Name: Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę qPCRTag do szybkiego genotypowania chromosomów syntetycznych Saccharomyces cerevisiae bez elektroforezy żelowej. Technika zwiększa przepustowość badań genomowych dzięki miniaturyzacji reakcji PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Science Foundation Grant MCB-0718846 oraz Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (dla J.D.B.). L.A.M. został sfinansowany przez stypendium podoktoranckie z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Publikacja tego artykułu jest sponsorowana przez Roche.

1. Przygotowanie genomowego DNA drożdży (gDNA)
<ol>
	<li>Przygotuj zapas buforu do lizy drożdży9, który zawiera 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS (w/v), 2% Triton X-100 (v/v), 1 mM EDTA pH 8,0.</li>
	<li>Jako materiał wyjściowy należy użyć ~2 x 106 komórek, co zwykle odpowiada ~100 μl nasyconej kultury dla szczepów laboratoryjnych na tle BY474110. Wyhodowane komórki należy zebrać przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do lizy drożdży i ponownie zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie.</li>
	<li>Dodać ~300 μl mytych kwasem kulek szklanych tak, aby poziom kulek znajdował się około 1 mm poniżej poziomu zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Do dygestorium dodać 200 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1). Zakryj rurkę do mikrofugi i upewnij się, że między nakrętką a rurką nie utknęły żadne koraliki, ponieważ spowoduje to wycieki podczas potrząsania (krok 1.6). Odwróć 3 razy, aby wymieszać i sprawdź, czy nakrętka jest szczelna.</li>
	<li>Potrząsaj probówką przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą miksera stołowego, takiego jak Eppendorf 5432.</li>
	<li>Wirować przy 20 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 75 μl fazy wodnej do nowej probówki do mikrofugi zawierającej 1 ml 100% etanolu. Odwróć 10 razy, aby wymieszać.</li>
	<li>Osadzać DNA przez odwirowanie w temperaturze 20 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant bez usuwania osadu DNA. Umyj granulat 500 μl 70% etanolu.</li>
	<li>Wirować przy 20 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant bez usuwania osadu DNA i wysuszyć go na powietrzu z otwartą nasadką do mikrofuge, aż nadmiar etanolu odparuje, co zwykle trwa około 10 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad DNA w 75 μl 10mM Tris pH 7,4 i wirować do wymieszania. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony. Zmierz stężenie DNA w próbce za pomocą fluorymetru laboratoryjnego, takiego jak Qubit, który odróżnia DNA od RNA. Upewnij się, że końcowe stężenie gDNA wynosi ~1-2 ng/μl.</li>
	<li>Przygotuj rozcieńczenie genomowego DNA w stosunku 1:10, używając wody i wiru do wymieszania.</li>
	<li>Podwielokrotność 30 μl rozcieńczonego gDNA do odpowiedniego dołka płytki źródłowej, która jest kompatybilna z dozownikiem cieczy akustycznej w nanoskali (etap 3). Jeśli używasz Labcyte Echo 550, użyj 384-dołkowej płytki polipropylenowej (płytka 384PP). 
	UWAGA: Przy odpowiednim zamknięciu płytka ta może być przechowywana przez co najmniej jeden miesiąc w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Przygotuj i dozuj qPCR Master Mix do 1,536 Multiwell Plate
<ol>
	<li>Przygotuj 850 μl głównej mieszanki qPCR, takiej jak LightCycler 1536 DNA Green Master, w 1,5 ml probówce do mikrofuge i wymieszaj wirowo. Odwirować główną mieszankę qPCR przez 2 minuty przy 20 800 x g w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Składniki głównej mieszanki qPCR wymagane dla pojedynczej płytki wielodołkowej 1,536 są następujące:
	<ol>
		<li>Połącz 170 μl głównej mieszanki enzymatycznej (Green Master Tube 1, 5x zagęszczona), 42,5 μl SYBR (Green Master Tube 4, 20x zagęszczona) i 637,5 μl wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dozować 500 nl/dołek do 1,536 płytki wielodołkowej za pomocą dozownika płynów luzem, takiego jak Art Robbins Cobra. (Zauważ, że kroki 2.2.1-2.2.4 odnoszą się konkretnie do Kobry.)
	<ol>
		<li>Utwórz program dozowania z następującymi ustawieniami: klasa cieczy, woda; objętość ssania, 800 μl; objętość dozowania, 500 nl; czas prania, 20 sek. W ustawieniach dozowania sprawdź, czy prędkość dozowania jest ustawiona na 49.6 mm/s, przesunięcie dozowania wynosi 0.25 mm, a nadmiar zasysanej cieczy zostanie dozowany z powrotem do studzienki źródłowej.</li>
		<li>Umieścić probówkę do mikrofuge zawierającą główną mieszankę qPCR w studzience A1 w uchwycie probówki do mikrofuge, która znajduje się w pozycji pokładu 1. Odetnij nakrętkę rurki do mikrofuge lub po prostu pozostaw ją otwartą. Ustaw "Studnię zasysania" na A1, edytując ustawienia aspiracji.</li>
		<li>Wykonaj etap mycia przed dozowaniem głównej mieszanki qPCR, najpierw odznaczając kroki zasysania i dozowania programu skonfigurowanego w kroku 2.2.2, a następnie naciskając przycisk "uruchom". Po zakończeniu ponownie wybierz kroki zasysania i dozowania przed uruchomieniem pełnego programu w celu dozowania głównej mieszanki qPCR. Jeśli Cobra była bezczynna przez mniej niż 10 minut, początkowy etap mycia, który służy do zalania systemu, nie jest konieczny.</li>
		<li>Naciśnij "uruchom", aby dozować główną mieszankę qPCR do każdego dołka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać główną mieszankę qPCR na dnie każdej studzienki przez krótkie odwirowanie płytki wielodołkowej 1536 (30 sekund przy użyciu wirówki do PCR o niskiej prędkości).</li>
</ol>
3. Dozuj matrycę DNA i startery do 1,536 płytki wielodołkowej
<ol>
	<li>Dozować 5 nl rozcieńczonego gDNA (krok 1.3) do żądanych dołków płytki wielodołkowej 1536 za pomocą akustycznego systemu przenoszenia cieczy, takiego jak Echo 550.
	<ol>
