Name: Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę izolacji neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych z krwi obwodowej. Technika ta minimalizuje niespecyficzną aktywację komórek i umożliwia ocenę cytotoksyczności bez użycia radioaktywnych znaczników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ZG jest wspierane przez granty z programu I-CORE Izraelskiej Fundacji Nauki (grant nr 41/11), Fundacji Abisch-Frenkel Foundation, Rosetrees Trust, Izraelskiej Fundacji Badań nad Rakiem (ICRF - Research Career Development Award) oraz fundacji CONCERN. ZGF jest wspierany przez granty Izraelskiej Fundacji Badań nad Rakiem (ICRF - Research Career Development Award), Głównego Naukowca Ministerstwa Zdrowia Izraela oraz Izraelskiego Towarzystwa Chorób Płuc.

<ol><li>Tangye, S. G., Brink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helping+hand+from+neutrophils+in+T+cell-independent+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses.</a> Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Pruijt, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).</li>
<li>Tecchio, C., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cytokines+involved+in+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis.</a> Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formylpeptide+receptors+mediate+rapid+neutrophil+mobilization+to+accelerate+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing.</a> PloS one. 9, e90613(2014).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).</li>
<li>Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multifaceted+Roles+Neutrophils+Play+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Microenviron. , (2014).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+change+of+cytokine-activated+neutrophils%3A+inflammatory+neutrophils+are+heterogeneous+and+enhance+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses.</a> J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).</li>
<li>Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+cell+surface+receptors+and+their+intracellular+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways.</a> Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).</li>
<li>Scapini, P., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+networking+of+human+neutrophils+within+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Social networking of human neutrophils within the immune system.</a> Blood. 124, 710-719 (2014).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+comparing+tumor-associated+neutrophils+with+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+and+normal+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils.</a> PloS one. 7, e31524(2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2%5BTitle%5D)+AND+%22TAN.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2.</a> TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).</li>
<li>Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">History of myeloid-derived suppressor cells.</a> Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15%2B%2FCD16low+human+granulocytes+from+terminal+cancer+patients%3A+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+that+have+suppressive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function.</a> Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).</li>
<li>Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppression+by+neutrophils+and+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).</li>
<li>Lopez-Lago, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemokines+secreted+by+tumor+cells+mount+a+lung+antimetastatic+response+during+renal+cell+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression.</a> Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).</li>
<li>Sagiv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Diversity+and+Plasticity+in+Circulating+Neutrophil+Subpopulations+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer.</a> Cell Reports. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Neutrofile są najliczniejsze ze wszystkich białych krwinek i są pierwszymi osobami reagującymi w przypadku infekcji i stanu zapalnego. W związku z tym są bardzo wrażliwe na sygnały zewnętrzne i można je łatwo aktywować. Ponadto neutrofile mają bardzo krótki okres półtrwania i szybki obrót. Łącznie cechy te stwarzają szereg trudności w pracy z neutrofilami, tak że wymagane są unikalne strategie eksperymentalne. Na przykład istnieje kilka strategii oczyszczania neutrofili, z których każda ma swoje zalety i wady.
<p cla...

