Name: Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę tworzenia segmentalnego ubytku krytycznej wielkości w kości udowej myszy z wykorzystaniem osteosyntezy płytkowej. Ta technika umożliwia badanie procesów regeneracji kości i ocenę biomateriałów w modelu ortopedycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować Renie Bizios za jej cenne uwagi na temat rękopisu.

Oświadczenie etyczne: Myszy użyte w niniejszym badaniu były traktowane zgodnie z wytycznymi opublikowanymi przez Europejski Komitet ds. "Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych" (Dyrektywa 2010/63/UE i Europejska Konwencja ETS 123). Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komisję Etyki Wydziału Lekarskiego Lariboisière Saint-Louis (CEEA LV/2010-01-04).
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Użyj myszy atymmicznych (w wieku 10 tygodni). Użyj minimalnej liczby 6 myszy z wadą pozostawioną pustą jako negatywnej grupy kontrolnej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rusztowań
<ol>
	<li>Preparat do przeszczepu syngenicznego
	<ol>
		<li>Do wypełnienia ubytku należy użyć izoprzeszczepu kostnego, aby zapewnić grupie kontrolnej minimalną liczbę 6 zwierząt.</li>
		<li>Uzyskanie iprzeszczepów kostnych poprzez pobranie wyciętej kości udowej od myszy należącej do grupy "wad pozostawionych pustych" lub "ubytków wypełnionych rusztowaniem koralowym" (pozwala to uniknąć użycia dodatkowego zwierzęcia do pobrania izoprzeszczepu kości)11.</li>
		<li>Przepłucz wyciętą kość solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i utrzymuj ją w sterylności za pomocą wilgotnego kompresu z gazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie rusztowania koralowego
	<ol>
		<li>Użyj rusztowania wykonanego z naturalnego koralowca: Acropora sp. kostki egzoszkieletu koralowego, 3 x 3 x 3 mm jako potencjalny substytut kości z minimum 6 zwierzętami.</li>
		<li>Ręcznie wytnij każdy sześcian koralowy do kształtu walca (3,5 wysokości; 2 mm średnicy).</li>
		<li>Wysterylizuj każde rusztowanie w autoklawie (121 °C przez 20 min), umyj je sterylnym PBS i zanurz w kompletnej pożywce hodowlanej (α-MEM) na 24 godziny przed implantacją myszom.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zabiegi anestezjologiczne i analgezja
<ol>
	<li>Na 15 minut przed znieczuleniem należy zastosować zapobiegawcze działanie przeciwbólowe poprzez podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,1 mg/kg masy ciała zwierzęcia).</li>
	<li>Nakładaj maść na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu co 30 minut, gdy zwierzęta są pod narkozą.</li>
	<li>Umieść myszy na podkładce rozgrzewającej, aby zapobiec hipotermii.</li>
	<li>Znieczulenie i zniebóle podczas zabiegu chirurgicznego
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór zawierający ksylazynę (8 mg/kg) i ketaminę (100 mg/kg).</li>
		<li>Dostarczyć tlen przez przepływowy przepływ (50 ml/min).</li>
		<li>Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia przez obecność dobrego rozluźnienia mięśni i brak reakcji zwierzęcia na szkodliwy bodziec (np. mocne uszczypnięcie palca).</li>
		<li>Wstrzykiwać podskórnie pojedynczą dawkę enrofloksacyny (0,05 mg/kg) w ramach profilaktyki mikrobiologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analgezja pooperacyjna
	<ol>
		<li>Analgezję pooperacyjną należy stosować poprzez podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,1 mg/kg) co 12 godzin przez 3 kolejne dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie podczas zabiegów diagnostyki obrazowej
	<ol>
		<li>Umieść myszy w pudełku do znieczulania, a następnie wywołaj i utrzymuj znieczulenie za pomocą odpowiednio około 4% i 2% izofluranu w tlenie.</li>
		<li>Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez dobre rozluźnienie mięśni zwierzęcia i brak ruchu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki rekonwalescencji
	<ol>
		<li>Trzymaj myszy na podkładce rozgrzewającej do czasu pełnego wyzdrowienia</li>
		<li>Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka po operacji.</li>
		<li>Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki pooperacyjne
	<ol>
		<li>Trzymaj myszy osobno przez pierwsze 3 dni Hostuj myszy przez 4 w klatkach po 3 dniu.</li>
		<li>Zapewnij wodę i dostosowany pokarm ad libitum. Pozwól myszom utrzymać ciężar ciała, bez żadnych ograniczeń aktywności przez cały okres pooperacyjny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zabieg chirurgiczny: Model Segmentalnej Wady Kości Udowej11,12
<ol>
	<li>Po znieczuleniu umieść każdą mysz w pozycji leżącej brzusznej z lewą tylną kończyną w wyprostu.</li>
	<li>Wyszoruj kończynę do aseptycznej operacji przy użyciu 10% jodu powidonu przez 5 minut, a następnie umieść sterylną serwetkę pod kończyną, aby uzyskać sterylną powierzchnię (stosuje się sterylną przezroczystą zasłonę, aby móc monitorować ruchy oddechowe podczas zabiegu). Dba się o zachowanie sterylności pola operacyjnego podczas zabiegu.</li>
	<li>Wykonaj 15-17-milimetrowe podłużne nacięcie skóry nad przednio-boczną częścią kości udowej, rozciągające się od stawu biodrowego do stawu kolanowego.</li>
	<li>Naciąć powięź szeroka, rozciąć mięsień obszerny boczny i mięsień dwugłowy uda, aby odsłonić całą długość trzonu kości udowej. Należy zachować ostrożność w celu zachowania nerwu kulszowego doogonowo i torebki stawowej dystalnie (ryc. 1).</li>
	<li>Aby zwiększyć ekspozycję trzonu kości udowej, należy przeciąć mięsień pośladkowy i mięsień dwugłowy uda z 3. krętarza.</li>
	<li>Wykonaj okrężną sekcję kości udowej w środku trzonu.</li>
	<li>Nałożyć 6-otworową tytanową płytkę mikroblokującą (o długości 10 mm; szerokości 1,5 mm, waga: 30 mg) po przedniej stronie kości udowej. 
	UWAGA: Otwory płytki, które są stożkowo zagłębione częścią cylindryczną, mieszczą tytanowe samogwintujące blokujące (długość 2 mm, średnica zewnętrzna 0,47 mm, waga: 5 mg, z dolną powierzchnią z gwintowanym w celu umożliwienia zablokowania w otworze płyty), które są połączone z trzpieniem, który odkręca się po zablokowaniu.</li>
	<li>Wywierć najbardziej proksymalny otwór płyty za pomocą wiertła 0,3 mm i dedykowanej mocy silnika lub niededykowanej mocy silnika działającej z prędkością 2,500 obr./min przy około 500 mW12).</li>
	<li>Włóż pierwszą za pomocą dedykowanego śrubokręta, a następnie zablokuj ją (Rysunek 2). 
	UWAGA: Ponieważ wyrównanie płytki jest określane przez zastosowanie tej pierwszej, ważne jest, aby ustawić płytkę równolegle do kości udowej podczas wkładania.</li>
	<li>Wywierć najbardziej dystalny otwór płyty w podobny sposób, włóż i zablokuj (Rysunek 3).</li>
	<li>Włoż, ale nie blokuj, dwie pozostałe zewnętrzne.</li>
	<li>Umieść drut piły Gigli 0,22 mm ściśle wokół kości w orientacji przyśrodkowo-bocznej, a następnie włóż go w szczeliny przyrządu (Rysunek 4).</li>
	<li>Włóż dedykowany przyrząd na trzpień dwóch ostatnich i przyłóż go nad płytką (Rysunek 5).</li>
	<li>Wykonaj ostektomię kości udowej środkowej części trzonu o długości 3,5 mm za pomocą piły Gigli pod irygacją (przy użyciu sterylnej soli fizjologicznej), aby zapobiec martwicy termicznej. Poproś asystenta chirurga o wzięcie przyrządu. Niech chirurg stosuje stałe, stałe napięcie. Uważaj, aby nie splątać drutu piły i użyć środkowych dwóch trzecich drutu. Unikaj nadmiernego ruchu, aby uzyskać proste cięcie kości (ryc. 6).</li>
	<li>Po ostektomii usuń piłę Gigli. Aby uniknąć uszkodzenia tkanki miękkiej, przeciąć drut piły blisko kości z jednej strony.</li>
	<li>Zdejmij przyrząd i zablokuj dwie ostatnie (Rysunek 7).</li>
	<li>Pozostaw wadę segmentową pustą lub wypełnij ją chirurgicznie, umieszczając materiały do badania wewnątrz wady.</li>
	<li>Obficie spłukać pole operacyjne sterylnym izotonicznym roztworem soli fizjologicznej.</li>
	<li>Umieść mięsień obszerny boczny luźno na talerzu. Zamknij powięź i płaszczyzny podskórne za pomocą prostego ciągłego wzoru szwów i szwu 5.0 glycomer 631; Zamknij skórę za pomocą prostego przerywanego wzoru szwów za pomocą nici 4.0 Glycomer 631. Alternatywnie możliwe jest również zamknięcie skóry za pomocą kleju do skóry.</li>
</ol>
5. Oceny in vivo regeneracji kości
<ol>
	<li>Gdy myszy są pod narkozą, należy wykonać oceny radiologiczne w sposób podłużny, używając zarówno konwencjonalnych promieni rentgenowskich (26 kV, 10 sekund; 2-krotne powiększenie; rozdzielczość przestrzenna 20 linii/mm), jak i mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości (μCT).</li>
	<li>Do analizy μCT należy uzyskać obrazy w rozdzielczości 36 μm (50 kV i 478 mA, przy czasie naświetlania 40 ms, przy użyciu filtra aluminiowego 0,5 mm, krok obrotu 0,7º i obrót tomograficzny 180º). Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania rezydentnego.</li>
