Name: Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę syntezy magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza. Technika ta umożliwia zatrzymywanie komórek w przepływie hemodynamicznym i oferuje mniej inwazyjną alternatywę w leczeniu tętniaków mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Departament Obrony na podstawie umowy nr W81XWH-11-2-0067

1. Przygotowanie bakteryjnej nanocelulozy (BNC)
Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w warunkach aseptycznych, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną.
	<ol>
		<li>Przygotuj 500 ml płynnej pożywki hodowlanej, łącząc 25 g ekstraktu drożdżowego, 15 g peptonu, 125,0 g mannitolu i 500 ml wody o wysokiej czystości. Mieszaninę tę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj 100 ml pożywki półstałej, dodając 15 g agaru do 5,0 g ekstraktu drożdżowego, 3,0 g peptonu, 25,0 g mannitolu i 100 ml wody o wysokiej czystości. Mieszaninę tę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut. Po sterylizacji w autoklawie umieścić 5 ml mieszaniny na plastikowej szalce Petriego o wymiarach 90 mm x 16 mm. Pozostawić roztwór do zżelowania w temperaturze 4 °C i przechowywać w tej temperaturze do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie uwodnić szczep G. xylinus zakonserwowany w liofilizowanych fiolkach, dodając 1 ml płynnej pożywki hodowlanej i pipetując w górę iw dół, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zaszczepić szalki Petriego zawierające półstałe podłoża małymi kropelkami zawiesiny bakteryjnej za pomocą pętli zaszczepiającej. Upewnij się, że inokulum pokrywa całą szalkę Petriego, przesuwając pętlę w kierunku zygzakowatym od krawędzi do środka szalki.</li>
	<li>Inkubować szalki Petriego w temperaturze 26 °C przez 72 godziny w inkubatorze bez CO2 . Po zakończeniu okresu inkubacji widoczne są małe białe kolonie. Jeżeli kolonie nie zostaną natychmiast wykorzystane, należy przechowywać szalki Petriego w temperaturze 4 °C, zamykając pokrywkę Parafilmem i umieszczając szalki do góry nogami. Rodziny rodzinne mogą być przechowywane w ten sposób do 6 miesięcy.</li>
	<li>Przenieść 2 ml płynnej pożywki hodowlanej przygotowanej w kroku (1.1.1) do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Pobrać dwie kolonie z igłą do zaszczepiania z zaszczepionych szalek Petriego w kroku (1.3) i umieścić je w pierwszym dołku płytki do hodowli tkankowej. Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych 23 dołków.</li>
	<li>Inkubować płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 30 °C przez 7 dni. Otrzymamy w ten sposób łącznie 24 błonki BNC o średnicy 16 mm i grubości około 2-3 mm średnicy, jak pokazano na rysunku 1. 
	Uwaga: Nie należy naruszać kultury bakteryjnej w żadnym momencie okresu inkubacji, na przykład poprzez potrząsanie płytkami. W okresie inkubacji G. xylinus wytłacza cząsteczki cukru glukopiranozy, tworząc polimerową krystaliczną siatkę na granicy faz powietrze-ciecz, która przyjmuje kształt i rozmiar kolby w warunkach uprawy statycznej. Ta polimerowa matryca, znana jako bakteryjna nanoceluloza (BNC), rzuca się w oczy pod koniec okresu inkubacji.</li>
	<li>Zebrać błonki BNC z pożywki wzrostowej i sterylizować je w 200 ml 1% roztworu NaOH przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C, w celu usunięcia wszelkich śladów G. xylinus. Opcjonalnie mieszać ten roztwór z prędkością 300 obr./min za pomocą pręta magnetycznego i płytki mieszającej. Odrzucić roztwór NaOH i dodać 200 ml świeżo przygotowanego 1% roztworu NaOH. Powtórz ten sam proces jeszcze raz lub do momentu, gdy błonki BNC w roztworze uzyskają półprzezroczysty wygląd.</li>
	<li>Opłucz błonki BNC wodą trzy razy i przechowuj je w wodzie o wysokiej czystości w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że błonki BNC są całkowicie zanurzone w wodzie i nie mogą wyschnąć w żadnym momencie.</li>
	<li>Autoklawować błonki BNC w temperaturze 121 °C przez 20 min. 
	Uwaga: Badanie podskórne in vivo na szczurach przeprowadzone przez Märtsona i współpracowników wykazało objawy braku degradacji BNC po 60 tygodniach implantacji. Rzeczywiście, BNC jest z natury degradowalny przez enzymy mikrobiologiczne i grzybowe, których nie ma u ssaków. Z drugiej strony, biodegradowalność BNC może być wynikiem procesów mechanicznych, chemicznych i biologicznych, które osłabiają sieć mikrofibryli in vivo4.</li>
</ol>
2. Synteza nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polimerem i ich osadzanie w bakteryjnej membranie nanocelulozowej
<ol>
	<li>Spłucz 1,000 ml wody o wysokiej czystości azotem gazowym w celu usunięcia rozpuszczonego tlenu z wody i zastąpienia go azotem.</li>
	<li>Za pomocą kolby okrągłodennej z trzema szyjkami przygotować roztwór sześciowodnego chlorku żelaza(III) (FeCl3·6H2O) i czterowodnego chlorku żelaza(II) (FeCl2·4H2O) rozcieńczony odtlenioną wodą o wysokiej czystości w stosunku molowym. Na przykład użyj 5,4 g FeCl3·6H2O i 1,98 g FeCl2·4H2O w 10 ml odtlenionej wody o wysokiej czystości. Jeśli ten preparat okaże się zbyt lepki i trudny do wymieszania, należy użyć 0,54 g FeCl3·6H2O i 0,198 g FeCl2·4H2O w 20 ml odtlenionej wody o wysokiej czystości. 
	Uwaga: Skróć czas ekspozycji FeCl2·4H2O na powietrze, ważąc ten związek chemiczny tak szybko, jak to możliwe. Po wprowadzeniu do kolby okrągłodennej z trzema szyjkami zamknąć kolbę okrągłodenną z trzema szyjkami korkami do przegrody, aż zostanie podłączona do dopływu azotu i rurki skraplacza.</li>
	<li>Użyj dwóch szyjek naczynia, aby zapewnić stałe wejście i wyjście azotu gazowego, podłączając dopływ azotu do igły wbitej w korek przegrody i przymocowanej do szyjki naczynia.</li>
	<li>Umieść 1 błonkę BNC, która została przygotowana wcześniej w kroku 1.5 (15,6 mm średnicy i 2-3 mm grubości) w naczyniu z reagentami. Upewnij się, że próbka jest całkowicie zanurzona w cieczy.</li>
	<li>Podłącz pozostałą szyjkę naczynia do rurki skraplacza. Dodatkowo użyj rurki suszącej wypełnionej bezwodnym siarczanem wapnia na górze rurki skraplacza. Przepuść wodę przez rurkę skraplacza.</li>