Neutrofile początkowo były charakteryzowane jako wrodzone komórki odpornościowe, które służą jako pierwsza linia obrony przed atakującymi mikroorganizmami. Obecnie wiadomo, że neutrofile pełnią bardziej dalekosiężne funkcje, biorąc udział w narastaniu adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko obcym antygenom1,2, regulacji hematopoezy3, angiogenezie4i gojeniu się ran5. Ponadto neutrofile mogą wpływać na wzrost guza i progresję przerzutów ze względu na swoje działanie pro- i przeciwnowotworowe6,7. Neutrofile charakteryzują się polimorficznym segmentowanym jądrem (stąd nazywanym leukocytami wielojądrzastymi (PMN)) i zawierają co najmniej trzy odrębne podklasy granulek, a także pęcherzyki wydzielnicze8 (ryc. 1A-C).
Neutrofile mają wysoką zdolność fagocytarną i wysoką aktywność oksydazy NADPH, krytyczną dla eliminacji drobnoustrojów, a także wydzielają szeroki zakres chemokin ważnych dla przyciągania dodatkowych neutrofili i innych komórek odpornościowych do miejsca zapalenia8,9. Neutrofile charakteryzują się ekspresją dużej ilości receptorów powierzchniowych, w tym receptorów Toll-podobnych (TLR), receptorów lektyny typu C (CLR), receptora dopełniacza 3 (CD11b/CD18) i innych cząsteczek adhezyjnych (np. L-selektyny, LFA-1, VLA-4 i cząsteczki adhezyjnej komórek związanych z antygenem rakotwórczym 3 (CEACAM3/CD66b)), receptorów chemokiny (np. CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), receptorów chemoatraktantu (np. PAFR, LTB4R i C5aR), receptory cytokin (np. G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), receptory peptydowe formylu (np. FPR1-3) i receptory Fc (np. CD16 (FcγRIII), CD32 (FcγRII) i CD64 (FcγRI)10. U myszy neutrofile są zwykle identyfikowane jako CD11b + Ly6G +, podczas gdy neutrofile ludzkie są identyfikowane za pomocą markerów leukocytów CD11b, CD15, CD16 i CD66b. Ogólnie przyjmuje się również barwienie białek ziarnistych, mieloperoksydazy (MPO) i elastazy neutrofilowej (NE) w celu wykrycia neutrofili w tkankach.
Nadal nie jest jasne, czy różne funkcje neutrofili są pośredniczone przez tę samą komórkę, czy przez różne subpopulacje komórek. Coraz więcej danych wskazuje na obecność heterogenicznej populacji neutrofili, która wykazuje wysoki stopień plastyczności, na który wpływ mają bodźce prozapalne i mikrośrodowisko11,12. Fridlender i wsp.13 z grubsza podzieliło neutrofile w raku na dwie główne subpopulacje określane jako N1 o właściwościach przeciwnowotworowych i N2 o właściwościach pronowotworowych. W raku, a także w przewlekłym zapaleniu, istnieje dodatkowa subpopulacja złożona z granulocytarnych komórek supresorowych pochodzących z mieloidu (G-MDSC), które hamują odpowiedzi limfocytów T14. G-MDSC są uważane za niedojrzałe komórki szpikowe charakteryzujące się fenotypem CD11b + Ly6Co niskimpoziomie Ly6Ghi u myszy15, podczas gdy mająniski fenotyp CD15 + / CD16 u człowieka16. G-MDSC wyrażają wyższe poziomy arginazy i mieloperoksydazy, podczas gdy niższe poziomy cytokin i chemokin niż normalne krążące neutrofile. Są mniej fagocytarne i migrujące, ale wytwarzają wyższe poziomy ROS15,17,18. W niniejszej pracy przedstawimy podstawowe metodologie izolacji i charakterystyki neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych.