</ol>
6. Oceny ex vivo regeneracji kości
<ol>
	<li>Dziesięć tygodni po operacji wywołaj znieczulenie za pomocą izofluranu w tlenie, a następnie poświęć myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie nadmiaru barbituranu (1 ml pentobarbitalu).</li>
	<li>Wytnij kości udowe, usuń nakładającą się tkankę mięśniową i utrwal próbki kości w 4% paraformaldehydzie (pH 7,4) przez cztery dni.</li>
	<li>Usunąć płytkę i z każdej wyciętej próbki kości po utrwaleniu paraformaldehydu.</li>
	<li>Analiza TK ex vivo μ
	<ol>
		<li>Umieść każdą wyciętą i utrwaloną kość w probówkach polietylenowych wypełnionych 75% alkoholem i przeanalizuj ją za pomocą ex vivo μCT.</li>
		<li>Uzyskuj obrazy przy napięciu 80 kV i 100 μA (czas naświetlania 1 000 ms, aluminiowy filtr 0,5 i rozmiar piksela kamery 4 μm (2 400 x 4 000 przy rozmiarze woksela 7 μm), średnio cztery klatki na każdy krok obrotu 0,9º.</li>
		<li>Rekonstrukcja obrazów trójwymiarowych (średnia wielkość woksela 13 μm) przy użyciu projekcji wstecznej z filtrem Hamminga za pomocą oprogramowania rezydentnego.</li>
		<li>Do analizy ilościowej tworzenia kości należy użyć oprogramowania rezydentnego w celu uzyskania objętości zmineralizowanej tkanki (dolny próg szarości 45 wskaźników skali szarości i górny próg szarości 240 wskaźników skali szarości) w określonym i spójnym obszarze zainteresowania odpowiadającym wadze.</li>
		<li>Wykonuj analizy w ten sam sposób dla każdej myszy z tym samym regionem zainteresowania.</li>
		<li>Użyj testu analizy jednoczynnikowej (przedział ufności - na poziomie 95% i istotny poziom na poziomie p < 0,05), aby porównać wskaźnik zrostu kostnego i objętość zmineralizowanej tkanki w obszarze zainteresowania między grupami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza histologiczna
	<ol>
		<li>Zanurz każdą wyciętą i utrwaloną kość udową w żywicy metakrylanu metylu i przetwórz ją w celu uzyskania nieodwapnionej histologii.</li>
		<li>Pociąć każdą próbkę kości wzdłuż na gruby przekrój (200 μm) za pomocą okrągłej piły diamentowej chłodzonej wodą.</li>
		<li>Zmielić każdy fragment próbki kości do grubości 100 μm, wypolerować go i wybarwić za pomocą niebieskich barwników Stevenel i van Gieson picrofuchsin. 
		UWAGA: Po barwieniu komórki pojawiają się na niebiesko, kość na różowo, a koral na brązowo pod mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Auer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+animal+models+in+fracture+research%3A+seeking+consensus+in+optimising+both+animal+welfare+and+scientific+validity+for+appropriate+biomedical+use%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskelet+Disord%22%5BJournal%5D)">Refining animal models in fracture research: seeking consensus in optimising both animal welfare and scientific validity for appropriate biomedical use.</a> BMC Musculoskelet Disord. 8 (72), (2007).</li>
<li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+bone+healing+models%3A+standards%2C+tips%2C+and+pitfalls+results+of+a+consensus+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting.</a> Bone. 49 (4), 591-599 (2011).</li>
<li>Horner, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+bone+defect+models+for+tissue+engineering+applications%3A+criteria+for+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).</li>
<li>Srouji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+tissue+engineering+applications%3A+femoral+critical+size+defect+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">A model for tissue engineering applications: femoral critical size defect in immunodeficient mice.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17 (5), 597-606 (2011).</li>
<li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).</li>
<li>Harris, J. S., Bemenderfer, T. B., Wessel, A. R., Kacena, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+mouse+critical+size+defect+models+in+weight+bearing+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A review of mouse critical size defect models in weight bearing bones.</a> Bone. 55 (1), 241-247 (2013).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LockingMouseNail--a+new+implant+for+standardized+stable+osteosynthesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice.</a> J. Surg. Res. 169 (2), 220-226 (2011).</li>
<li>Garcia, P., Histing, T., Holstein, J. H., Pohlemann, T., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femoral+non-union+models+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Femoral non-union models in the mouse.</a> Injury. 41 (10), 1093-1094 (2010).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+reliable+non-union+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a reliable non-union model in mice.</a> J. Surg. Res. 147 (1), 84-91 (2008).</li>
<li>Viateau, V., Logeart-Avramoglou, D., Guillemin, G., Petite, H. Animal Models for bone tisue enginering purposes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aViateau%2C+V+%22Sourcebook+of+models+for+biomedical+research%22">Sourcebook of models for biomedical research</a>. Conn, P. M. , Humana Press. 725-738 (2008).</li>
<li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+murine+femoral+segmental+critical-sized+defect+model+stabilized+by+plate+osteosynthesis+for+bone+tissue+engineering+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).</li>
<li>Matthys, R., Perren, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+fixator+for+use+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Internal fixator for use in the mouse.</a> Injury. 40 Suppl 4, S103-S109 (2009).</li>
<li>Becquart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+is+the+prime+but+not+the+only+cause+of+human+multipotent+stromal+cell+death+in+tissue-engineered+constructs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Ischemia is the prime but not the only cause of human multipotent stromal cell death in tissue-engineered constructs in vivo.</a> Tissue Eng. Part A. 18 (19-20), 2084-2094 (2012).</li>
<li>Deschepper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proangiogenic+and+prosurvival+functions+of+glucose+in+human+mesenchymal+stem+cells+upon+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Proangiogenic and prosurvival functions of glucose in human mesenchymal stem cells upon transplantation.</a> Stem Cells. 31 (3), 526-535 (2013).</li>
<li>Oetgen, M. E., Merrell, G. A., Troiano, N. W., Horowitz, M. C., Kacena, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+femoral+non-union+model+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Development of a femoral non-union model in the mouse.</a> Injury. 39 (10), 1119-1126 (2008).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li>
<li>Zwingenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+femoral+critical-size+bone+defect+model+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice.</a> J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).</li>
<li>Cheung, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+externally+fixed+femoral+fracture+model+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">An externally fixed femoral fracture model for mice.</a> J. Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).</li>
<li>Claes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperhomocysteinemia+is+associated+with+impaired+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Hyperhomocysteinemia is associated with impaired fracture healing in mice.</a> Calcif. Tissue Int. 85 (1), 17-21 (2009).</li>
<li>Drosse, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+femoral+critical+size+defect+model+for+orthotopic+evaluation+of+bone+healing%3A+a+biomechanical%2C+veterinary+and+trauma+surgical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of a femoral critical size defect model for orthotopic evaluation of bone healing: a biomechanical, veterinary and trauma surgical perspective.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 14 (1), 79-88 (2008).</li>
<li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+establishment+of+defined+mouse+models+for+the+study+of+fracture+healing+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Trauma%22%5BJournal%5D)">Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration.</a> J. Orthop. Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).</li>