		<li>W przypadku Echo 550 użyj oprogramowania Plate Formatat lub alternatywnie dostarcz niestandardowy arkusz kalkulacyjny Excel, aby zaprogramować transfer. Upewnij się, że wybrane źródło gDNA w programie dobrze pasuje do źródła, do którego fizycznie dozowałeś gDNA (krok 1.3). Wybierz typ płytki źródłowej "384PP_AQ_BP2", co oznacza, że ciecz w płytce 384PP jest buforem bez środków powierzchniowo czynnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dozować 10 nl starterów, wstępnie zmieszanych do przodu i do tyłu do końcowego stężenia 50 μM każdy, do żądanych dołków płytki wielodołkowej 1536 za pomocą akustycznego systemu przenoszenia cieczy, takiego jak Echo 550.
	<ol>
		<li>W przypadku systemu przenoszenia cieczy użyj oprogramowania Plate Formatat lub alternatywnie udostępnij niestandardowy arkusz kalkulacyjny Excel, aby zaprogramować transfer. 
		UWAGA: W tym przypadku możliwe jest dozowanie starterów w taki sposób, aby układ na 1,536 płytce wielodołkowej odpowiadał kolejności chromosomów starterów, dzięki czemu łatwo jest później wizualnie sprawdzić wyniki PCR w czasie rzeczywistym (krok 6).</li>
		<li>Wstępnie wymieszaj podkłady w płytce kompatybilnej z dozownikiem płynu akustycznego. W przypadku Echo 550 użyj płytki Labcyte 384LDV (niska objętość martwa) i wybierz typ płytki źródłowej "384LDV_AQ_B" podczas programowania Echo, aby wskazać, że ciecz jest prostym buforem bez białek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Uszczelnij i odwiruj płytkę wielodołkową 1536
<ol>
	<li>Korzystając z systemu zgrzewania mikropłytek, takiego jak Plateloc Thermal Microplate Sealer, natychmiast uszczelnij płytkę wielodołkową 1,536 za pomocą optycznie przezroczystego uszczelnienia, które jest kompatybilne z urządzeniem do zgrzewania. Nie dotykaj powierzchni uszczelki, aby uniknąć smug.
	<ol>
		<li>W przypadku korzystania z termicznego zgrzewarki do mikropłytek Plateloc należy zastosować następujące ustawienia: czas zgrzewania 2,0 s, temperatura zgrzewu 162 °C, ciśnienie powietrza 82 psi. Ten instrument nagrzewa się ~5 minut, dlatego należy go wcześniej włączyć.</li>
		<li>W przypadku korzystania z termicznego uszczelniacza do mikropłytek Plateloc należy użyć adaptera w celu podniesienia wysokości płytki wielodołkowej 1536 na stoliku instrumentu, aby zapewnić dobre uszczelnienie. 
		UWAGA: Chociaż lepiej jest zakupić płytkę Stage do termicznego uszczelniacza do mikropłytek Plateloc, alternatywnym rozwiązaniem jest włożenie czterech standardowych podkładek o grubości ~ 2 mm dostępnych w każdym sklepie z narzędziami w rogach, aby podnieść wysokość płytki wielodołkowej 1,536.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast odwirować szczelnie zamkniętą płytkę wielodołkową 1,536 o masie 2,000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać wszystkie odczynniki na dnie każdej studzienki.</li>
</ol>
5. PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Zaprogramuj urządzenie do 1,536 qPCR, takie jak LightCycler 1536, z dwuetapowym protokołem amplifikacji, po którym następuje analiza krzywej topnienia. Korzystając z oprogramowania LightCycler 1 536, skonfiguruj program w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wstępna inkubacja: 95 °C, 1 min zatrzymania, szybkość narastania 4,8 °C/s, bez akwizycji.</li>
		<li>Wzmocnienie dwuetapowe: 30 cykli [95 °C, bez zatrzymania, szybkość narastania 4,8 °C/s, bez akwizycji; 64 °C, zatrzymanie 30 sekund, szybkość narastania 2,5 °C/s, pojedyncza akwizycja].</li>
		<li>Krzywa topnienia: 95 °C, 10 s, szybkość narastania 4,8 °C/s, bez akwizycji; 60 °C, 1 min, szybkość narastania 2,5 °C/s, bez akwizycji; 97 °C, szybkość narastania 0,1 °C/s, 5 akwizycji/°C (ciągła).</li>
		<li>Chłodzenie: 40 °C, 30 s, szybkość narastania 2,5 °C/s, bez akwizycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw Format wykrywania na "Zielony barwnik interkalacyjny" na karcie Definicja uruchamiania.</li>
	<li>Ustaw kontrolkę pipetowania na "Sterowanie główne" na karcie Run Definition (Definicja przebiegu). Ta funkcja służy jako kontrola wewnętrzna i wykrywa obecność głównej mieszanki qPCR w każdym dołku z 1,536 płytki wielodołkowej, co jest przydatne do identyfikacji przypuszczalnych wyników fałszywie ujemnych.</li>
	<li>Włóż płytkę wielodołkową 1536 przygotowaną w krokach 2-4 do przyrządu 1,536 qPCR i uruchom program.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Wykonaj oględziny danych w oprogramowaniu qPCR. 
	UWAGA: Oprogramowanie 1,536 umożliwia wizualizację zarówno krzywych wzmocnienia, jak i topnienia, a także mapę cieplną pokazującą wywołanie (dodatnie, ujemne, nieprawidłowe, nie dotyczy; Rysunek 2), wartość punktu przecięcia (przesuwająca się skala koloru dla dodatniego lub szary dla ujemnego; Rysunek 3) lub wartość fluorescencji punktu końcowego (EPF) (przesuwająca się skala kolorów).</li>
	<li>Eksport danych z oprogramowania 1,536 w postaci pliku .txt (tabela wyników) lub pliku .xml z danymi surowymi lub danymi obliczeniowymi do przetwarzania w trybie offline z urządzenia. 
	UWAGA: Opatentowany algorytm wywoływania automatycznego punktu przecięcia (Cp) wbudowany w oprogramowanie 1,536 bierze pod uwagę kształt i nachylenie krzywej amplifikacji, określając wywołania wartości dodatnich/ujemnych i Cp z dużą pewnością, przy niskich objętościach reakcji submikrolitrowych przy stosunkowo niskich wartościach fluorescencji.</li>
	<li>Jeśli do qPCR użyto LightCycler DNA Green Master, sprawdź, czy wszystkie studzienki przeszły "kontrolę główną". Niepowodzenie oznacza, że studnia nie otrzymała głównej mieszanki qPCR, a brakujący punkt danych należy uznać za potencjalny wynik fałszywie ujemny. Sprawdź, czy wszystkie studzienki przeszły "kontrolę główną". Niepowodzenie oznacza, że studnia nie otrzymała wzorcowego DNA i uważa brakujący punkt danych za potencjalny fałszywie ujemny.</li>
</ol>