Podczas gdy neutrofile stanowią największą populację wszystkich białych krwinek w ludzkim krążeniu (45 - 70%; 1,800 - 6,000/μl), u myszy, w normalnych warunkach, są one raczej rzadkie (10 - 15%; 300 - 500/μl). Liczba granulocytów obojętnochłonnych wzrasta stopniowo po wystąpieniu stanu zapalnego, a czasami w przypadku raka, który reprezentuje stan przewlekłego stanu zapalnego7. Neutrofile rozwijają się z multipotencjalnych komórek prekursorowych szpiku (CMP) w szpiku kostnym w procesie różnicowania, przechodząc przez etapy mieloblastów (MB), promielocytów (PM), mielocytów (MC), metamielocytów (MM) i komórek pasmowych (BC)8. Dojrzałe, postmitotyczne neutrofile mogą pozostawać w szpiku kostnym przez 4 - 7 dni, zanim zostaną uwolnione do krążenia8. Obrót neutrofili we krwi jest zwykle szybki ze średnim okresem półtrwania wynoszącym 6 - 12 godzin, który może się wydłużyć w stanach zapalnych. Niestymulowane neutrofile mają ograniczoną aktywność przeciwnowotworową, cechę, którą można nabyć poprzez wystawienie naiwnych neutrofili na działanie chemokin IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 i CXCL56,19 lub sztucznie, poprzez wystawienie ich na działanie estru forbolu 12-mirystynianu 13-octanu (PMA)6.
Krótki okres półtrwania neutrofili we krwi wraz z niską liczbą neutrofili (~ 3 - 5 x 105) osiągniętą z 1 ml krwi naiwnej myszy w wieku 6 - 8 tygodni, utrudniły zbadanie funkcji krążących neutrofili myszy in vitro. Aby przezwyciężyć tę trudność, wykorzystano inne źródła. Na przykład dużą liczbę neutrofili można uzyskać ze szpiku kostnego20 lub otrzewnej po indukcji jałowego stanu zapalnego (np. po dootrzewnowym wstrzyknięciu bulionu tioglikolanowego lub Zymosanu A). Należy zauważyć, że neutrofile uzyskane z jamy otrzewnej nie wykazują żadnej aktywności przeciwnowotworowej (obserwacja niepublikowana).
Granot et al. 6 zaobserwowało, że myszy BALB / c zaszczepione ortotopowo mysią linią komórkową raka piersi 4T1 rozwijają neutrofilię, która pogarsza się wraz z progresją guza6 (Figura 2A), tak że 20 - 40 milionów neutrofili krwi można łatwo wyizolować z 1 ml krwi 3-4 tygodnie po inokulacji guza. Te neutrofile uzyskały działanie przeciwnowotworowe i w związku z tym zostały ukute jako neutrofile indukowane przez guz (TEN), w celu odróżnienia ich od naiwnych neutrofili6 (Figura 2B). Podczas gdy neutrofile o dużej gęstości (HDN, Figura 1A) są wysoce przeciwnowotworowe, neutrofile o niskiej gęstości (LDN, Figura 1B) generowane w kontekście raka nie są21. Również neutrofile o dużej gęstości ze szpiku kostnego i śledziony myszy z guzem mają działanie przeciwnowotworowe (dane niepublikowane). Należy zauważyć, że wraz z postępem guza śledziona ulega stopniowemu powiększeniu (splenomegalia), wraz ze wzrostem ilości neutrofili.
Należy zauważyć, że TEN jest również generowany w innych modelach raka, w tym zarówno spontanicznych (MMTV-PyMT i MMTV-Wnt1 guzy sutka oraz nowotwory płuc napędzane przez k-Ras), jak i wstrzykiwanych (komórki raka piersi AT-3 (MMTV-PyMT) i E0771, komórki raka płuc Lewisa LLC i komórki czerniaka B16-F10). Jednak zakres mobilizacji neutrofili w tych modelach nowotworowych jest znacznie mniejszy niż u myszy zaszczepionych 4T1, osiągając 5 - 10 x 106 neutrofili w 1 ml krwi po 3 tygodniach.

