary column containing hydroxyapatite nanoparticles for separation of proteins and enrichment of phosphopeptides.</a> Anal. Chem. 82, 8335-8341 (2010).</li>
<li>Jabeen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-lanthanum+oxide%3A+Pioneer+composite+of+rare-earth+metal+oxide+in+selective+phosphopeptides+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Silica-lanthanum oxide: Pioneer composite of rare-earth metal oxide in selective phosphopeptides enrichment.</a> Anal. Chem. 84, 10180-10185 (2012).</li>
<li>Hussain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+diamond+nanopowder+for+phosphopeptides+enrichment+from+complex+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functionalized diamond nanopowder for phosphopeptides enrichment from complex biological fluids.</a> Anal. Chim. Acta. 775, 75-84 (2013).</li>
<li>Aprilita, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28glycidyl+methacrylate%2Fdivinylbenzene%29-IDA-FeIII+in+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteom.+Res%22%5BJournal%5D)">Poly(glycidyl methacrylate/divinylbenzene)-IDA-FeIII in phosphoproteomics.</a> J. Proteom. Res. 4, 2312-2319 (2005).</li>
<li>Lo, C. Y., Chen, W. Y., Chen, C. T., Chen, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enrichment+of+phosphopeptides+from+tryptic+digests+of+proteins+using+iron+oxide+nanocomposites+of+magnetic+particles+coated+with+zirconia+as+the+concentrating+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteom.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid enrichment of phosphopeptides from tryptic digests of proteins using iron oxide nanocomposites of magnetic particles coated with zirconia as the concentrating probes.</a> J. Proteom. Res. 6, 887-893 (2007).</li>
<li>Aryal, U. K., Ross, A. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+and+analysis+of+phosphopeptides+under+different+experimental+conditions+using+titanium+dioxide+affinity+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Enrichment and analysis of phosphopeptides under different experimental conditions using titanium dioxide affinity chromatography and mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 24, 219-231 (2010).</li>
<li>Select Iron Affinity Gel Technical Bulletin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/p9740bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/p9740bul.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oryginalny monolit polimerowy zawiera karboksylowe grupy funkcyjne zdolne do wiązania się z metalami. Koordynując początkowe miejsca metalu na oryginalnym materiale, jesteśmy w stanie wyhodować powłokę PCP (rysunek 1A), obejmującą szereg dodatkowych miejsc metalowych kształtujących mikroporowatą sieć. To sprawia, że prezentowane materiały MOPH są atrakcyjne do procedur ekstrakcji lub oczyszczania, w których zaangażowane są związki metaliczne, takich jak technika immobilizowanej chromatografii powinowactw...