<ol><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li>
<li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li>
<li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li>
<li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-A-Gene+with+GeneDesign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li>
<li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome%3A+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
</ol>

L.A.M., N.A.P., J.A.M. i J.D.B. nie mają nic do ujawnienia. R.C. i A.L. są zatrudnieni przez Roche Life Science w USA i pracowali nad opracowaniem aplikacji we współpracy z L.A.M. w ramach eksperymentu potwierdzającego słuszność zasady.

Włączenie wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do testu genotypowania PCRTag jest ważnym osiągnięciem dla projektu Sc2.0, ponieważ umożliwia znacznie większą przepustowość. Poprzedni przepływ pracy określał reakcje 2,5 μl w 384 dołkowych płytkach PCR, 1,5-godzinny czas trwania cykli termicznych, elektroforezę w żelu agarozowym i ręczną adnotację żelu.
Przedstawiony tutaj przepływ pracy, zwany analizą qPCRTag, pozwala przezwyciężyć kilka głównych wąskich gardeł. Po pierwsze, seria qPCRTag kondensuje 4 x 384 płytki dołkowe w pojedynczy eksperyment, który można przetworzyć od początku do końca (ustawienie płytki plus czas trwania) w ciągu około godziny. Należy zauważyć, że koszt odczynnika na studzienkę do analizy qPCRTag jest porównywalny z podejściem opartym na żelu agarozowym o niższej przepustowości. Jednak dzięki obejściu elektroforezy żelowej i ręcznej adnotacji, przepływ pracy qPCRTag zapewnia znaczne oszczędności czasu i pracy, co jest główną zaletą. Co ważne, przepływ pracy qPCRTag jest w pełni kompatybilny z automatyzacją.
Głównym problemem związanym z wykorzystaniem wykrywania w czasie rzeczywistym jako wyników testu PCRTag jest odsetek wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Ponieważ startery PCRTag nie zostały pierwotnie zaprojektowane do użytku w PCR w czasie rzeczywistym, oczekuje się, że nie wszystkie pary starterów będą odpowiednie do użycia z tym wyjściem. W tym celu ważne jest, aby z góry zweryfikować funkcję i swoistość wszystkich par starterów PCRTag, aby wykluczyć podzbiór, który nie działa w teście opartym na czasie rzeczywistym. Na przykład wyniki fałszywie dodatnie i ujemne PCRTag chromosomu 3 są w zasadzie odtwarzalne w danych PCR w czasie rzeczywistym (ryc. 2 i 3) i można je wykluczyć z dalszych analiz. Co więcej, pary starterów, o których wiadomo, że ulegają uszkodzeniu (oceniane za pomocą elektroforezy żelowej i pokazane na rysunkach S6 i S7 Annaluru i wsp.1) można również wykluczyć. Można to łatwo osiągnąć, po prostu wykluczając wadliwe pary starterów podczas ustawiania protokołu transferu akustycznego.
Podobnie jak w przypadku większości testów o wysokiej przepustowości, zamierzamy wykorzystać detekcję PCRTag w czasie rzeczywistym jako podstawowe badanie przesiewowe do identyfikacji transformantów, które zasługują na dalszą walidację. W związku z tym złotym standardem wtórnego badania przesiewowego pozostanie analiza PCRTag z elektroforezą żelową jako odczytem. Poza zastosowaniem analizy PCRTag dla Sc2.0, połączenie najnowocześniejszych nanoskalowych systemów obsługi cieczy z technologią Real Time PCR o wysokiej przepustowości umożliwia szybką i zautomatyzowaną analizę i może mieć wpływ na wiele dziedzin. Na przykład ten przepływ pracy można zastosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych bibliotek, diagnostyki chorób zakaźnych, analizy mikrobiomu i najnowocześniejszych podejść do edycji genomu próbujących jednocześnie modyfikować wiele loci.