	<li>Uszczelnij wszystkie szklane połączenia smarem próżniowym.</li>
	<li>Podgrzać roztwór w kąpieli oleju silikonowego do temperatury 80 °C za pomocą mieszającej płyty grzejnej i utrzymać tę temperaturę do kroku 2.10. Użyj małego mieszadła magnetycznego, aby mieszać reagenty z prędkością 350 obr./min przez 5 minut. Upewnij się, że BNC jest odpowiednio nasycony roztworem żelaza, a reagenty są całkowicie rozpuszczone. Mieszaj mieszaninę do końca eksperymentu. 
	Uwaga: Użyj termometru, aby sprawdzić temperaturę oleju silikonowego. Powinien być stabilny do 80 °C.</li>
	<li>Zwiększyć prędkość mieszania do 700 obr./min i dodać (przez upuszczenie), w odstępie 5 minut, 5 ml wodorotlenku amonu (NH4OH, 14%) do 10 ml roztworu żelaza za pomocą igły do pipetowania, która została również wbita w korek do przegrody brzusznej. Po dodaniu wodorotlenku amonu barwa roztworu zmienia się z żółto-pomarańczowej na czarną.</li>
	<li>Kontynuować mieszanie roztworu w temperaturze 80 °C przez kolejne 5 minut. Unikać mieszania z dużą prędkością w celu zachowania integralności próbki. Wysokie prędkości, tj. wyższe niż 1 000 obr./min, mogą zniszczyć próbkę.</li>
	<li>Obniżyć temperaturę roztworu do 30 °C za pomocą regulatora temperatury na dnie mieszadła i mieszać przez kolejne 5 minut. Następnie wyłącz płytę grzejną. W tym momencie IONP zostały włączone do siatki BNC.</li>
	<li>Schłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej i oddzielić nanocząstki magnetyczne (MNP) i BNC za pomocą silnego magnesu trwałego (np. 1 Tesla). W tym celu należy przenieść mieszaninę do kolby naczyniowej, a następnie, trzymając magnes blisko naczynia, przytrzymać MNP i BNC na miejscu, jednocześnie dekantując supernatant. 
	Uwaga: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z silnymi magnesami, ponieważ mogą one być szkodliwe, jeśli są używane nieprawidłowo. Dla stopni (2.12)-(2.14) i (2.16) należy użyć odtlenionej wody o wysokiej czystości przygotowanej wcześniej w (2.1), aby zapobiec utlenianiu cząstek.</li>
	<li>Zawiesić MNP i BNC w 100 ml wody. Delikatnie wstrząśnij roztworem, aby usunąć wszystkie MNP, które nie są silnie wbudowane w BNC. Ponownie zdekantować supernatant, przytrzymując MNP i BNC na miejscu za pomocą magnesu.</li>
	<li>Przemyć MNP i BNC kilkakrotnie wodą, aż supernatant osiągnie neutralne pH (pH ~ 7), mierzone za pomocą paska kolorymetrycznego.</li>
	<li>Oddziel funkcjonalizowany magnetycznie BNC lub magnetyczną nanocelulozę bakteryjną (MBNC) od MNP za pomocą pęsety i spłucz MBNC kilka razy wodą, aż woda będzie czysta.</li>
	<li>Wysterylizuj MBNC, wystawiając MBNC O/N na działanie promieniowania UV (110-280 nm).</li>
	<li>Umieścić w autoklawie 500 ml odtlenionej wody o wysokiej czystości w temperaturze 120 °C przez 20 minut i przechowywać MBNC w 20 ml tej wody.</li>
	<li>W aseptyce zanurzyć próbkę w 1% PEG i mieszać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (37 °C). Procedura ta poprawia biokompatybilność i stabilność nanocząstek tlenku żelaza osadzonych w BNC, w szczególności tych odsłoniętych na powierzchni5-7. Powłoka PEG będzie rozprowadzana w sieci MBNC 3D. 
	Uwaga: Nagie IONP łatwo utleniają się w powietrzu ze względu na ich wysoką aktywność chemiczną8. Mimo że PEG jest uważany za materiał nieulegający biodegradacji, jego stabilność chemiczna zależy od zastosowanych warunków biologicznych, takich jak zawartość wody, pH, temperatura, obecność enzymów, reaktywne formy tlenu, reaktywne formy azotu i inne9.</li>
</ol>
3. Charakterystyka błonek BNC i MBNC
<ol>
	<li>Właściwości mechaniczne
	<ol>
		<li>Wykonaj normalny test nanotwardości przy użyciu wgłębnika Berkovicha. Promień wgłębnika diamentowego Berkovich wynosi 20 nm.</li>
		<li>Użyj stopionej krzemionki i wolframu do kalibracji obszaru styku w funkcji głębokości wgłębienia w temperaturze pokojowej. Podczas badania zamontuj próbki na wgłębieniu za pomocą kleju. Wgłębnik zbliżył się do próbek w kierunku swojej grubości.</li>
		<li>Losowo wybieraj miejsca wcięć na powierzchniach próbek. Zachowaj odstęp między 2 wcięciami w zakresie 200-300 mm.</li>
		<li>Obciążenie należy przykładać do próbek w krokach i zapisywać odpowiednie przemieszczenie wgłębnika. Przeanalizuj wykres obciążenia w funkcji głębokości, aby znaleźć moduł Younga.</li>
		<li>Przeprowadzić test nanotwardości próbek w obecności wody dejonizowanej (woda DI) i przeprowadzić test, stosując prędkości obciążenia w zakresie od 0,0001 mN/s do 0,005 mN/s, przy obciążeniu szczytowym w zakresie od 0,01 mN do 0,60 mN.</li>
		<li>Użyj kuwety cieczowej i przechowuj próbki w środowisku cieczy. Ten unikalny zestaw do charakterystyki nanomechanicznej zanurzonej w płynnym środowisku jest idealny do skutecznej symulacji zasięgu funkcji biomechanicznej membran BNC i MBNC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka strukturalna metodą SEM
	<ol>
		<li>Scharakteryzuj strukturę włókien nanocelulozowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).</li>
		<li>Liofilizować próbki przez 24 godziny w temperaturze -80 °C. Następnie zamontuj na kołkach SEM, napyl folią Au-Pd przez 10 sekund i przeanalizuj za pomocą SEM.</li>
		<li>Wykonuje zdjęcia w powiększeniu 22 000X i 60 000X, z napięciem przyspieszenia 5 kV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Domeny magnetyczne
	<ol>
		<li>Pozostaw błonki MBNC do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej, a następnie wystawij na działanie magnesu trwałego (1 Tesla) przez 5 minut.</li>
		<li>Natychmiast należy przeprowadzić pomiary siły magnetycznej za pomocą bio-AFM zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Dla każdego pomiaru należy najpierw uchwycić cechy topograficzne i uzyskać domeny magnetyczne podczas drugiego przejścia. Oba pomiary należy wykonać za pomocą bio-AFM w trybie bezkontaktowym.</li>
		<li>Charakterystykę magnetyczną nanocząstek przeprowadza się za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM) w systemie pomiarów właściwości fizycznych (PPMS) firmy Quantum Design, przy RT (300 K), przy polu magnetycznym w zakresie od -10 000 do 10 000 Oe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytokompatybilność
	<ol>
		<li>Wysiewać ludzkie komórki mięśni gładkich aorty (HASMC) na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o gęstości 1,0x103 komórek/cm2 i inkubować przez 24 godziny w obecności badanych próbek: błonek BNC i MBNC (każda o średnicy 15,6 mm).</li>
		<li>Należy użyć populacji komórek nieleczonych i poddanych działaniu nadtlenku wodoru jako odpowiednio kontroli negatywnej i pozytywnej.</li>
		<li>Wykonaj test Comet zgodnie z protokołami producenta i wytycznymi sugerowanymi przez A. Azqueta i A.R. Collins10.</li>
		<li>W tym teście należy użyć barwnika kwasu nukleinowego SYBR Gold do interkalacji i fluorescencyjnego znakowania DNA zawartego w próbkach poddanych elektroforezji zgodnie z protokołem producenta. 
		Uwaga: Komórki, które nie ulegną żadnemu uszkodzeniu DNA w obecności próbek BNC i MBNC, będą miały fluorescencyjny okrągły zielony nukleoid, podczas gdy komórki uszkodzone przez DNA będą miały długie komety - próbki dodatnie będą miały nukleoidy (głowa komety), a następnie warkocze, które zawierają pofragmentowany materiał DNA (procent DNA w ogonie).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxena%2C+IM+%22Bacterial+Nanocellulose%3A+A+Sophisticated+Multifunctional+Material%22">Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material</a>. , 1-18 (2012).</li>
<li>Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+control+of+vascular+smooth+muscle+cell+morphology+and+phenotype+for+functional+tissue-engineered+small-diameter+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomed.Mater.Res.A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels.</a> J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).</li>
<li>Barud, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocellulose-based+flexible+magnetic+paper%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Biocellulose-based flexible magnetic paper.</a> J. Appl. Phys. 117, (2015).</li>
<li>Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+cellulose+sponge+degradable+or+stable+as+implantation+material%3F+An+in+vivo+subcutaneous+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat.</a> Biomaterials. 20, 1989(1999).</li>
<li>Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+carboxylated+PEG-coating+on+magnetite+nanoparticles+designed+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Magn.+Mater%22%5BJournal%5D)">Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications.</a> J. Magn. Magn. Mater. 380, 132(2015).</li>
<li>Torrisi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+corona+effects%3A+multiphosphonic+acid+poly%28ethylene+glycol%29+copolymers+for+stable+stealth+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles.</a> Biomacromolecules. 15, 3171(2014).</li>
<li>Cai, Z., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cellulose%2Fpoly%28ethylene+glycol%29+composite%3A+characterization+and+first+evaluation+of+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose%22%5BJournal%5D)">Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility.</a> Cellulose. 17, 83(2010).</li>
<li>Wu, W., He, Q., Jiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+iron+oxide+nanoparticles%3A+synthesis+and+surface+functionalization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res.+Lett%22%5BJournal%5D)">Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies.</a> Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).</li>
<li>Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+biodegradability+of+polyethylene+glycol%2C+polypeptoids+and+poly+%282-oxazoline%29s%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s.</a> Biomaterials. 35, 4848(2014).</li>
<li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+comet+assay%3A+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li>
<li>Scherner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+application+of+tissue-engineered+blood+vessels+of+bacterial+cellulose+as+small+arterial+substitutes%3A+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept.</a> J. Surg. Res. 189, 340(2014).</li>
<li>Bodin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cultivation+conditions+on+mechanical+and+morphological+properties+of+bacterial+cellulose+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 425(2007).</li>
<li>Zaborowska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bacterial+cellulose+as+a+potential+scaffold+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 6, 2540(2010).</li>
<li>Karimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+mechanical+properties+of+the+umbilical+vein+and+umbilical+artery+under+uniaxial+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Artery+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading.</a> Artery Res. 8, 51(2014).</li>
<li>Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+bacterial+nanocellulose-based+uniform+wound+dressing+for+large+area+skin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995(2013).</li>
<li>Olsson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+flexible+magnetic+aerogels+and+stiff+magnetic+nanopaper+using+cellulose+nanofibrils+as+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates.</a> Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).</li>
<li>Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force+microscopy+and+energy+loss+imaging+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Grubością i wielkością błonki BNC można łatwo manipulować, zmieniając czas inkubacji i wielkość kolby, w której jest ona hodowana podczas uprawy statycznej. Mikrowłaściwości BNC, takie jak porowatość, mogą być modyfikowane poprzez zmianę stosunku tlenu w kulturze statycznej. Wyższe stężenia tlenu dają twardszy BNC11. A. Bodin i współpracownicy wyprodukowali probówki z BNC o ciśnieniu rozrywającym do 880 mm Hg poprzez zmianę stosunku tlenu z atmosferycznego do 100% tlenu podczas procesu fermentacji G. xylin...