<table><tbody><tr><td>LINIE KOMÓRKOWE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysie komórki raka piersi 4T1</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>Pożywka wzrostowa: DMEM + 10% inaktywowane termicznie FBS</td></tr><tr><td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>płytka do hodowli tkankowej 100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>25 cm2</os> Kolba do hodowli tkankowych</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>90 mm naczynie do hodowli bakteryjnych&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Izrael</td><td>20090-01-017</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>15 ml sterylna stożkowa probówka wirówkowa&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Izrael</td><td>835015-40-111</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>sterylna stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 ml&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Izrael</td><td>835050-21-111</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>rurka polistyrenowa Falcon 12 x 75 mm z okrągłym dnem&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>płytka migracyjna Millicell 24 o wielkości porów 5&mu; m&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>biała 96-płaska płytka studzienna&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>sitko do komórek (40 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>igła 20G x 1,5" BD</td><td>Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>igła 23G x 1"&nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>igła 25G x 5/8"&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>strzykawka 0,3 ml z igłą 30G x 8mm</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>klipsy 9 mm&nbsp;</td><td>BD, AutoClip&nbsp;</td><td>427631</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>magnes EasySep&nbsp;</td>Kolumna separacyjna <td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>magnes separatora MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe&nbsp;</td><td>Menzel-Gl&auml; ser Superfrost&nbsp; Wytrząsarka</td> orbitalna Plus <td>Thermo J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sky line, czytnik płytek ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>POWDER Albumina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoksyurydyna (BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>CFSE (dioctan 5-(i 6-)-karboksyfluoresceiny, ester sukcynimidylu)</td><td>Sondy molekularne</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Wysoce toksyczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie</td></tr><tr><td>Tioglikolan w proszku&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>MEDIA I SUPLEMENTY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; Zmniejszyłem pożywkę w surowicy&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael</td><td>03-020-1A</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael</td><td>03-042-1B</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>penicylina Streptomycyna x 1000 roztwór</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael</td><td>03-031-5</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez Mg2+ i Ca2+&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael</td><td>02-023-1</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>PBS x 10 bez Ca2+ i Mg2+&nbsp;</td><td>Przemysł biologiczny, Beth HaEmek, Izrael</td><td>02-023-5A</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>woda klasy HPLC&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>Autoklaw</td></tr><tr><td>ROZWIĄZANIA ACK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ndash; Technologie życia chlorku amonu i potasu</td><td>&nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromodeoksyurydyny (BrdU) (10 mg/ml) w PBS</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 10 mg BrdU w 1 ml PBS i sterylnym filtrze.</td></tr><tr><td>CFSE, 5 mM w DMSO</td><td></td><td></td><td>Rozpuść 2,8 mg CFSE w 1 ml DMSO. Podzielić na 10 ml porcji w sterylnych probówkach o pojemności 200 ml i przechowywać w ciemności w temperaturze -20oC.</td></tr><tr><td>Roztwór eozyny Y</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael</td><td>02-016-1A</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>heparyna, 20 mg/ml w PBS</td><td></td><td></td><td>Rozpuść 100 mg heparyny w 5 ml sterylnego PBS i sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque-1119&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Bufor do lizy hodowli komórek lucyferazy x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:5 w sterylnej wodzie tuż przed użyciem.</td></tr><tr><td>Roztwór do oznaczania lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>Zawiera proszek substratu do oznaczania lucyferazy (E151A) i bufor do oznaczania lucyferazy (E152A)</td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny Mayera&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0,5% BSA</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 2,5 g BSA w 500 ml PBS i sterylnie przefiltrować przez filtr 0,2 mm.</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Rozpuść 1 g BSA w 100 ml PBS i przefiltruj sterylnie przez filtr 0,2 mm.</td></tr><tr><td>5x PBS z 2,5% BSA</td><td></td><td></td><td>Rozpuść 12,5 g BSA w mieszaninie 250 ml sterylnej wody klasy HPLC i 250 ml PBSx10, a następnie przefiltruj sterylnie przez filtr 0,2 mm.</td></tr><tr><td>PBS zawierający 0,5% BSA i 2 mM EDTA</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 250 mg BSA w 50 ml sterylnego PBS i dodać 200 ml 0,5M EDTA pH 8,0, sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Bufor FACS (PBS zawierający 0,5% BSA, 2 mM EDTA i 0,02% NaN3)</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 250 mg BSA w 50 ml sterylnego PBS i dodać 200 ml 0,5M EDTA pH 8,0 i 500 ml 2% NaN3, sterylny filtr przez filtr 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (0,9% NaCl)</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 9 g NaCl w 1,000 ml ddw, autoklaw</td></tr><tr><td>0,2% roztworu</td><td></td><td></td> NaCl <td>Rozpuść 2 g NaCl w 1,000 ml ddw, autoklaw</td></tr><tr><td>1,6% roztworze</td><td></td><td></td> NaCl <td>Rozpuść 16 g NaCl w 1,000 ml ddw, autoklaw</td></tr><tr><td>2 % Azydek</td><td></td><td></td><td>sodu Rozpuścić 1 g azydku sodu w 50 ml sterylnego DDW, przechowywać w temperaturze 4oC. Wysoce toksyczny.