Sc2.0, czyli Projekt Syntetycznego Genomu Drożdży (<a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a>), wyznaczył sobie cel zaprojektowania i zbudowania całkowicie syntetycznego genomu eukariotycznego. Wykorzystując jako punkt wyjścia starannie opracowaną sekwencję genomu Saccharomyces cerevisiae3, każdy z szesnastu liniowych chromosomów został zaprojektowany na nowo, aby spełnić zestaw zasad projektowych, które określają utrzymanie kondycji komórek, poprawę stabilności genomu oraz zwiększenie elastyczności genetycznej. Na przykład z chromosomów Sc2.0 usunięto elementy destabilizujące, takie jak powtórzenia. Wszystkie wystąpienia kodonów stop TAG zostały zakodowane na nowo jako TAA, aby „zwolnić” kodon w końcowym szczepie dla wprowadzenia aminokwasu niezakodowanego genetycznie. Dodatkowo indukowalny system ewolucji, SCRaMbLE, oparty na systemie Cre-lox, umożliwia bezprecedensową zdolność generowania genomów pochodnych o nowych strukturach4.
Kolejnym głównym elementem projektu genomu Sc2.0 jest wprowadzenie PCRTags, które służą jako znaki wodne DNA, umożliwiające śledzenie syntetycznego i naturalnego DNA. PCRTags to krótkie, przekodowane segmenty w ORF na chromosomach syntetycznych; podczas gdy sekwencje PCRTag różnią się na poziomie DNA między chromosomami syntetycznymi a naturalnymi, kodowane białka mają identyczną sekwencję aminokwasową, a tym samym, prawdopodobnie, taką samą funkcję. Sekwencje PCRTag są specjalnie zaprojektowane jako miejsca wiązania starterów, aby ułatwić selektywną amplifikację (Rycyna 1A). Projektowanie PCRTag jest realizowane przy użyciu algorytmu „most different” w programie GeneDesign5,6, co pozwala na uzyskanie przekodowanych sekwencji syntetycznych, które różnią się zazwyczaj o ~60% od sekwencji natywnych (minimum 33%), z temperaturami topnienia między 58 °C a 60 °C i długością amplikonów od 200-500 par zasad2. Przekodowanie nie jest dozwolone w obrębie pierwszych 100 bp każdego ORF, ponieważ wiadomo, że regiony te wykazują szczególne preferencje w zakresie użycia kodonów7. Wspólnie reguły projektowe te sprzyjają wysokiej wydajności niemal wszystkich PCRTags w ramach jednego zestawu warunków PCR, w których pary starterów PCRTag dla DNA syntetycznego i naturalnego wiążą i amplifikują wyłącznie odpowiednio DNA syntetyczne i natywne (Rycyna 1B).
<img alt="Proces edycji genów; porównanie WT i SYN ORF, wyniki PCRTag, analiza gDNA, schemat." src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat PCRTag. (A) PCRTagi to sekwencje zakodowane na nowo w obrębie otwartych ramek odczytu (ORF) genów na chromosomach Sc2.0. (B) Primery PCRTag dla wersji syntetycznej (SYN) i typu dzikiego (WT) wiążą się i amplifikują wyłącznie odpowiednio syntetyczne i dzikie genomowe DNA (gDNA). Przedstawiono tutaj analizę fragmentu o długości ~30 kb lewego ramienia chromosomu sześć, w której przetestowano trzynaście par primerów PCRTag, wykorzystując jako matrycę gDNA WT lub semi-synVIL2. W wielu przypadkach jedna ORF koduje więcej niż jeden PCRTag. Obecność lub brak amplikonów PCRTag ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wielkość amplikonów PCRTag mieści się w zakresie od 200 bp do 500 bp. Szybciej migrujące prążki na dole paneli to dimery primerów.
Analiza PCRTag okazała się istotnym narzędziem w procesie składania chromosomów Sc2.0. W typowym eksperymencie 30-50 kb syntetycznego DNA, kodującego 20-30 sekwencji PCRTag, wprowadza się do komórek drożdży w celu zastąpienia odpowiadającego im DNA typu dzikiego1,2,8. Następnie analiza PCRTag jest wykorzystywana do zidentyfikowania transformantów, które kodują syntetyczne, a nie dzikie sekwencje PCRTag obejmujące ten fragment DNA, tzw. „zwycięzców” (winners). Zazwyczaj konieczne jest przetestowanie wielu transformantów w celu zidentyfikowania „zwycięzców”, dlatego przepustowość i koszt analizy PCRTag są kluczowymi kwestiami. Obecnie ukończono dwa chromosomy Sc2.0 (synIII1 oraz synIXR2), co stanowi mniej niż 10% genomu Sc2.0, choć ponad połowa pozostałych chromosomów jest obecnie w trakcie syntezy i składania. Skala analizy PCRTag wymagana dla tego projektu szybko przerasta możliwości prowadzenia elektroforezy i ręcznego oceniania obecności syntetycznego DNA oraz braku DNA typu dzikiego.
Aby zwiększyć przepustowość testu PCRTag, opracowaliśmy schemat postępowania z wykorzystaniem PCR w czasie rzeczywistym, co pozwala uniknąć stosowania elektroforezy w żelu agarozowym. Procedura ta wykorzystuje dozownik cieczy do dużych objętości do rozdzielenia mastermixu qPCR do każdego dołka płytki 1536-dołkowej, nanoskaloowy akustyczny dozownik cieczy do przenoszenia matrycy DNA oraz starterów, a także termocykler qPCR 1536-dołkowy, co pozwala nam zminiaturyzować reakcje do 500 nl i zmaksymalizować przepustowość. Co więcej, analiza może zostać zautomatyzowana. Ten rodzaj protokołu genotypowania o wysokiej przepustowości powinien być możliwy do zastosowania w każdym projekcie wymagającym analizy wielu klonów w wielu loci.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Przygotowanie drożdży gDNA</td></tr><tr><td>drożdże niestandardowy</td><td></td><td>szablon gDNA do PCR w czasie rzeczywistym</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane płukane kwasem (0,5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>liza komórek drożdży</td></tr><tr><td>Ultraczysty fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>liza komórek drożdży</td></tr><tr><td>5432 Mieszalnik</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>liza komórek drożdży</td></tr><tr><td>Mikrowirówka 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>liza komórek drożdży</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometr</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>Kwantyfikacja gDNA</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA BR</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Kwantyfikacja gDNA</td></tr><tr><td>Płytka Labcyte 384PP</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>Płytka źródłowa gDNA</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix prep i dozowanie</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>real time PCR mastermix</td></tr><tr><td>1,5 ml Uchwyt na probówkę do mikrofuge</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>uchwyt na probówkę do mikrofugi do pokładu Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td><td></td><td></td> System obsługi cieczy Roche 5358639001 <td></td></tr><tr><td>Cobra</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>dozuje główną mieszankę qPCR do 1536 płytka</td></tr><tr><td>PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>cenzuracja 1536 plate</td></tr><tr><td colspan="4"> Dozowanie szablonów i</td></tr><tr><td>starterów PCRTag startery</td><td>IDT</td><td>niestandardowe</td><td>wstępnie zmieszane do przodu i do tyłu, 50 i mu; M każda</td></tr><tr><td>folia uszczelniająca przebijana TempPlate, sterylna</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>tymczasowe uszczelnienie do płytek starterowych PCRTag</td></tr><tr><td>Płytka dołkowa Labcyte LDV 384</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>wstępnie zmieszana płytka źródłowa startera</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>przenosi 2,5 nl kropli startera i matrycy DNA do płytki 1536</td></tr><tr><td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td><td>Agilent</td><td>Uszczelka termiczna G5402-90001</td><td>do płyty 1536 przed uruchomieniem LC1536</td></tr><tr><td>Przezroczysta uszczelka trwała</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>optycznie przezroczysta uszczelka termiczna do płytki wielodołkowej LC1536</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Stolik płytowy</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>może zastąpić podkładki o grubości ~2 mm</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>wirówka zgrzewana płyta 1536</td></tr><tr><td>Przemysłowa sprężarka powietrza</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>do uruchomienia Echo and Heat Sealer</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>wymaga gniazdka 220 V</td></tr></tbody></table>