<li>Johnson, K. D., August, A., Sciadini, M. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ground+cortical+autograft+as+a+bone+graft+material+in+a+new+canine+bilateral+segmental+long+bone+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Trauma%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ground cortical autograft as a bone graft material in a new canine bilateral segmental long bone defect model.</a> J. Orthop. Trauma. 10 (1), 28-36 (1996).</li>
<li>Meinig, R. P., Buesing, C. M., Helm, J., Gogolewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+diaphyseal+bone+defects+using+resorbable+poly%28L%2FDL-lactide%29+and+poly%28D-lactide%29+membranes+in+the+Yucatan+pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Trauma%22%5BJournal%5D)">Regeneration of diaphyseal bone defects using resorbable poly(L/DL-lactide) and poly(D-lactide) membranes in the Yucatan pig model.</a> J. Orthop. Trauma. 11 (8), 551-558 (1997).</li>
<li>Wu, J. J., Shyr, H. S., Chao, E. Y., Kelly, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+osteotomy+healing+under+external+fixation+devices+with+different+stiffness+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Comparison of osteotomy healing under external fixation devices with different stiffness characteristics.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 66 (8), 1258-1264 (1984).</li>
<li>Xing, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+bilateral+femoral+large+segmental+bone+defect+mouse+model+potentially+applicable+to+basic+research+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering.</a> J. Surg. Res. 192 (2), 454-463 (2014).</li>
<li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Survival+and+Osteogenic+Ability+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Orthotopic+and+Ectopic+Sites+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of Survival and Osteogenic Ability of Human Mesenchymal Stem Cells in Orthotopic and Ectopic Sites in Mice.</a> Tissue Eng. Part A. 22 (5-6), 534-544 (2016).</li>
<li>Bos, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+and+tissue+reaction+to+biodegradable+poly%28L-lactide%29+for+use+as+internal+fixation+of+fractures%3A+a+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Degradation of and tissue reaction to biodegradable poly(L-lactide) for use as internal fixation of fractures: a study in rats.</a> Biomaterials. 12 (1), 32-36 (1991).</li>
<li>Oest, M. E., Dupont, K. M., Kong, H. J., Mooney, D. J., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+scaffold+and+growth+factor-mediated+repair+of+critically+sized+bone+defects%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of scaffold and growth factor-mediated repair of critically sized bone defects.</a> J.Orthop. Res. 25 (7), 941-950 (2007).</li>
<li>Pihlajamaki, H., Bostman, O., Tynninen, O., Laitinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+tissue+response+to+bioabsorbable+poly-L-lactide+and+metallic+screws%3A+an+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Long-term tissue response to bioabsorbable poly-L-lactide and metallic screws: an experimental study.</a> Bone. 39 (4), 932-937 (2006).</li>
<li>Rai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+platelet-rich+plasma+with+polycaprolactone-tricalcium+phosphate+scaffolds+for+segmental+bone+defect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Combination of platelet-rich plasma with polycaprolactone-tricalcium phosphate scaffolds for segmental bone defect repair.</a> J. Biomed. Mater Res. A. 81 (4), 888-899 (2007).</li>
<li>Komlev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+in+vivo+bone+deposition+by+bone+marrow+stromal+cells+into+porous+calcium+phosphate+scaffolds%3A+an+X-ray+computed+microtomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetics of in vivo bone deposition by bone marrow stromal cells into porous calcium phosphate scaffolds: an X-ray computed microtomography study.</a> Tissue Eng. 12 (12), 3449-3458 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ektopowa implantacja materiałów i urządzeń związanych z ortopedią u myszy jest powszechnie wykonywana w celu oceny zdolności do tworzenia kości różnych rusztowań13,14. Istnieją jednak istotne różnice między modelami ektopowymi i ortotopowymi, w tym natywne osteogenne czynniki sygnalizacyjne i interakcje parakrynne z komórkami kościotwórczymi gospodarza.
Niniejsze badanie wykazało powtarzalny mysi duży segmentowy ubytek kości udowej o krytycznym rozmiarze (3,5 mm, około 20-25% długości kości udowej). Biorąc pod uwagę wielkość takiego zrostu i stabilność zapewnianą przez wynikową osteosyntezę płytkową, model ten naśladuje klinicznie spotykany zanikowy brak zrostu kostnego.
Okres pooperacyjny wybrany w niniejszym badaniu jest zgodny z wcześniej opisanymi modelami myszy bez zrostu, wykazując brak odpowiedniego gojenia po 8 do 12 tygodniach4,9,15,16.
Co najważniejsze, powtarzalną i stabilną osteosyntezę oraz stabilność wszczepionych substytutów kości uzyskano bez istotnej zachorowalności i śmiertelności1,2 przy użyciu zarówno płytki blokującej, jak i przyrządu do wykonania ostektomii. Wynik ten kontrastuje również z wynikami odnotowanymi po użyciu stabilizatora zewnętrznego lub gwoździa śródszpikowego 4,5,17-24. W przypadku stabilizatorów zewnętrznych potencjalne wady obejmują: zmienność sztywności, infekcje przewodów szpilkowych, poluzowanie szpilek, potencjalne urazy spowodowane przez kołki i ciężar materiałów (od 4 do 20% masy ciała myszy). Do potencjalnych wad gwoździa śródszpikowego należą: wypełnienie jamy szpikowej paznokciem oraz jatrogenne uszkodzenie powierzchni stawowych.
Inne mysie segmentowe ubytki kości udowej o krytycznej wielkości stabilizowane przez osteosyntezę płytkową opisano z ubytkiem kostnym powstałym przez zadzior i o długości od 1,5 do 2 mm16,25. W obecnym modelu użycie przyrządu i drutu piłowego pozwoliło na precyzyjną ostektomię o długości 3,5 mm bez znacznego urazu mięśni.
Jednak, aby odnieść sukces w wykonaniu zabiegu, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych punktów: Nie używaj małych myszy (nagich myszy o wadze poniżej 25 g lub w wieku poniżej 8 tygodni), w przeciwnym razie płytka powinna być zbyt długa. Zbliżając się do kości udowej, należy zadbać o zachowanie zarówno nerwu kulszowego doogonowo, jak i torebki stawowej dystalnie. Nałożyć płytkę na przednią stronę kości udowej, a ponieważ ustawienie płytki jest określane przez zastosowanie tej pierwszej, należy zwrócić uwagę, aby ustawić płytkę równolegle do kości udowej podczas wkładania tej pierwszej.
Przed wykonaniem ostektomii należy wykonać okrężne rozwarstwienie kości udowej w środku trzonu, aby uniknąć urazu mięśniowego. Podczas wykonywania ostektomii asystent chirurga musi mocno trzymać prowadnicę, a chirurg musi uważać (i) aby nie splątać drutu piły, (ii) używać środkowych dwóch trzecich drutu, stosując stałe, stałe napięcie, oraz (iii) unikać nadmiernego ruchu, aby uzyskać proste cięcie kości.
Gojenie kości jest możliwe w obecnym modelu pod warunkiem, że zostanie zastosowany przeszczep kostny. Co więcej, model ten pozwala na dalsze badania mechanizmów zaangażowanych w strategie wymiany kości, gdy w dobrze standaryzowanym, dużym, segmentowym ubytku kostnym stosuje się przeszczepy lub komórki pochodzące od człowieka.
Ponadto, zgodnie z obecnymi trendami wymagającymi udoskonalenia i ograniczenia wykorzystywania zwierząt w badaniach związanych z ortopedią, model ten może być stosowany w połączeniu z technikami obrazowania in vivo , takimi jak bioluminescencja. Takie nieinwazyjne techniki pozwalają monitorować zarówno przeżywalność zagnieżdżonych komórek, jak i gojenie się tkanek bez konieczności składania ofiar ze zwierząt 26.
Głównymi ograniczeniami obecnego modelu są zarówno warunki nośne, jak i objętość powstałego ubytku kostnego, ponieważ nie naśladują one w pełni tych spotykanych klinicznie u ludzi. Inne ograniczenia modelu to (i) nieprzezroczystość promieniotwórcza płytki, która może wymagać usunięcia płytki przed analizą ex vivo μCT i może komplikować interpretację wyników podłużnego badania radiograficznego oraz (ii) brak możliwości modulacji sztywności płytki, która może być kluczowym parametrem mechanicznym w tworzeniu kości27-30.
Należy również pamiętać, że w przypadku stosowania iprzeszczepu kostnego lub innych rusztowań zawierających składnik mineralny (w szczególności węglan wapnia) w procesie segmentacji analizy mikro-CT wprowadzane jest pewne odchylenie, ponieważ gęstość nowo powstałych kości częściowo pokrywała się z gęstością izoprzeszczepu lub gęstością rusztowania. Z tego powodu objętość kości uzyskana w wyniku analizy mikro-CT w większości odzwierciedla objętość zmineralizowanej tkanki (nowo powstała kość plus substytut kości)11,26,31.