</td></tr><tr><td>3% roztwór</td><td></td><td></td> tioglikolanu<td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Rozpuścić 3 g proszku tioglikolanu w 100 ml ddw.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Gotować, aż roztwór stanie się żółty i autoklawować.</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w PBS, aby uzyskać 0,04% roztwór.</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny B&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael</td><td>03-046-1</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>1 mg / ml Zymosan A</td><td></td><td></td><td>Zawiesić 1 mg Zymosanu A w 1 ml sterylnego PBS w probówce Eppendorfa. Energicznie wirować i inkubować probówkę w temperaturze 37 oC przez 30 minut. Nie sterylizować w autoklawie. Przygotuj roztwór na świeżo przed użyciem.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>ZESTAWY</tr><tr><td>Zestaw selekcyjny EasySep PE</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl selekcyjny EasySep PE&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>nanocząstki magnetyczne EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Ly6G Zestaw MicroBead</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania neutrofili myszy EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania ludzkich neutrofili EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw przepływu FITC BrdU</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>559619</tr><tr><td>Zestaw do izolacji neutrofili MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania fagocytozy&nbsp;</td><td>Firma chemiczna Kajmanów&nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>PRZECIWCIAŁA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało blokujące FcR&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone szczurze przeciwciało anty-Ly6G&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551459</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>PE sprzężone ze szczurem przeciwciało anty-mysie Ly6G&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysi Ly6G</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551460</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 szczur anty-myszy Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>fioletowyFluor 450-sprzężony szczur anty-mysz Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>Klon 1A8</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysi CD11b sprzężony z FITC</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553310</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysi anty-6G i Ly-6C (GR-1) sprzężony z FITC</td> <td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553127</td><td>Clone RB6-8C5</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysi CD45</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553081</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Szczur anty-mysi sprzężony z FITC F4/80&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>Klon BM8</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka skojarzona z FITC CD66b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clone G10F5</td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało kontrolne izotypu szczura (IgG2a, k)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553927</td><td>Klon R35-95</td></tr><tr><td>LIŚĆ oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD3e chomika ormiańskiego</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Klon 145-2C11</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrofile, najliczniejsze ze wszystkich białych krwinek w ludzkim krążeniu, odgrywają ważną rolę w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami. Ponadto neutrofile odgrywają kluczową rolę w nadzorze immunologicznym komórek nowotworowych. Mają zdolność rozpoznawania komórek nowotworowych i indukowania śmierci komórek nowotworowych albo poprzez mechanizm zależny od kontaktu komórkowego z udziałem nadtlenku wodoru, albo poprzez cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). Neutrofile o działaniu przeciwnowotworowym można wyizolować z krwi obwodowej pacjentów z rakiem i myszy z nowotworem. Te neutrofile są nazywane neutrofilami indukowanymi przez nowotwór (TEN), aby odróżnić je od neutrofili zdrowych osób lub naiwnych myszy, które nie wykazują znaczącej aktywności cytotoksycznej guza. W porównaniu z innymi białymi krwinkami, neutrofile wykazują różną wyporność, co umożliwia uzyskanie > 98% czystej populacji neutrofili po poddaniu gradientowi gęstości. Jednak oprócz normalnej populacji neutrofili o dużej gęstości (HDN), u pacjentów z rakiem, u myszy z guzem, a także w przewlekłych stanach zapalnych, w krążeniu pojawiają się wyraźne populacje neutrofili o niskiej gęstości (LDN). LDN oczyszcza się jednocześnie z frakcją jednojądrzastą i może być oddzielany od komórek jednojądrzastych przy użyciu strategii selekcji dodatniej lub negatywnej. Po określeniu czystości wyizolowanych neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej można je wykorzystać do testów funkcjonalnych in vitro i in vivo. Opisujemy techniki monitorowania aktywności przeciwnowotworowej neutrofili, ich zdolności do migracji i wytwarzania reaktywnych form tlenu, a także monitorowania ich zdolności fagocytarnej ex vivo. Dalej opisujemy techniki znakowania neutrofili do śledzenia in vivo i określania ich zdolności przeciwprzerzutowej in vivo. Wszystkie te techniki są niezbędne do zrozumienia, jak uzyskać i scharakteryzować neutrofile o funkcji przeciwnowotworowej.