analiza qpcrtag - wysokoprzepustowy test pcr w czasie rzeczywistym do genotypowania sc2.0

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Projekt Syntetycznego Genomu Drożdży (Sc2.0) ma na celu zbudowanie 16 designerskich chromosomów drożdży i połączenie ich w jedną komórkę drożdży. Do tej pory skonstruowano jeden syntetyczny chromosom, synIII1, i jedno ramię syntetycznego chromosomu, synIXR2, a ich działanie in vivo zostało potwierdzone przy braku odpowiadających im chromosomów typu dzikiego. Ważną cechą konstrukcyjną chromosomów Sc2.0 jest wprowadzenie PCRTags, które są krótkimi, przekodowanymi sekwencjami w otwartych ramkach odczytu (ORF), które umożliwiają różnicowanie syntetycznych chromosomów od ich odpowiedników typu dzikiego. Startery PCRTag wyżarzają się selektywnie do chromosomów syntetycznych lub dzikich, a obecność/brak każdego typu DNA można przetestować za pomocą prostego testu PCR. Standardowy odczyt testu PCRTag ma na celu ocenę obecności/braku amplikonów za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Jednak przy średniej gęstości amplikonów PCRTag wynoszącej jeden na 1,5 kb i rozmiarze genomu ~12 Mb, ukończony genom Sc2.0 zakoduje około 8,000 PCRTagów. Aby zwiększyć przepustowość, opracowaliśmy test wykrywania oparty na PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag, który nazywamy analizą qPCRTag. Przepływ pracy określa 500 reakcji nl na 1,536 płytce wielodołkowej, co pozwala nam przetestować do 768 PCRTags z parami starterów typu syntetycznego i dzikiego w jednym eksperymencie.