Masywne ubytki kości trzonu są wielkim wyzwaniem dla chirurga ortopedy. Zastąpienie kości autologicznym przeszczepem kostnym, obecnie uważane za złoty standard leczenia, jest dostępne w ograniczonej liczbie i wiąże się z chorobowością związaną z pobraniem. Z tych powodów inżynieria tkankowa konstruktów kostnych łączących mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego z rusztowaniami osteokondukcyjnymi została zbadana jako alternatywa dla autoprzeszczepów w chirurgii ortopedycznej.
Do tej pory większość badań przeprowadzono na klinicznie istotnych modelach zwierzęcych, takich jak psy, świnie i owce1-3, ale wstępna ocena tych konstruktów w ortotopowych, segmentowych, krytycznych rozmiarach wad kostnych w modelach małych zwierząt (takich jak myszy) może mieć kilka zalet: (i) niskie koszty, (ii) duża liczba zwierząt może być operowana; (iii) w przeciwieństwie do dużych modeli zwierzęcych, jednorodność szczepów myszy ogranicza indywidualne różnice w resorpcji rusztowania i tworzeniu kości; (iv) Co najważniejsze, dostępność specyficznych przeciwciał i zwierząt ukierunkowanych na geny umożliwia ocenę procesu biologicznego związanego z gojeniem się kości. Wreszcie, co nie mniej ważne, wykorzystanie szczepów myszy z niedoborem odporności umożliwia również badania z wykorzystaniem przeszczepów lub komórek pochodzenia ludzkiego bez niepożądanych odpowiedzi immunologicznych u myszy.
Pomimo wyżej wymienionych zalet, modele masywnych ubytków kostnych trzonu u myszy są rzadkie. W większości takich modeli stosuje się stabilizację kości za pomocą szpilki śródszpikowej, która wypełnia jamę szpiku kostnego (ograniczając w ten sposób objętość badanego materiału), a także utrudnia odtwarzalność, nie zapewniając stabilności obrotowej i osiowej2,4-7.
Cele obecnego badania to (i) naśladowanie klinicznej sytuacji braku zrostu kostnego, aby opisać powtarzalny, krytyczny rozmiar, segmentowy model ubytku kości udowej u myszy, który jest stabilizowany przez dokładną i powtarzalną osteosyntezę płytki blokującej, która zapewnia wysoce stabilne środowisko biomechaniczne8-10; (ii) zilustrowanie obecnego modelu dwoma potencjalnymi substytutami kości oraz opisanie analiz tworzenia kości, które można zastosować.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM , Minimum Essential Medium Eagle</td><td>Sigma-Aldrich, Francja</td><td>M4526</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Acropora sp. kostki egzoszkieletu koralowego, Biocoral&reg;</td><td>Biocoral&reg;, Inoteb, Francja</td><td></td><td>Kostki 3 x 3 x 3 mm, autoklawowanie (121 &deg; C przez 20 min) sterylizacja</td></tr><tr><td>Buprenorfina, Buprecare&reg;</td><td>Axience, Pantin, Francja</td><td></td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>Ksylazyna, Rompun&reg; 2%</td><td>Bayer HealthCare, Puteaux, Francja</td><td>20 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina, Ketamina 500&reg;</td><td>Virbac, Carros, Francja</td><td></td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Izofluran, For&egrave; ne&reg;</td><td>Abbott, Arcueil, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enrofloksacyna, Baytril&reg; 5%</td><td>Bayer HealthCare, Puteaux, Francja</td><td>50 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital, Dolethal&reg;</td><td>V&eacute; tochinol, Przynęta, Francja</td><td></td><td>182,2 mg/ml</td></tr><tr><td>Pudełko anestezjologiczne</td><td>Ugo Basile, Gemonio, Włochy</td><td>7900/10</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa przezroczysta sterylna serweta, BusterOpCover 30 x 45 cm</td><td>Buster, Coveto, Montagu, Francja</td><td>613867</td><td></td></tr><tr><td>10% jodu powidonu, V&eacute; t&eaostry; Obiad&reg; Rozwiązanie</td><td>V&eacute; toquinol, Przynęta, Francja</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Tytanowa płytka mikroblokująca, MouseFix Plate XL</td><td>RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/</td> <td>RIS.401.120</td><td>6 otworów, 10 mm długości i 1,5 mm szerokości, autoklawowanie (121 &deg; C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu)</td></tr><tr><td>Wiertło 0,3 mm, Wiertło 0,30 mm</td><td>RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/</td> autoklawowanie <td>RIS.592.200</td><td>(121 &deg; C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu)</td></tr><tr><td>Moc silnika</td><td>RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/</td> <td>AccuPen</td><td>Sterylizacja na zimno (tlenek etylenu)</td></tr><tr><td>Śrubokręt, Handrill</td><td>RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/</td> autoklawowanie <td>RIS.390.130</td><td>(121 &deg; C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu)</td></tr><tr><td>Samogwintujące wkręty blokujące, MouseFix Śruba 2 mm</td><td>RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/</td> <td>RIS.401.100</td><td>2 mm długości, 0,47 mm średnicy zewnętrznej i 0,34 mm średnicy rdzenia, autoklawowanie (121 &deg; C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu)</td></tr><tr><td>Przyrząd, MouseFix XL Prowadnica wiertarki i piły</td><td>RISystem AG, Davos, Szwajcaria, http://www.risystem.com/</td> <td>RIS.301.103</td><td>3,5 mm między szczelinami, autoklawowanie (121 &deg; C przez 20 min) sterylizacja lub sterylizacja na zimno (tlenek etylenu)</td></tr><tr><td>Piły Gigli 0,22 mm (piły 0,22 mm)</td><td>RISystem AG, Davos, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.0 glycomer 631, Biosyn</td><td>Covidien, V&eacute; tochinol, Przynęta, Francja</td><td></td><td>Igła do gwintowania</td></tr><tr><td>4.0 glycomer 631, Biosyn</td><td>Covidien, V&eacute; toquinol, Przynęta, Francja</td><td></td><td>Rentgenowska igła z gwintownikiem</td></tr><tr><td>, MX20</td><td>Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>In vivo tomografia mikrokomputerowa o wysokiej rozdzielczości, Skyscan 1176</td><td>Skyscan, Aartselaar, Belgia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ex vivo tomografia mikrokomputerowa o wysokiej rozdzielczości, Skyscan 1172</td><td>Skyscan, Aartselaar, Belgia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie rezydentne: Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4)</td><td>Skyscan, Aartselaar, Belgia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