W niedawnym badaniu zidentyfikowaliśmy antymetastatyczną funkcję neutrofili6. Neutrofile z myszy z nowotworem nabywają fenotypu cytotoksycznego i wykazują zdolność do zabijania komórek nowotworowych6. Jest to przeciwieństwo neutrofili z myszy naiwnych, które nie wykazują istotnego efektu przeciwnowotworowego6. Kilka technik opisanych w sekcji protokołu zostało wykorzystanych do badania przeciwnowotworowej funkcji neutrofili in vitro oraz in vivo6.
<p class...

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie funkcji neutrofili w nowotworach. Jest to realizowane poprzez uprzednie pobranie krwi obwodowej. W drugim kroku neutrofile są oczyszczane na gradiencie gęstości, a następnie poddawane nocnej ko-kulturze.Przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych lucyferazą przeprowadza się ilościowe oznaczenie aktywności lucyferazy w tych komórkach. Ostatecznie ilość lucyferazy w każdej kokulturze może być w korelacji odwrotnej do cytotoksyczności neutrofili w danej kokulturze. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak separacja neutrofili oparta na przeciwciałach oraz inne metody oceny żywotności komórek, jest fakt, że procedura ta minimalizuje nieswoistą aktywację neutrofili i umożliwia pomiar żywotności komórek bez użycia znaczników radioaktywnych.Procedurę tę zademonstruje student studiów doktoranckich z mojego laboratorium oraz dr Simoni, pracownik podoktorski w moim laboratorium. Aby wyizolować neutrofile z myszy z nowotworem, należy rozpocząć od rozcieńczenia 1 mL krwi pobranej poprzez punkcję serca w PBS zawierającym 0,5% BSA do objętości końcowej 6 mL. Następnie do dna stożkowej polipropylenowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL należy dodać 3 mL sterylnie filtrowanej sacharozy o stężeniu 1,119 g/mL. Następnie należy powoli i ostrożnie przechylić probówkę.Na warstwę sacharozy o gęstości 1,119 g/ml nanieś warstwę 3 ml sterylnie filtrowanej sacharozy o gęstości 1,077 g/ml, a następnie 6 ml rozcieńczonej krwi. Rozdziel komórki w gradiencie sacharozy poprzez wirowanie przez 30 minut przy 700 G w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu procesu separacji większość erytrocytów znajdzie się na dnie probówki.Neutrofile o wysokiej gęstości będą znajdować się w okolicach trzeciego mililitra, w białym lub czerwonym pierścieniu na granicy warstw sacharozy. Natomiast leukocyty o niskiej gęstości będą znajdować się w białym pierścieniu na granicy warstwy 1,077 g/mL i PBS zawierającego BSA, w okolicach szóstego mililitra; należy aspirować warstwę PBS-BSA do poziomu 5 mm powyżej warstwy komórek o niskiej gęstości. Następnie, używając końcówki do pipety o pojemności 1 mL, należy usunąć komórki o niskiej gęstości poprzez powolne odsysanie przy jednoczesnym delikatnym wirowaniu zawiesiny komórkowej.Przenieś komórki do 30 ml PBS z 0,5% BSA. Następnie przenieś neutrofile o wysokiej gęstości do oddzielnej probówki zawierającej 30 ml PBS z BSA. W ten sam sposób odwirowuj oba zestawy komórek, a następnie resuspenduj osady w 36 ml sterylnej wody klasy HPLC.Po 30 sekundach przywróć izotoniczność komórek, dodając 9 ml 5x PBS uzupełnionego o 2,5% BSA, a następnie odwiruj komórki. Ponownie zawieś komórki w 10 ml PBS-BSA i określ liczbę żywych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu. Następnie, po kolejnym wirowaniu, zawieś neutrofile w medium inkubacyjnym, osiągając odpowiednią końcową gęstość komórek.W celu wyizolowania krążących neutrofili od pacjenta z nowotworem. Należy rozpocząć od zmieszania 10 mililitrów heparynowanej krwi ludzkiej z równą objętością 3% DExT strand T 500 w soli fizjologicznej i inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu sedymentacji erytrocytów. Po osiadaniu krwinek czerwonych, naddatek bogaty w leukocyty należy powoli nanieść na 10 mililitrów sacharozy o gęstości 1,077 gramów na mililitr, a następnie rozdzielić komórki poprzez wirowanie. Jak właśnie zaprezentowano, ludzkie neutrofile o wysokiej gęstości będą znajdować się w osadzie, natomiast neutrofile o niskiej gęstości zostaną oczyszczone wspólnie z monocytami i limfocytami na granicy faz między warstwą sacharozy 1,077 gramów na mililitr a osoczem.Po zebraniu neutrofili w sposób przedstawiony powyżej, rozcieńczyć komórki w 10 mililitrach 0,2% chlorku sodu przez 30 sekund, aby przeprowadzić lizę