Przetestowano pary starterów PCRTag1 dla syntetycznego i dzikiego typu chromosomu 3 z wykorzystaniem genomowego DNA (gDNA) drożdży wyekstrahowanego z czterech różnych szczepów. Chromosom 3 posiada 186 par starterów PCRTag obejmujących całą długość chromosomu (synIII ma ok. 270 kb, a chromosom 3 typu dzikiego ok. 315 kb). Aby przetestować każdy z czterech szczepów przy użyciu obu zestawów starterów, podzielono płytkę wielodołkową na cztery kwadranty, po jednym dla każdego typu gDNA, przypisując syntetyczne startery PCRTag do górnej połowy każdego kwadrantu, a startery typu dzikiego do dolnej połowy. DNA genomowe wyekstrahowano ze szczepów drożdży, z których dwa kodują chromosom 3 typu dzikiego (typ dziki, synIXR2), natomiast pozostałe dwa kodują syntetyczny chromosom 3 (synIII1, synIII synIXR). Mieszaninę master mix do qPCR rozprowadzono do każdego dołka płytki wielodołkowej 1536 za pomocą dozownika cieczy masowych, a następnie dodano gDNA i startery PCRTag przy użyciu Echo 550. Startery rozmieszczono identycznie w każdym kwadrancie płytki wielodołkowej w celu ułatwienia porównania wizualnego. Płytkę wielodołkową uszczelniono termicznie za pomocą optycznie przejrzystej folii i poddano analizie PCR w czasie rzeczywistym.
W tym eksperymencie qPCRTag zaobserwowaliśmy w większości przypadków amplifikację zgodną z oczekiwaniami, w której primery syntetyczne amplifikowały wyłącznie DNA syntetyczne i vice versa (Rycina 2 oraz 3). Zaobserwowaliśmy jednak również kilka odchyleń od oczekiwanego wzorca, co sugeruje obecność wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich w zbiorze danych. W tym eksperymencie kontrola główna została wykryta w 100% studni, co wskazuje, że dozownik cieczy masowych pomyślnie rozprowadził mastermix do każdej studni na płytce (dane nie przedstawiono). Wyklucza to jedno z potencjalnych źródeł wyników fałszywie ujemnych. Dodatkowo wiadomo, że niektóre PCRTagi chromosomu 3 nie działają (pokazano na Rysunkach S6 i S7 w pracy Annaluru et al.1), w tym co najmniej 2 pary primerów SYN i 1 para WT; zatem studnie te można pominąć w każdym kwadrancie. Prawdziwe wyniki fałszywie ujemne mogłyby wynikać z braku przeniesienia matrycowego gDNA lub primerów, jednak w naszym doświadczeniu, przy prawidłowej kalibracji Echo 550 oraz przygotowaniu gDNA i primerów zgodnie z opisem, nie stanowiło to głównego źródła błędów. Ogólnie w tym eksperymencie wskaźnik wyników fałszywie ujemnych był niezwykle niski dla primerów WT z matrycą WT (~2%), choć nieco wyższy dla primerów SYN z DNA SYN (~8%).
Wyniki fałszywie dodatnie, czyli wykrycie sygnału w studzienkach, w których startery SYN są zmieszane z gDNA WT (i odwrotnie), mogą wynikać z amplifikacji krzyżowej lub powstawania dimerów starterów. Rzeczywiście, dimery starterów są często widoczne w elektroforezie żelowej (Rysunek 1B) i stanowią prawdopodobne źródło błędów. W przypadku zastosowania qPCR użyteczne może być badanie krzywych topnienia, aby określić, czy różne gatunki produktów, takie jak dimery starterów, mogą przyczyniać się do sygnału. Ponadto przeprowadzenie eksperymentu kontrolnego, w którym startery są dozowane wobec braku matrycowego DNA, może pomóc w zidentyfikowaniu starterów wykazujących tendencję do dimeryzacji. Amplifikację krzyżową można zaobserwować w elektroforezie żelowej, w szczególności jeśli przeprowadzono zbyt wiele cykli PCR lub jeśli temperatura przyłączania jest zbyt niska. Staraliśmy się zminimalizować liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z amplifikacji krzyżowej poprzez optymalizację obu tych parametrów dla protokołu qPCRTag. Wreszcie, analiza wartości punktu przecięcia (Cp) dla każdej studzienki może pomóc w zidentyfikowaniu starterów, które nie nadają się do detekcji w czasie rzeczywistym (Rysunek 3, np. Bb22, Fb22, Bb46, Fb46). Ogólnie w tym eksperymencie odsetek wyników fałszywie dodatnich był niski dla starterów SYN z matrycą WT (~5%) i wyższy dla starterów WT z matrycą SYN (~10%).
<img alt="Schemat macierzy wyników PCR pokazujący skuteczność starterów w próbkach DNA; zielony oznacza wynik dodatni, czerwony ujemny." src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mapa ciepła płytki przedstawiająca wyniki obecności/braku dla eksperymentu qPCRTag. Cztery różne typy genomowego DNA (kwadranty oddzielone ciągłymi białymi liniami) poddano analizie PCRTag z użyciem syntetycznych (SYN) oraz dzikiego typu (WT) starterów PCRTag dla chromosomu 3 (przerywane białe linie oddzielają SYN (góra) i WT (dół) w każdym kwadrancie). gDNA WT oraz synIXR kodują chromosom 3 typu dzikiego, co daje amplifikację z użyciem starterów PCRTag WT. gDNA synIII oraz synIII synIXR kodują syntetyczny chromosom 3, co daje amplifikację z użyciem starterów PCRTag SYN. Startery są ułożone zgodnie z ich pozycją na chromosomie od lewej do prawej i rozmieszczone identycznie w czterech kwadrantach w celu porównania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagram macierzowy przedstawiający wyniki amplifikacji DNA; analiza genetyczna synIII, synIXR." src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Mapa ciepła płytki przedstawiająca