Bakteryjna nanoceluloza (BNC) jest syntetyzowana przez szczep Acetobacter xylinum, znany również jako Gluconacetobacter xylinus, i osadza się w postaci folii lub błonek na granicy powietrze-ciecz podczas hodowli stacjonarnej. Te błonki BNC przyjmują formę pojemnika, w którym są uprawiane, a ich grubość zależy od liczby dni w hodowli. A. xylinus wykorzystuje glukozę w pożywce do syntezy mikrowłókien celulozy w procesie polimeryzacji, a następnie krystalizacji. Polimeryzacja reszt glukozy odbywa się na bakteryjnej błonie zewnątrzkomórkowej, gdzie łańcuchy glukanu są wytłaczane z pojedynczych porów rozmieszczonych na otoczce komórkowej. Krystalizacja mikrowłókien celulozy zachodzi w przestrzeni zewnątrzkomórkowej z tworzeniem arkuszy łańcuchowych glukanu przez wiązanie van der Waalsa, a następnie układanie arkuszy przez wiązanie H1.
Magnetyczne nanocząstki zintegrowane z matrycą BNC mogą być łatwo manipulowane przez zewnętrzne pole magnetyczne w celu zwiększenia siły niezbędnej do kierowania i ograniczania komórek mięśni gładkich (SMC) zawierających nanocząstki magnetyczne, w miejscu uszkodzenia ściany tętnicy. Ta strategia utrzymuje SMC z dala od innych tkanek i utrzymuje komórki w miejscu przed siłą wywieraną przez przepływ krwi. Wykazano, że SMC odgrywają ważną rolę w wazoelastyczności naczynia krwionośnego, gdzie tworzą obfite warstwy zlokalizowane głównie w osłonce środkowej2.
Metoda używana do syntezy MBNC polega na zanurzeniu i zmieszaniu błonki BNC w roztworze sześciowodnego chlorku żelaza(III) i czterowodnego chlorku żelaza(II) w temperaturze 80 °C. Wodorotlenek amonu jest dodawany w celu utworzenia nanocząstek tlenku żelaza wewnątrz siatki BNC. Dodanie wodorotlenku amonu zmienia kolor roztworu z pomarańczowego na. IONP zagęszczają się razem wzdłuż włókienek BNC o nierównomiernym rozdziale.
Ten protokół skupia się na projektowaniu bakteryjnej nanocelulozowo-magnetycznej błonki nanocząsteczkowej, którą nazwaliśmy magnetyczną bakteryjną nanocelulozą (MBNC), która jest przeznaczona do użycia jako substytut brakujących, uszkodzonych lub uszkodzonych naczyń krwionośnych o małej średnicy. H. S. Barud i współpracownicy opublikowali niedawno podobną pracę, aby stworzyć elastyczny papier magnetyczny na bazie BNC poprzez mieszanie błonek BNC w stabilnej wodnej dyspersji PEG i superparamagnetycznego tlenku żelaza Nanocząstki 3. W tym miejscu opisujemy produkcję celulozy bakteryjnej i jej impregnację in situ nanocząstkami magnetycznymi. Test cytotoksyczności oparty na wykrywaniu pęknięć pojedynczej nici DNA wykorzystano do zbadania biokompatybilności błonek BNC i MBNC.