zanieczyszczających próbkę erytrocytów. Następnie dodać 10 mililitrów 1,6% chlorku sodu w celu przywrócenia izotoniczności środowiska i raz odwrócić probówkę, aby wymieszać zawartość. Odwirować komórki, a otrzymany osad przemyć trzykrotnie w 20 mililitrach HBSS.Następnie należy policzyć komórki i resuspender je w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 2% FBS przy odpowiedniej gęstości komórek. Aby wyizolować neutrofile wywołane przez thi glyco lub Xan, należy użyć strzykawki tuberkulinowej z jedną calową igłą o rozmiarze 23 G do iniekcji doprzewnowej.Wstrzyknij jeden mililitr odpowiedniego roztworu do jamy brzusznej myszy. Po upływie od 4 do 24 godzin wstrzyknij pięć mililitrów sterylnego PBS do otrzewnej ueutanazowanego zwierzęcia, używając strzykawki o pojemności pięciu mililitrów z igłą 25G o długości pięć ósmych cala. Delikatnie masuj otrzewną, a następnie odessać płyn z powrotem do strzykawki, aby zebrać komórki wysięku otrzewnowego.Przemyć komórki w medium RPMI 1640 uzupełnionym o 10% FBS. Następnie, aby usunąć makrofagi, inkubować 10⁶ komórek na ml w naczyniu hodowlanym klasy tkankowej zawierającym medium z dodatkiem FBS przez dwie godziny w temperaturze 37°C. Aby zabarwić wyizolowane neutrofile, resuspendować 1×10⁵ komórek w 50 µl aliquotach PBS i wirować zawiesiny komórkowe w adapterze do przygotowywania cienkich warstw komórkowych przy 150 ×g. Po pięciu minutach oddzielić wcześniej oznakowane szkiełka przedmiotowe od adaptera, a następnie utrwalić i zabarwić komórki.Następnie wypłucz preparaty 15 razy w wodzie z kranu. Pozostaw preparaty do ponownego wyschnięcia na powietrzu, a następnie obejrzyj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić aktywność przeciwnowotworową neutrofili. Rozcieńcz 5 × 10⁴ komórek nowotworowych znakowanych lucyferazą na ml w zoptymalizowanym medium z obniżoną zawartością surowicy, uzupełnionym o 0,5% FBS.Następnie w każdym dołku białej płytki hodowlanej o płaskim dnie z 96 dołkami wysiej 5 × 10³ komórek nowotworowych w 100 µL zoptymalizowanego pożywki z obniżoną zawartością surowicy zawierającej 0,5% FBS. Po czterech godzinach do każdego dołka dodaj 1 × 10⁵ neutrofili w 50 µL zoptymalizowanej pożywki z obniżoną zawartością surowicy zawierającej 0,5% FBS i inkubuj przez noc. Następnego ranka delikatnie odessij nadosad i przemyj każdy dołek 200 µL PBS.Następnie odessaj PBS i dodaj 50 µL buforu do lizy pasywnej do każdej studzienki. Następnie inkubuj płytkę przykrytą folią na wytrząsarce orbitalnej przy 150 RPM w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach umieść płytkę w czytniku płytek luminescencyjnych.Wstrzyknąć 50 µL roztworu do testu lucyferazy do każdej studni i odczytać chemiluminescencję przez 10 sekund na studnię. Na koniec użyć wzoru do obliczenia procentu lizy guza, aby zbadać zakres cytotoksyczności neutrofili w tym reprezentatywnym eksperymencie (1 × 10⁵). Neutrofile współhodowano z komórkami docelowymi 4T1 wykazującymi ekspresję lucyferazy, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, w współhodowlach z neutrofilami oczyszczonymi z myszy wolnych od nowotworu.Zaobserwowano bardzo niewielką śmiertelność komórek nowotworowych. Jednak neutrofile oczyszczone z myszy z nowotworem wykazały znaczący poziom cytotoksyczności w celu przetestowania właściwości immunosupresyjnych neutrofili o niskiej i wysokiej gęstości. Liczbę CD8-dodatnich limfocytów T śledziony po stymulacji przeciwciałem anty-CD3 lub anty-CD3 wraz z neutrofilami o niskiej lub wysokiej gęstości oceniono po aktywacji anty-CD3.Zaobserwowano gwałtowny wzrost liczby komórek CD8+. Jednakże współhodowla z neutrofilami o niskiej gęstości wywołała wyraźny spadek liczby komórek CD8+, efekt ten nie wystąpił w obecności neutrofili o wysokiej gęstości. Stopień retencji CFSE oceniono również jako wskaźnik proliferacji.Zauważcie przesunięcie słowa w lewo w komórkach traktowanych anty-CD3 oraz w komórkach traktowanych anty-CD3 hodowanych w obecności neutrofili o wysokiej gęstości, co w obu przypadkach wykazuje zwiększenie proliferacji komórek CD8-dodatnich. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak pomiar wyrzutu oksydacyjnego, fagocytozy lub migracji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. w jaki sposób funkcja neutrofili jest zmieniona w różnych scenariuszach patologicznych?