wartość punktu przecięcia (Cp) dla eksperymentu qPCRTag. Jest to ten sam zestaw danych, co na Rycini 2, zatem układ płytki jest identyczny. N/A oznacza „brak amplifikacji”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Ogólnym celem analizy QPCR TAG jest zwiększenie przepustowości testu genotypowania PCR TAG w projekcie syntetycznego genomu drożdży poprzez wdrożenie systemu detekcji opartego na PCR w czasie rzeczywistym oraz miniaturyzację reakcji. Osiąga się to najpierw poprzez zastosowanie dozownika cieczy do rozdzielenia mieszaniny QPCR master mix do każdego dołka płytki wielodołkowej 1536. Następnie robot do akustycznego wyrzutu kropel w nanoskali przenosi matrycę DNA oraz startery do dołków płytki wielodołkowej.Następnie płytkę uszczelniono i przeprowadzono reakcje w termocyklerze A-Q-P-C-R. Na koniec przeanalizowano dane z PCR w czasie rzeczywistym, aby określić obecność lub brak syntetycznych lub dzikich tagów PCR w każdym locus. Ostatecznie procedura z użyciem tagów QPCR zwiększa wydajność procesu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z obecnym testem PCR TAG jest możliwość uniknięcia elektroforezy żelowej oraz ręcznej adnotacji uzyskanych żeli. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę, jak czasochłonne i pracochłonne będzie znakowanie PCR w przypadku dłuższych chromosomów. Po wyhodowaniu i zebraniu około 2 milionów komórek drożdży, należy dodać 200 µL buforu do lizy drożdży i wypipetować w celu resuspensji.Do osadu dodać 300 µL kulek szklanych płukanych kwasem, tak aby znajdowały się około 1 mm poniżej poziomu komórek. Następnie w dygestorium dodać 200 µL fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego, odwrócić probówkę trzy razy w celu wymieszania i upewnić się, że zakrętka jest szczelnie zamknięta. Następnie, korzystając z mieszalnika laboratoryjnego, wstrząsać probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej; po odwirowaniu przenieść 75 µL fazy wodnej do nowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 mL 100% etanolu.Po ponownym wirowaniu odwróć probówkę 10 razy, aby wymieszać zawartość, odessaj nadosad nie naruszając osadu i użyj 500 µL 70% etanolu do przemycia osadu. Po usunięciu nadosadu użyj 75 µL 10 mM Tris pH 7.4 w celu resuspensji osadu i wymieszaj go za pomocą wortexa. Po rozcieńczeniu DNA w stosunku 1:10, nanieś 30 µL rozcieńczonego GDNA do odpowiedniej dołka płytki źródłowej przeznaczonej do nanoskalowego akustycznego dozowania cieczy.Przygotuj wcześniej 850 µL master mixu do QPCR w probówce mikroodwirowywanej o pojemności 1,5 mL i wymieszaj go za pomocą wortexa. Następnie odwiruj roztwór przy 20 800 ×g w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie, używając dozownika wielokanałowego, nanieś po 500 nL na każdą studzienkę płytki wielodołkowej 1536.Zgromadź mieszaninę reakcyjną qPCR na dnie każdej studzienki, krótko wirując płytkę. Następnie, korzystając z akustycznego systemu przenoszenia cieczy i szczegółów opisanych w protokole tekstowym, nanieś 5 nanolitrów rozcieńczonego GDNA oraz 10 nanolitrów 50 mikromolarnej gotowej mieszaniny starterów forward i reverse do wybranych studzienek płytki wielodołkowej. Technologia akustycznego przenoszenia kropli wykorzystuje fale dźwiękowe do pionowego przenoszenia małych objętości cieczy z płytki źródłowej na odwróconą płytkę docelową.W tym etapie matryca, DNA oraz primery są przenoszone w kroplach o objętości będącej wielokrotnością 2,5 nanoliter do dołków płytki wielodołkowej 1536 w celu przygotowania reakcji tagowania QPCR. Następnie należy niezwłocznie zamknąć płytkę 1536 za pomocą optycznie przezroczystej folii uszczelniającej i systemu do uszczelniania mikropłytek.Natychmiast odwiruj zamkniętą płytkę z prędkością 2000 G w temperaturze pokojowej przez trzy minuty, aby zebrać wszystkie odczynniki na dnie dołka, a następnie przeprowadź program PCR w czasie rzeczywistym w urządzeniu QPCR zgodnie z wytycznymi zawartymi w protokole tekstowym i po zakończeniu konfiguracji uruchom analizę. Zweryfikuj, czy wszystkie dołki przeszły kontrolę główną, co wskazuje na wykrycie master mixu QPCR w dołku. Każdy dołek, który nie przejdzie tej kontroli, stanowi potencjalny fałszywie ujemny punkt danych.Aby przeanalizować dane, należy przeprowadzić ich wizualną inspekcję w oprogramowaniu QPCR i/lub wyeksportować dane z urządzenia w celu ich późniejszego przetworzenia offline. W tym eksperymencie przetestowano pary starterów do PCR dla tagów dzikiego typu oraz syntetycznego chromosomu trzy, wykorzystując GDNA drożdży wyizolowane z czterech różnych szczepów: dwóch z chromosomem trzy typu dzikiego oraz dwóch kodujących chromosom syntetyczny.Trzy oczekiwane startery syntetyczne powieliły ogólnie syntetyczne DNA, a nie DNA typu dzikiego. Podobnie startery typu dzikiego wytworzyły amplikony wyłącznie z DNA typu dzikiego. Wystąpienie niewielkiej liczby wyników fałszywie dodatnich i ujemnych jest spodziewane, a możliwe źródła tych błędów opisano w towarzyszącym protokole tekstowym.Po opanowaniu tej techniki cały proces można przeprowadzić w około godzinę. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