Wykorzystanie konstruktów kostnych inżynierii tkankowej jest atrakcyjną strategią przezwyciężania wad autoprzeszczepów w leczeniu masywnych wad kostnych. Jako organizm modelowy, mysz była już szeroko wykorzystywana w badaniach związanych z kośćmi. Duże modele ubytków kostnych trzonu u myszy są jednak rzadkie i często wykorzystują fiksację kostną, która wypełnia jamę szpiku kostnego i nie zapewnia optymalnej stabilności mechanicznej. Celem obecnego badania było rozwinięcie krytycznej wielkości, segmentowej wady kości udowej u nagich myszy. Wykonano 3,5-milimetrową ostektomię kości udowej środkowej trzonu kości udowej (około 25% długości kości udowej) za pomocą dedykowanego przyrządu i stabilizowano ją za pomocą umieszczonej z przodu płytki blokującej i 4 blokujących. Ubytek kostny pozostawiono następnie pustym lub wypełniono substytutem kości (syngeniczny przeszczep kostny lub rusztowanie koralowe). Gojenie się kości monitorowano nieinwazyjnie za pomocą radiografii i mikrotomografii komputerowej in vivo, a następnie oceniano za pomocą mikrotomografii komputerowej ex vivo i nieodwapnionej histologii po uśmierceniu zwierząt, 10 tygodni po operacji. Rekonwalescencja u wszystkich myszy była doskonała, w ciągu jednego dnia po zabiegu chirurgicznym zaobserwowano pełne obciążenie. Ponadto u wszystkich zwierząt badanych w trakcie badania uzyskano stabilne unieruchomienie kości i konsekwentne utrwalenie wszczepionych materiałów. Kiedy ubytki kostne pozostały puste, konsekwentnie uzyskiwano brak zrostu. Natomiast gdy ubytki kostne były wypełniane syngenicznymi przeszczepami kostnymi, zawsze obserwowano zrost kostny. Gdy ubytki kostne zostały wypełnione rusztowaniami koralowymi, nowo powstałą kość obserwowano na granicy między krawędziami resekcji kości a rusztowaniem, a także w niewielkiej odległości w obrębie rusztowania. 
Obecny model opisuje powtarzalny krytyczny rozmiar ubytku kości udowej stabilizowany przez osteosyntezę płytkową z niską zachorowalnością u myszy. Nowy nośny model segmentowego ubytku kości może być przydatny do badania mechanizmów leżących u podstaw regeneracji kości związanych z zastosowaniami ortopedycznymi.