isolation-characterization-neutrophils-with-anti-tumor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

W tym filmie pokazujemy izolację cytotoksycznych neutrofili o wysokiej gęstości i neutrofili o niskiej gęstości z krwi myszy z nowotworem przez nieciągłe wirowanie w gradinie sacharozy.

Izolacja cytotoksycznych neutrofili z krwi myszy zawierającej nowotwór

Ten film demonstruje test do generowania antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem (TANs). Po pobraniu mysiego guza czerniaka zawierającego proangiogenne TAN, pojedyncze komórki są izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) i traktowane inhibitorem fosforybozylotransferazy nikotynamidu (NAMPT) w celu zmniejszenia zdolności do stymulowania angiogenezy.

Generowanie antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Nowe protokoły są tutaj opisane do izolowania i charakteryzowania mikrocząsteczek pochodzących z neutrofili ludzkich i mysich. Protokoły te wykorzystują techniki ultrawirowania, cytometrii przepływowej i immunoblottingu do analizy zawartości mikrocząstek i mogą być wykorzystywane do badania roli mikrocząstek pochodzących z różnych typów komórek w funkcjonowaniu komórek.

Izolacja i charakterystyka mikrocząstek pochodzących z neutrofili do badań funkcjonalnych

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Tutaj prezentujemy metodę, w której ludzkie neutrofile o niskiej gęstości (LDN), odzyskane z pooperacyjnego płynu z płukania otrzewnej, wytwarzają ogromne pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) i skutecznie zatrzymują wolne komórki nowotworowe, które następnie rosną.

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych

Tutaj pokazujemy potencjał terapeutyczny antyangiogennych neutrofili związanych z nowotworem po ich przeniesieniu do myszy z nowotworem. Protokół ten może być wykorzystany do manipulowania aktywnością neutrofili ex vivo, a następnie do oceny ich funkcjonalności in vivo w rozwijających się nowotworach. Jest to odpowiedni model do badania potencjalnych immunoterapii opartych na neutrofilach.

Transfer manipulowanych neutrofili związanych z nowotworem do myszy z guzem w celu zbadania ich potencjału angiogennego in vivo

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolacji neutrofili z krwi pełnej, kożuchów lub błon leukaferezy, osiągając dobrą wydajność, wysoką czystość i minimalną aktywację komórek. Wykorzystujemy oczyszczanie gradientowe, sedymentację czerwonych krwinek (RBC) i lizę RBC, aby uzyskać wysokiej jakości / czysty preparat neutrofili.

Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Tutaj oferujemy niezawodne podejście do izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej za pomocą izolacji magnetycznej (selekcja negatywna) i podłoża o nieciągłym gradinie gęstości. Zapewnia nietkniętą izolację komórek o wysokiej czystości (≥93%), ułatwiając dokładną analizę subpopulacji neutrofili, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w zdrowiu i chorobie.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Poznaj metodę izolacji neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych z krwi obwodowej. Technika ta minimalizuje niespecyficzną aktywację komórek i umożliwia ocenę cytotoksyczności bez użycia radioaktywnych znaczników.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Przeglądaj więcej filmów