Porowate polimery koordynacyjne (PCP) to związki koordynacyjne oparte na centrach metali połączonych organicznymi ligandami z powtarzającymi się jednostkami koordynacyjnymi rozciągającymi się w 1, 2 lub 3 wymiarach, które mogą być amorficzne lub krystaliczne1-3. W ostatnich latach ta klasa materiałów porowatych przyciągnęła powszechną uwagę ze względu na ich wysoką porowatość, szeroką zdolność przestrajania chemicznego i stabilność. PCP były badane pod kątem szeregu zastosowań, w tym magazynowania gazu, separacji gazów i katalizy3-6, a bardzo niedawno opisano pierwsze zastosowania analityczne PCP7.
Ze względu na ich zwiększoną funkcjonalność chemiczną i wysoką porowatość, PCP były celem ataków ze względu na ich ogromny potencjał do poprawy procesów oczyszczania i separacji chromatograficznej, a wiele raportów na ten temat zostało opublikowanych7-13. Jednak wydajność PCP nie jest obecnie na równoważnym poziomie z istniejącymi materiałami chromatograficznymi, prawdopodobnie ze względu na szybką dyfuzję przez duże puste przestrzenie międzycząsteczkowe w upakowanych złożach tych ciał stałych ze względu na ich typowo nieregularne kształty morfologii ich cząstek lub kryształów. To nieregularnie rozmieszczone uszczeliwie prowadzi do niższej niż oczekiwano wydajności, a także do wysokiego ciśnienia wstecznego kolumny i niepożądanej morfologii kształtu piku14,15.
Aby rozwiązać problem szybkiej dyfuzji przez puste przestrzenie między cząstkami i jednocześnie zwiększyć wydajność PCP do zastosowań analitycznych, pożądane byłoby opracowanie hybrydowego materiału opartego na makroporowatym monolicie polimerowym16, który zawiera PCP na powierzchni makroporów. Monolity polimerowe są samodzielnymi, jednoczęściowymi materiałami, które mogą utrzymywać przepływ konwekcyjny przez swoje pory, co czyni je jedną z najbardziej wydajnych alternatyw dla uszczelnień perełkowych i zostały z powodzeniem skomercjalizowane przez kilka firm17,18. Porowate monolity polimerowe są zwykle oparte na polimeryzacji monomeru i środka sieciującego w obecności porogenów, które są zazwyczaj dwuskładnikowymi mieszaninami rozpuszczalników organicznych. Otrzymane materiały monolityczne mają strukturę mikroglobularną oraz wysoką porowatość i przepuszczalność płynięcia.
Proste podejście do ujednolicenia tych materiałów w celu przygotowania monolitu polimerowego zawierającego PCP opiera się na bezpośrednim dodawaniu zsyntetyzowanych PCP do mieszaniny polimeryzacyjnej monolitu. Podejście to spowodowało, że PCP były w większości zakopane w rusztowaniu polimerowym i nie były aktywne dla dalszego stosowania materiału końcowego14,15. Z pewnością potrzebne jest inne podejście do syntezy, aby na przykład opracować jednolite warstwy PCP lub krystalicznych struktur metaloorganicznych (MOF), w których większość porów zawartych w krysztale jest dostępna z makroporów monolitu polimerowego.
Tutaj przedstawiamy prosty protokół przygotowania hybrydowego materiału metaloorganicznego polimeru (MOPH) opartego na makroporowatym nośniku polimerowym z odpowiednimi grupami funkcyjnymi do mocowania PCP, który można łatwo wdrożyć jako samodzielny jednoczęściowy monolit polimerowy w formacie kolumnowym o optymalnych właściwościach do zastosowań przepływowych. Po procedurze syntezy polimerów stosuje się prostą metodę opartą na roztworze w temperaturze pokojowej w celu wyhodowania powłoki PCP na wewnętrznej powierzchni porów monolitu19-20. Jako pierwszy przykład opisujemy przygotowanie koordynacyjnej warstwy polimerowej żelaza(III)benzenotrikarboksylanu (FeBTC) w makroporowatym monolicie z poli(styrenu-diwinylobenzenu-metakrylowego) monolitu. Metoda ta jest skuteczna w przypadku przygotowywania proszków luzem, a także kolumn kapilarnych, a opisany protokół można łatwo wdrożyć w innych PCP. Jako przykład potencjału MOPH jako materiałów funkcjonalnych do zastosowań przepływowych, zastosowaliśmy opracowany FeBTC MOPH, który zawiera gęstą powłokę centrów Fe(III) w celu wzbogacenia fosfopeptydów z trawionych mieszanin białkowych, wykorzystując powinowactwo wiązania fosfopeptydów do Fe(III). Opracowany protokół21 składa się z trzech głównych części: Przygotowanie podłoża z makroporowatego monolitu z polimeru organicznego; wzrost powłoki PCP na powierzchni porów monolitu; zastosowanie do wzbogacania fosfopeptydów.

<table><tbody><tr><td>Kapilary powlekane poliimidem</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>100 &mu; m i.d.</td></tr><tr><td>Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td></td></tr><tr><td>styren, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W323306</td><td>Klasa techniczna</td></tr><tr><td>Diwinylobenzen, 80%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>414565</td><td></td></tr><tr><td>Kwas metakrylowy, 98%</td><td>Mallinckrodt</td><td>MK150659</td><td></td></tr><tr><td>Toluen, &ge; 99,5%</td> <td>Chemikalia EMD</td><td>MTX0735-6</td><td></td></tr><tr><td>Izooktan, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650439</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-azobisisobutyronitryl, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441090</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek glinu (tlenek glinu zasadowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>sześciowodny chlorek żelaza (III), 97%</td><td>Kwas</td><td></td> 1,3,5-benzenotykarboksylowy 236489-Aldrich<td></td></tr><tr><td>, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>482749</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360457</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, &ge; 99,8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan sodu dwuwodny, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu dwuwodny, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy, &ge; 85%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438081</td><td></td></tr><tr><td>kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>Trzustka bydlęca</td></tr> <tr><td>i beta-kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td>Mleko bydlęce</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ZipTip</td> Żywica <td>Merck Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>C18</td></tr></tbody></table>

otrzymywanie wysokoporowatych koordynacyjnych powłok polimerowych na makroporowatych monolitach polimerowych w celu zwiększonego wzbogacenia fosfopeptydów