Wspomniane procedury chirurgiczne trwały od 45 do 60 min. Ostektomię i osteosyntezę łatwo było przeprowadzić przy pomocy asystenta chirurga, bez użycia żadnego systemu powiększającego. Nie wystąpiły żadne powikłania śródoperacyjne. W badaniu wstępnym na 18 myszach11 zdjęcia rentgenowskie wykonane po operacji wykazały, że długość ubytku kostnego (3.43 ± 0.12 mm) oraz ułożenie płytki (odległość między jamą stawu kolanowego a dystalną częścią płytki = 2.65 ± 0.56 mm) były powtarzalne.
Wskaźnik śmiertelności związanej z znieczuleniem wynosił około 5%.
Powrót funkcji operowanej kończyny był doskonały u wszystkich zwierząt, a pełne obciążenie kończyny zaobserwowano w ciągu doby po operacji (Animated Figure 1). Masa zestawu do osteosyntezy (płytka i śruby) użytego w niniejszym badaniu stanowiła około 0,1% masy ciała myszy. Nie wystąpiły żadne powikłania pooperacyjne (np. zakażenie rany, uszkodzenie implantu, przemieszczenie przeszczepu kostnego itp.). Nie odnotowano przypadków samookaleczeń ani obrażeń spowodowanych przez współlokatorów z klatki.
W przypadku pozostawienia chirurgicznie wywołanych ubytków kostnych pustych, nie zaobserwowano istotnej kostnienia, co wiązało się z trwałą brakiem zrostu kostnego. W przeciwieństwie do tego, gdy ubytki wypełniono izograftem lub rusztowaniem koralowym, zaobserwowano nowo powstałą tkankę kostną rozciągającą się od proksymalnych i dystalnych krawędzi kości. Ponadto, o ile kostnienie pozwoliło na przywrócenie ciągłości kości w większości ubytków leczonych izograftami (Rycina 8), o tyle w ubytkach wypełnionych rusztowaniem koralowym proces ten zaobserwowano jedynie w obrębie samego rusztowania. W rzeczywistości nie stwierdzono obecności kości w odległości większej niż 1 mm od krawędzi kostnych. Brak chrząstki we wszystkich wynikach analiz histologicznych stanowił dowód na stabilność uzyskanego zespolenia kostnego (Rycina 9, Rycina 10).
Radiografie i analizy microCT wykazały, że w żadnym zwierzęciu z grupy z pozostawionym pustym ubytkiem nie nastąpiło zrost kostny 10 tygodni po implantacji. Objętość tkanki zmineralizowanej oceniona w analizach microCT wyniosła 0,8 ± 0,3 mm3 i była reprezentatywna dla nowo powstałej kości. W grupach izoszczepu oraz rusztowania koralowego zrost kostny uzyskano odpowiednio u 4 i 4 zwierząt. Objętość tkanki zmineralizowanej oceniona w analizach microCT wyniosła 4,4 ± 0,9 mm3 oraz 8,9 ± 0,7 mm3. W tych grupach jednak, ponieważ zarówno izoszczep, jak i rusztowanie koralowe zawierały minerały, nie można było jednoznacznie odróżnić nowej kostnienia od pozostałego materiału implantowanego (izoszczepu lub rusztowania koralowego). Zarówno wskaźnik zrostu kostnego, jak i objętość tkanki zmineralizowanej uzyskane w grupie izoszczepu oraz grupie rusztowania koralowego były istotnie (p &lt; 0,001) wyższe niż w grupie z pozostawionym pustym ubytkiem.
<img alt="Chirurgiczne odsłonięcie kości udowej gryzonia do eksperymentu z fiksacją złamania, metoda badań ortopedycznych." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Chirurgiczne odsłonięcie w celu utworzenia segmentowego ubytku w kości udowej. W przedniobocznej części kości udowej wykonano podłużne nacięcie skóry o długości 15 - 17 mm, rozciągające się od stawu biodrowego do stawu kolanowego. Nacięto powięź szeroką (fascia lata); mięsień obszerny boczny (vastus lateralis) oraz mięsień dwugłowy uda (biceps femoris) zostały rozdzielone, aby odsłonić całą długość trzonu kości udowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Procedura osteotomii kości udowej; metoda stabilizacji kości; eksperyment chirurgiczny; badanie ortopedyczne." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Pozycjonowanie płytki i umieszczenie śruby proksymalnej. Płytkę przymocowano do przedniej strony kości udowej. Wywiercono otwór w najbardziej proksymalnej części płytki; następnie wprowadzono i zablokowano pierwszą śrubę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procedura stabilizacji kości; schemat implantu ortopedycznego i przygotowanie chirurgiczne do stabilizacji złamania." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Umiejscowienie dystalnej śruby. Wywiercono otwór w najbardziej dystalnej części płytki, a następnie wprowadzono i zablokowano śrubę. ( przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Metody fiksacji ortopedycznej; schemat i zastosowanie chirurgiczne; ilustracja techniki naprawy kości." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Pozycjonowanie piły Gigli. Dwie pozostałe zewnętrzne śruby zostały wprowadzone, lecz nie zablokowane, a drut piły Gigli 0,22 mm został ciasno związany wokół kości w orientacji przyśrodkowo-bocznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces stabilizacji kości za pomocą stabilizatora zewnętrznego; schemat i przygotowanie chirurgiczne do stabilizacji złamania." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Pozycjonowanie szablonu. Szablon nasunięto na trzpienie dwóch ostatnich śrub, umieszczono go nad płytką, a następnie w szczeliny szablonu wprowadzono brzeszczot piły. (Przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces fiksacji ortopedycznej; schemat i zdjęcie chirurgiczne przedstawiające wyrównanie i stabilizację kości." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Ostektomia. Wykonano ostektomię, a następnie wycofano piłę Gigli. (Przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment stabilizacji kości, metoda stabilizacji zewnętrznej, schemat i przygotowanie chirurgiczne, badania ortopedyczne." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Blokowanie wewnętrznych śrub. Usunięto szablon i zablokowano dwie ostatnie śruby. Defekty segmentowe pozostawiono następnie puste lub wypełniono testowanymi materiałami. (Przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Postępy w gojeniu kości, zdjęcia rentgenowskie w odstępach czasu, defekt, przeszczep, porównanie rusztowań, badanie naukowe." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Reprezentatywne pooperacyjne radiogramy i strzałkowa rekonstrukcja μCT kości udowej myszy. Kość udowa z odpowiednim defektem pozostawionym pustym (A-E), wypełnionym masywnym syngenicznym przeszczepem kostnym (F-J) lub wypełnionym masywnymi rusztowaniami z koralowca Acropora (K-O); bezpośrednio po operacji (A, F, K), 4 tygodnie po operacji (B, G, L), 6 tygodni po operacji (C, H, M) oraz 10 tygodni po operacji (D, E, I, J, N, O) (długość płytki = 10 mm). (Reprodukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="RTG i histologia stabilizacji kręgosłupa z integracją kostną, przedstawiająca analizę strukturalną i syntezę." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Reprezentatywny obraz RTG, rekonstrukcja μCT i histologia ubytku wypełnionego rusztowaniem koralowym badanym w niniejszym badaniu. Obserwowano dużą ilość nowo powstałej kości pomiędzy otaczającymi krawędziami kostnymi a rusztowaniem koralowym; w przeciwieństwie do tego, wewnątrz rusztowania obecne było niewiele kości. Barwienia: błękit Stevenela i piktrofuksyna von Giesona. W tych warunkach kość, komórki i koral barwiły się odpowiednio na czerwono, niebiesko i brązowo. Pasek skali = 500 μm. ACS = rusztowanie koralowe Acropora; BN = kość. (Przedrukowano za zgodą z Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa tkanki kostnej; obrazy histologiczne A, B, C; widoczna tkanka włóknista, szpik kostny, ACS." src="/files/ftp_upload/52940/52940fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10: Reprezentatywna histologia ubytku pozostawionego pustym (A), wypełnionego masywnym syngenicznym przeszczepem kostnym (B) oraz wypełnionego rusztowaniem koralowym (C). W ubytku pozostawionym pustym zaobserwowano zaokrąglenie krawędzi kostnych wraz z wypełnieniem kanału szpikowego i obfitą ilością tkanki włóknistej głęboko w ubytku. W ubytku wypełnionym masywnym syngenicznym przeszczepem kostnym zaobserwowano ciągłość kostną między przeszczepem a otaczającymi krawędziami kostnymi; szpik kostny był obecny w całej pierwotnej jamie. W ubytku wypełnionym rusztowaniem koralowym zaobserwowano nowo powstałą kość między otaczającymi krawędziami kostnymi a rusztowaniem koralowym, lecz wewnątrz rusztowania obecna była niewielka ilość kości. Barwienia: błękit Stevenela i pikrofuchsina von Giesona. W tych warunkach kość, komórki i koral barwiły się odpowiednio na czerwono, niebiesko i brązowo. Pasek skali = 500 mm. ACS, rusztowanie koralowe; BN, kość; BM, szpik kostny; FT, tkanka włóknista. (Przedrukowano za zgodą Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/52940fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza zachowania szczura laboratoryjnego w układzie siatkowym do badań eksperymentalnych nad nawigacją przestrzenną." src="/files/ftp_upload/52940/52940animfig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Animowana Figura 11"> 
Animowana Figura/Wideo 1: Reprezentacyjne nagranie wideo chodu myszy jeden dzień po operacji. Zaobserwowano pełne obciążenie kończyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52940/Animated_Figure1.MOV" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.</a>

Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Ogólnym celem tej interwencji chirurgicznej jest utworzenie w kości udowej myszy krytycznego defektu kostnego stabilizowanego za pomocą osteosyntezy płytkowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanki kostnej dotyczące zdolności do gojenia kości konkretnych substytutów kostnych oraz procesów zaangażowanych w regenerację kości. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na uzyskanie powtarzalnego defektu w kości obciążonej, co jest istotne dla ortopedycznych zastosowań tego modelu.Po aseptycznym przemyciu kończyny należy założyć sterylną, przezroczystą plastikową tkaninę zabezpieczającą mysz, a następnie wykonać w niej mały otwór w celu wyizolowania nogi. Przy znieczulonej myszy w pozycji brzusznej, z wyprostowaną lewą kończyną tylną, należy wykonać podłużne nacięcie skóry o długości od 15 do 17 milimetrów nad przednio-boczną powierzchnią kości udowej, rozciągając je od stawu biodrowego do stawu kolanowego. Następnie należy naciąć powięź szeroką uda (fascia lata) i rozdzielić mięsień obszerny boczny oraz mięsień dwugłowy uda, aby odsłonić pełną długość trzonu kości udowej.Aby zwiększyć ekspozycję trzonu kości udowej, przetnij mięśnie pośladkowe oraz mięsień dwugłowy uda w obrębie trzeciego krętościa i wykonaj okrężną dyssekcję kości udowej na wysokości środka trzonu. Następnie zamocuj sześciootworową tytanową mikropłytkę blokującą na przedniej stronie kości udowej. Użyj wiertła o średnicy 0,3 mm, aby wywiercić najbardziej proksymalny otwór w płytce.Używając specjalistycznego śrubokręta, wkręć pierwszą śrubę, trzymając płytkę równolegle do kości udowej. Następnie, utrzymując płytkę w pozycji, wywierć otwór w najbardziej dystalnej części płytki, a potem wprowadź i zablokuj drugą śrubę. Wprowadź dwie ostatnie śruby bez ich blokowania.Następnie należy umieścić drut piły oscylacyjnej o grubości 0,2 mm blisko kości udowej w orientacji przyśrodkowej bocznej. Na trzpienie dwóch ostatnich śrub należy założyć odpowiedni uchwyt, a następnie zastosować go powyżej płytki. Następnie, przy jednoczesnym obfitym przemywaniu sterylnym roztworem soli izotonicznej, należy wykonać ostektomię w połowie trzonu kości udowej o długości 3,5 mm, wykorzystując środkowe dwie trzecie drutu i przykładając stały, równomierny nacisk na kość.Po przecięciu kości odetnij drut piłki blisko kości z jednej strony i zdejmij szablon. Zablokuj dwa ostatnie wkręty, a następnie obficie przemyj pole operacyjne sterylną solą fizjologiczną. Następnie chirurgicznie wypełnij ubytek segmentowy badanym materiałem testowym i luźno ułóż mięsień obszerny boczny nad płytką.Na koniec, do zamknięcia powięzi i warstw podskórnych należy użyć nici glycomer 631 o rozmiarze 5-0 w prostym szwie ciągłym, natomiast skórę należy zamknąć nićmi glycomer 631 o rozmiarze 4-0, stosując prosty szew przerywany. Masa materiałów użytych do osteosyntezy w niniejszym badaniu wynosiła około 0,1% masy ciała myszy; nie wystąpiły żadne powikłania pooperacyjne, samookaleczenia ani obrażenia zadane przez współlokatorów klatki. Rekuperacja funkcjonalna operowanej kończyny była doskonała u wszystkich zwierząt, a pełne obciążanie kończyny zaobserwowano w ciągu doby po zabiegu.W przypadku pozostawienia chirurgicznie wywołanych ubytków kostnych pustych nie zaobserwowano istotnej regeneracji kości, co skutkowało stałym brakiem zrostu kostnego u wszystkich zwierząt. W przeciwieństwie do tego, gdy ubytki wypełniono izograftem lub rusztowaniem koralowym, zaobserwowano nowo powstałą tkankę kostną rozprzestrzeniającą się od proksymalnej i dystalnej krawędzi kości.Jednakże, podczas gdy tworzenie kości pozwoliło na przywrócenie ciągłości tkanki kostnej, w większości defektów leczonych izoprzeszczepami przywrócenie kości zaobserwowano jedynie pomiędzy rusztowaniem a kostnymi krawędziami defektów wypełnionych koralem. W grupie z pustymi defektami u żadnego z zwierząt nie doszło do zrostu kostnego dziesięć tygodni po implantacji. W grupach z izoprzeszczepami i rusztowaniami koralowymi zrost kostny osiągnięto u większości zwierząt, przy czym wewnątrz samego rusztowania zaobserwowano bardzo mało tkanki kostnej.Po opanowaniu techniki, prawidłowo przeprowadzona procedura zajmuje od 45 do 60 minut. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać, że stabilność kości jest zapewniona przez osteosyntezę płytkową, dlatego płytka powinna zostać umieszczona w prawidłowej pozycji na kości udowej. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikro-CT i obrazowanie bioluminescencyjne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tworzenia kości oraz przeżywalności implantów w przypadku użycia samousieciowanej formy z łuski jako wypełniacza ubytku.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu inżynierii tkanki kostnej do badania procesów regeneracji kości. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wywołać powtarzalny defekt kostny w obciążonej kości mysiej, stabilizowanej za pomocą osteosyntezy płytkowej. Należy pamiętać, że praca ze zwierzętami i narzędziami chirurgicznymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak utrzymanie sterylności, ostrożne stosowanie znieczulenia oraz dbałość o dobrostan zwierząt.