<table><tbody><tr><td>Glucoacetobacter xylinus</td><td>ATCC</td><td>700178</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol Bioxtra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Pepton bakteriologiczny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, 50% roztwór w wodzie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza(III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6665-46</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy), średnia Mn 400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202398-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Czterowodny chlorek żelaza (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa szalka Petriego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR452000</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa pętla do zaszczepiania</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-604&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny siarczan wapnia</td><td>W.A. Hammond Drierite&nbsp;</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjna igła pipetująca z końcami 90&stopniowymi</td> Paski testowe <td>pH Sigma Aldrich</td><td>CAD7937-12EA</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4786-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Kolba destylacyjna z okrągłym dnem i kątownikiem z trzema szyjkami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4965250</td><td></td></tr><tr><td>Olej silikonowy do kąpieli olejowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85409-250ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do suszenia</td><td>Chemglass</td><td>CG-1295-01</td><td></td></tr><tr><td>Korek przegrody brzusznej, typ rękawa</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-98</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Chemglass</td><td>CG-2001-05</td><td></td></tr><tr><td>Skraplacz</td><td>Chemglass</td><td>CG-1218-01</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>BriskHeat</td><td>SDC120JC-A</td><td></td></tr><tr><td>Płyta</td> <td>grzejna do mieszaniaFisher Scientific</td><td>11-100-49SH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Comet</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Złoty żel kwasu nukleinowego Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>bio-AFM</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard 4a BioScience AFM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoindenter</td><td>Micro Materials Ltd</td><td>Wielomodułowy tester mechaniczny&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)</td><td>Hitachi High Technologies America</td><td>Hitachi S-4800</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