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Opisujemy protokół przygotowania materiałów hybrydowych opartych na wysoce porowatych koordynacyjnych powłokach polimerowych na wewnętrznej powierzchni makroporowatych monolitów polimerowych. Opracowane podejście opiera się na przygotowaniu makroporowatego polimeru zawierającego grupy funkcyjne kwasu karboksylowego, a następnie na kontrolowanym wzroście warstwy porowatego polimeru koordynacyjnego na powierzchni porów monolitu polimerowego w oparciu o roztwór, krok po kroku. Przygotowana hybryda polimeru metaloorganicznego ma wysoką powierzchnię właściwą mikroporów. Ilość miejsc żelaza(III) jest zwiększona poprzez koordynację metaloorganiczną na powierzchni porów funkcjonalnego nośnika polimerowego. Wzrost miejsc metalowych jest związany z liczbą iteracji procesu powlekania.
Opracowany schemat przygotowania można łatwo dostosować do formatu kolumny kapilarnej. Funkcjonalny porowaty polimer jest przygotowywany jako samodzielny, jednoblokowy, porowaty monolit w kapilarze, co daje przepływowe urządzenie separacyjne o doskonałej przepuszczalności przepływu i umiarkowanym przeciwciśnieniu. Hybrydowa kolumna metaloorganiczno-polimerowa wykazała się doskonałymi wynikami we wzbogacaniu fosfopeptydów z trawionych białek i ich późniejszym wykrywaniu za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą. Przedstawiony protokół eksperymentalny jest bardzo wszechstronny i można go łatwo wdrożyć do różnych organicznych nośników i powłok polimerowych z mnóstwem porowatych polimerów koordynacyjnych i struktur metaloorganicznych do wielu zastosowań związanych z oczyszczaniem i/lub separacją.

Schematyczny rysunek wzrostu PCP na powierzchni porów organicznego monolitu polimerowego przedstawiono na Rysunku 1. Na tym rysunku zilustrowano początkowe atomy Fe(III) zatrzymane na powierzchni porów pierwotnego monolitu polimerowego, skoordynowane z grupami funkcyjnymi karboksylowymi. Stosując opisany w niniejszym protokole sposób, na powierzchnię dodawane są dodatkowe ligandy organiczne i jony Fe(III), co prowadzi do uformowania porowatej sieci koordynacyjnej wewnątrz monolitu polimerowego. R...

Przedstawiono procedurę przygotowania porowatych hybrydowych mediów separacyjnych składających się z makroporowatego monolitu polimerowego wewnętrznie pokrytego mikroporowatym polimerem koordynacyjnym o dużej powierzchni.

Otrzymywanie wysokoporowatych koordynacyjnych powłok polimerowych na makroporowatych monolitach polimerowych w celu zwiększonego wzbogacenia fosfopeptydów

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przygotowanie nowego materiału nośnika o poprawionej wydajności w selektywnej ekstrakcji fosfopeptydów. Osiąga się to poprzez odpowiednie przygotowanie porowatego polimerowego monolitu kapilarnego z odpowiednimi grupami funkcyjnymi. W pierwszej kolejności na grupach funkcyjnych monolitu polimerowego unieruchamia się gatunek metalu, co nadaje nośnikowi selektywność w ekstrakcji fosfopeptydów.Następnie przeprowadza się stopniowy wzrost wielu warstw metal-organicznej sieci krystalicznej w celu zwiększenia liczby centrów metalicznych, co zwiększa selektywność względem fosfopeptydów. Wyniki wskazują na poprawę selektywności ekstrakcji fosfopeptydów z hydrolizatów białek, co potwierdzono za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą macierzą i analizą czasu przelotu. Wzbogacanie fosfopeptydów jest zazwyczaj przeprowadzane za pomocą chromatografii powinowactwa do jonów metali, którą wykonuje się z użyciem konwencjonalnych cząstek krzemionkowych lub cząstek polimerowych upakowanych w kolumnie chromatograficznej.Nasz materiał łączy zalety monolitu polimerowego makroporowatego, który charakteryzuje się dobrymi właściwościami transportu

preparation-highly-porous-coordination-polymer-coatings-on

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Wykorzystaliśmy chemiczne osadzanie z fazy gazowej wspomagane plazmą do osadzania cienkich warstw o grubości od kilku nm do kilkuset nm na nanocząsteczkach wykonanych z różnych materiałów. Następnie trawimy materiał rdzenia, aby wytworzyć puste w środku nanopowłoki, których przepuszczalność jest kontrolowana przez grubość powłoki. Charakteryzujemy przepuszczalność tych powłok dla małych substancji rozpuszczonych i wykazujemy, że bariery te mogą zapewniać przedłużone uwalnianie materiału rdzenia...