W tym filmie opisujemy technikę topnienia PCR o wysokiej rozdzielczości, aby określić polimorfizm długości fragmentów DNA o różnych długościach sekwencji, na podstawie analizy temperatury topnienia.

PCR z topnieniem w wysokiej rozdzielczości w celu określenia zmian sekwencji w zmutowanych sekwencjach DNA

Ten film pokazuje użyteczność cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów w próbkach DNA. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na komory, które działają jako niezależne reakcje PCR, a wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych ze amplifikowanych celów w komorach służy do obliczenia częstotliwości wariantu allelu w próbce.

Cyfrowy PCR oparty na chip-in-a-tube do ilościowego oznaczania wariantów pojedynczych nukleotydów

Tutaj opisujemy metodę jednoczesnej kwantyfikacji okręgów wycinania receptora limfocytów T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji deklacyjnej K (KRECs). Test TREC/KREC może być stosowany jako marker wydalania grasicy i szpiku kostnego.

Jednoczesna kwantyfikacja kręgów wycinania receptora komórek T (TREC) i kręgów wycinania rekombinacji z delecją K (KREC) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest użytecznym narzędziem do bardzo czułego wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów i wariantów liczby kopii DNA. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe zagadnienia dotyczące pomiaru rzadkich wariantów w ludzkim genomie za pomocą cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube.

Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube

Ten artykuł szczegółowo opisuje użycie zestawu do przygotowania biblioteki opartej na reakcji łańcuchowej polimerazy zakotwiczonej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji, do oceny fuzji genów onkogennych w klinicznych próbkach guzów litych. Opisano zarówno etapy mokrej ławki, jak i analizy danych.

Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Protokół ten zapewnia metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania podczas mejozy u Caenorhabditis elegans. Do określenia pochodzenia chromosomów wykorzystano genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Mapowanie 4-punktowe pozwoliło określić rozkłady krzyżowe regionów lewego, środkowego i prawego ramienia każdego chromosomu. ...

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę qPCRTag do szybkiego genotypowania chromosomów syntetycznych Saccharomyces cerevisiae bez elektroforezy żelowej. Technika zwiększa przepustowość badań genomowych dzięki miniaturyzacji reakcji PCR.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

Przeglądaj więcej filmów