establishment-segmental-femoral-critical-size-defect-model-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje metodę stabilizacji złamań kości długich opartą na zastosowaniu zmodyfikowanych zewnętrznych stabilizatorów Ilizarova 1-3. Po zastosowaniu stabilizatorów i wywołaniu urazu kostnego można oceniać proces gojenia, przeprowadzać osteogenezę dystrakcyjną lub tworzyć staw rzekomy bądź defekt o rozmiarze krytycznym w celu badania interwencji terapeutycznych.

Tworzenie sztywno stabilizowanych złamań do oceny kostnienia błonowego, osteogenezy dystrakcyjnej lub gojenia ubytków o rozmiarze krytycznym

Jednym z ograniczeń badań przedklinicznych w dziedzinie naprawy kości jest brak eksperymentalnej kontroli nad lokalnym środowiskiem mechanicznym w obrębie gojącej się zmiany kostnej. Przedstawiamy projekt i zastosowanie stabilizatora zewnętrznego do naprawy kości z możliwością zmiany sztywności stabilizatora in vivo.

Regulowana sztywność, stabilizator zewnętrzny do osteotomii kości udowej szczura i modele segmentalnych ubytków kostnych

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do naśladowania poważnych uszkodzeń kości w badaniach biomedycznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, ustalenie ustabilizowanych zmian kostnych u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W tym artykule opisujemy prostą metodę ustalania i analizowania eksperymentalnych wad kości udowej u myszy.

Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

Ten protokół opisuje technikę osteosyntezy wykorzystującą gwóźdź blokujący śródszpikowy do standaryzacji osteotomii kości udowej, która może być używana do analizy prawidłowego i wadliwego gojenia kości u myszy.

Śródszpikowy gwóźdź blokujący do standaryzowanego mocowania osteotomii kości udowej w celu analizy prawidłowego i wadliwego gojenia kości u myszy

Ten protokół opisuje minimalnie inwazyjną technikę osteosyntezy wykorzystującą śródszpikową do standaryzowanej stabilizacji złamań kości udowej, która może być wykorzystana do analizy endochrzęstnego gojenia kości u myszy.

Minimalnie inwazyjny model do analizy gojenia złamań śródchrzęstnych u myszy w standaryzowanych warunkach biomechanicznych

Prezentujemy model osteogenezy rozproszenia kości piszczelowej myszy opracowany przy użyciu specjalnie wykonanego dystraktora. Wykorzystanie myszy jako celu analizy jest korzystne dla postępu badań.

Model osteogenezy rozpraszającej uwagę myszy

Model mysiego zamkniętego złamania kości udowej jest potężną platformą do badania gojenia złamań i nowatorskich strategii terapeutycznych przyspieszających regenerację kości. Celem tego protokołu chirurgicznego jest wygenerowanie jednostronnie zamkniętych złamań kości udowej u myszy za pomocą śródszpikowego pręta stalowego do stabilizacji kości udowej.

Generowanie zamkniętych złamań kości udowej u myszy: model do badania gojenia kości

Modele in vivo krytycznych wymiarów kości u ssaków są niezbędne dla badaczy badających mechanizmy leczenia i terapie ortopedyczne. W tym miejscu wprowadzamy protokół tworzenia powtarzalnych, segmentowych ubytków kości udowej u szczurów stabilizowanych za pomocą stabilizacji zewnętrznej.

Wiarygodny i powtarzalny model segmentalnej wady kości udowej o krytycznej wielkości u szczurów stabilizowany za pomocą niestandardowego stabilizatora zewnętrznego

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Przedstawiono protokół operacji osteotomii kości udowej z użyciem wewnętrznego mocowania płytki u dojrzałych aksolotlów. Zabieg może być wykorzystany do wykonywania badań porównawczych nad regeneracją kończyn i gojeniem złamań u wodnych.

Stabilizacja osteotomii kości udowej z mocowaniem płytki w Ambystoma mexicanum

Badanie to ustanowiło model defektu półsegmentalnego szczura kości udowej do oceny mechanicznej i osteogenicznej wydajności materiałów zastępczych kości w warunkach nośnych, bez użycia wewnętrznego lub zewnętrznego fiksacji.

Model defektu kości dwułopowatej półsegmentalnej u szczurów do oceny wydajności substytucji kości w obszarach nośnych

Poznaj metodę tworzenia segmentalnego ubytku krytycznej wielkości w kości udowej myszy z wykorzystaniem osteosyntezy płytkowej. Ta technika umożliwia badanie procesów regeneracji kości i ocenę biomateriałów w modelu ortopedycznym.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Przeglądaj więcej filmów