Charakterystyka enkapsulacji i przepuszczalności pustych cząstek polimeryzowanych w plazmie

Ten film demonstruje wzbogacanie fosforeptydów ekstrahowanych z tkanki guza prostaty za pomocą dwutlenku tytanu. Te wzbogacone fosfopeptydy mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak charakterystyka białek, w celu zrozumienia szlaków sygnalizacji komórkowej zaangażowanych w progresję raka prostaty.

Wzbogacanie fosfopeptydów na bazie dwutlenku tytanu: metoda selektywnej izolacji fosfopeptydów z biblioteki peptydów

Raportujemy protokoły "polimeryzacji" różnych typów nanocząsteczek metalowych w kapsułkach polimerowych w długie łańcuchy "homo-" i "kopolimerów".

Wykorzystanie nanocząstek metali pokrytych blokiem polistyrenu (kwas akrylowy) jako monomerów do ich homo- i kopolimeryzacji

W tym artykule opisujemy międzyfazową syntezę sprzężonych mikroporowatych polimerów (CMP) na podłożach protektorowych oraz rozpuszczanie substratu do przygotowania wolnostojących nanomembran CMP. Ponadto opiszemy, w jaki sposób kruche nanomembrany mogą być przenoszone na inne podłoża.

Synteza i transfer warstwa po warstwie wolnostojących mikroporowatych nanomembran polimerowych

Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Synteza amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) jest znaczącym wyzwaniem ze względu na obecność wielu azotów aminowych, co wymaga rozsądnego użycia grup ochronnych w celu zamaskowania tych reaktywnych funkcji. W tym artykule opisujemy łatwą metodę otrzymywania tych nowych klas cząsteczek samoorganizujących się.

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Ten protokół opisuje procedurę ekstrakcji i wzbogacania fosfopeptydów z linii komórkowych lub tkanek raka prostaty w celu analizy fosfoproteomu za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z bezznacznikową ilościową spektrometrią mas w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Przedstawiono protokół przygotowania szczepionych kulek krzemionkowych z poli(pentafluorofenylu akrylanu) (poli(PFPA)). Funkcjonalizowana powierzchnia poli(PFPA) jest następnie unieruchamiana przeciwciałami i z powodzeniem wykorzystywana do separacji białek poprzez immunoprecypitację.

Przygotowanie funkcjonalizowanych kulek SiO2 z poli(pentafluorofenylu) do oczyszczania białek

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

W niniejszym badaniu z powodzeniem wykorzystano cząstki metalo-organicznych sieci krystalicznych MIL-96(Al) do stabilizacji emulsji Pickeringa, które służą jako matryce do tworzenia mechanicznie wytrzymałych, hierarchicznie porowatych materiałów monolitycznych. Metoda ta umożliwia skalowalne formowanie MOF przy zachowaniu integralności kryształów. Dostosowanie składu mieszaniny jest kluczowe dla kontroli wielkości porów, ich wzajemnych połączeń, przepuszczalności oraz wytrzymałości.

Montaż porowatych materiałów monolitycznych z wykorzystaniem strategii emulsji Pickeringa stabilizowanej cząstkami metalo-organicznych szkieletów (MOF)

Dowiedz się, jak przygotować hybrydowy materiał polimerowy do selektywnej ekstrakcji fosfopeptydów. Metoda łączy makroporowaty monolit z warstwami polimeru koordynacyjnego, zwiększając wydajność wzbogacania.

Otrzymywanie wysokoporowatych koordynacyjnych powłok polimerowych na makroporowatych monolitach polimerowych w celu zwiększonego wzbogacenia fosfopeptydów (Wideo) | JoVE Journal

Otrzymywanie wysokoporowatych koordynacyjnych powłok polimerowych na makroporowatych monolitach polimerowych w celu zwiększonego wzbogacenia fosfopeptydów

Przeglądaj więcej filmów