W tym badaniu, bakteryjna nanoceluloza (BNC) wytwarzana przez bakterię Gluconacetobacter xylinus jest syntetyzowana i impregnowana in situ nanocząstkami tlenku żelaza (IONP) (Fe3O4) w celu uzyskania magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej (MBNC). Synteza MBNC jest precyzyjnym i specjalnie zaprojektowanym procesem wieloetapowym. Krótko mówiąc, błonki bakteryjnej nanocelulozy (BNC) są formowane z zachowanego szczepu G. xylinus zgodnie z naszymi eksperymentalnymi wymaganiami dotyczącymi wielkości i morfologii. Roztwór sześciowodnego chlorku żelaza(III) (FeCl3·6H2O) i czterowodnego chlorku żelaza(II) (FeCl2·4H2O) o stosunku molowym 2:1 przygotowuje się i rozcieńcza w odtlenionej wodzie o wysokiej czystości. Następnie do naczynia z reagentami wprowadza się błonkę BNC. Mieszaninę tę miesza się i podgrzewa w temperaturze 80 °C w kąpieli oleju krzemowego, a następnie dodaje się wodorotlenek amonu (14%) przez upuszczenie w celu wytrącenia jonów żelazawych w siatce BNC. Ten ostatni etap umożliwia tworzenie in situ nanocząstek magnetytu (Fe3O4) wewnątrz bakteryjnej siatki nanocelulozowej w celu nadania właściwości magnetycznych błonce BNC. Zastosowano test toksykologiczny w celu oceny biokompatybilności błonki BNC-IONP. Glikol polietylenowy (PEG) został użyty do pokrycia IONP w celu poprawy ich biokompatybilności. Obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wykazały, że IONP były zlokalizowane preferencyjnie w przestrzeniach przeplatających się włókienkami matrycy BNC, ale niektóre z nich znaleziono również wzdłuż wstęg BNC. Pomiary mikroskopem sił magnetycznych przeprowadzone na MBNC wykryły obecność domen magnetycznych o wysokim i słabym natężeniu pola magnetycznego, potwierdzając magnetyczny charakter błonki MBNC. Wartości modułu Younga uzyskane w tej pracy są również w rozsądnej zgodności z wartościami zgłoszonymi dla kilku naczyń krwionośnych w poprzednich badaniach.

Okres inkubacji G. xylinus trwał łącznie 9 dni, jednak błony zaczęły formować się wcześniej i były widoczne po około 2 dniach. Makroskopowy wygląd BNC przedstawiono na Rysunku 1, którego kształt odpowiada kształtowi hodowli w szalce. Rysunek 2 opisuje proces wytwarzania błon BNC-IONP, podsumowując główne etapy protokołu opisanego powyżej, a także konfigurację głównych komponentów.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia magnetycznej bakteryjnej nanocelulozy (BNC) do zastosowań w rekonstrukcji uszkodzonych naczyń krwionośnych. BNC został zsyntetyzowany przez szczep G. xylinus. Z drugiej strony, namagnesowanie BNC zostało zrealizowane poprzez wytrącanie in situ jonów żelazawychFe2+ i Fe3+ wewnątrz siatki BNC.

Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza bakteryjnej nanocelulozy (BNC) oraz nadanie jej właściwości magnetycznych poprzez impregnację in situ nanocząsteczkami tlenku żelaza. Magnetyczne membrany BNC zostały zaprojektowane w celu lokalnego przyciągania i zatrzymywania namagnesowanych komórek przeciwko przepływowi hemodynamicznemu. Główną zaletą magnetycznej BNC syntetyzowanej w tej procedurze jest fakt, że umożliwia ona małoinwazyjne leczenie w pobliżu tętniaków mózgu.Konwencjonalne metody leczenia tętniaków mózgu, takie jak klipsowanie oraz embolizacja rdzenia nerwowego i naczyniowego, są inwazyjne i traumatyczne, przez co nie nadają się dla większości pacjentów z grup zwiększonego ryzyka. Zastosowanie tej techniki rozszerza się na terapię chorób naczyniowych, ponieważ przeszczepy naczyniowe wykonane z rusztowań magnetycznych mogą przyspieszać gojenie poprzez poprawę retencji komórek w miejscu uszkodzenia. Rozpocznij procedurę od przygotowania płynnej pożywki hodowlanej zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przenieś 2 ml ciekłego pożywki hodowlanej do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej. Za pomocą igły do szczepień pobierz dwie kolonie z zaszczepionych szalek Petri

fabrication-functionalized-magnetic-bacterial-nanocellulose-with-iron

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Arias, S. L. i in. Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstek tlenku żelaza. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje syntezę nanocząsteczek magnetytu in situ w bakteryjnej nanocelulozowej pelikule produkowanej przez Gluconacetobacter xylinus. Wyjaśnia, jak magnetyczna nanoceluloza bakteryjna powstaje poprzez infuzję jonów żelaza, wytrącanie alkaliczne oraz oczyszczanie.

Generowanie bakterialnych nanocelulozowych pelikuli osadzonych w magnetycie

Źródło: Arias, S. L. i in. Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstek tlenku żelaza.  J. Vis. Exp. (2016).Ten film demonstruje produkcję nanocelulozy poprzez hodowlę bakterii produkujących celulozę w medium odżywczym zawierającym mannitol. Bakterie metabolizują mannitol do glukozy, która następnie jest polimeryzowana i wytłaczona jako łańcuchy glukanowe, krystalizujące się w arkusze celulozy, tworząc trójwymiarową macierz na styku powietrze–ciecz.

Przygotowanie bakteryjnych pelikuli nanocelulozy z bakterii produkujących celulozę

Ukierunkowane dostarczanie komórek jest przydatne w różnych zastosowaniach biomedycznych.  Celem tego protokołu jest wykorzystanie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) do znakowania komórek, a tym samym umożliwienie podejścia do magnetycznego celowania w komórki w celu uzyskania wysokiego stopnia kontroli nad dostarczaniem i lokalizacją komórek.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Przedstawiono protokół syntezy i kationizacji magnetoferytyny domieszkowanej kobaltem, a także metodę szybkiego magnesowania komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny.

Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

W tej pracy opisujemy protokół wytwarzania nanodrutów żelaza, w tym tworzenie porowatej membrany z tlenku glinu, która jest używana jako szablon, elektroosadzanie do szablonów za pomocą roztworu elektrolitu i uwalnianie nanodrutów do roztworu.

Wytwarzanie nanodrutów żelaza za pomocą nanoporowatego anodowanego aluminium i jego charakterystyka

Ta praca opisuje protokoły przygotowania nanocząstek magnetycznych, ich powlekania SiO2, następnie funkcjonalizacji aminy (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES) i jej koniugacji z deferoksaminą przy użyciu ugrupowania sukcynylu jako łącznika. Szczegółowo opisano również szczegółowy opis charakterystyki strukturalnej i test wychwytywania bakterii z użyciem Y. enterocolitica dla wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu.

Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii

Nanocząstki tlenku żelaza są syntetyzowane za pomocą niewodnego żelu zolowego i pokrywane anionowymi krótkimi cząsteczkami lub polimerem. Zastosowanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji i biotransformacji nanocząstek magnetycznych wewnątrz ludzkich komórek macierzystych wykazano za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM).

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Ta praca przedstawia oddolne podejście do inżynierii lokalnych sił magnetycznych do kontroli organizacji neuronów. Komórki podobne do neuronów załadowane nanocząstkami magnetycznymi (MNP) są powlekane na wierzchu i kontrolowane przez platformę o mikrowzorze z prostopadłym namagnesowaniem. Opisano również charakterystykę magnetyczną, wychwyt komórkowy MNP, żywotność komórek i analizę statystyczną.

Wytwarzanie platform magnetycznych do organizacji połączonych neuronów w skali mikronowej

Ten protokół podkreśla metodę szybkiej oceny biokompatybilności krystalicznego tuszu biomateriałowego z nanocelulozy (CNC)/agarozy z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy pod względem żywotności komórek i fenotypowej ekspresji receptorów powierzchniowych komórki, Kit (CD117) i receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI).

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj metodę syntezy magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza. Technika ta umożliwia zatrzymywanie komórek w przepływie hemodynamicznym i oferuje mniej inwazyjną alternatywę w leczeniu tętniaków mózgu.

Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza

Przeglądaj więcej filmów