Name: Metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metody wkraplania i utrwalania płuc myszy w badaniach nad rakiem. Techniki te obejmują intubację, instalację komórek nowotworowych oraz pomiar objętości płuc. Protokoły umożliwiają precyzyjną analizę patologii w modelach zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Poniższy protokół opisuje system, który działa dobrze u myszy o wadze 20–35 g. Metodę można łatwo dostosować do większych lub mniejszych myszy, po prostu zmieniając rozmiar cewnika. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Wkraplanie do płuc
<ol>
	<li>Wybierz komercyjną kaniulę dożylną o długości jednego cala i długości 20 g, która zostanie użyta do intubacji.</li>
	<li>Zmodyfikuj końcówkę cewnika, zginając ją ręcznie, aby uzyskać lekką krzywiznę na końcówce, jak pokazano na rysunku 1.</li>
	<li>Znieczulić mysz mieszaniną ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (15 mg/kg) wstrzykniętym IP i potwierdzić znieczulenie przez brak ruchu odruchowego. Bezpośrednio po znieczuleniu nałóż maść weterynaryjną na oczy. Natychmiast po znieczuleniu nałóż maść weterynaryjną na oczy i podaj karprofen (5-10 mg/kg m.c.) na znieczulenie pooperacyjne i wkroplone.</li>
	<li>Umieść mysz na wznak na pochyłej platformie. Jak pokazano na rysunku 2, duży segregator biurowy z przyklejonymi pętlami do szwów działa doskonale.</li>
	<li>Ogol brzuszną część szyi oraz oczyść i zdezynfekuj okolice szyi 70% alkoholem. W nowych rękawiczkach lateksowych i bezpudrowych używaj narzędzi chirurgicznych zdezynfekowanych 70% alkoholem.</li>
	<li>Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj małe nacięcie chirurgiczne na szyi około 12 mm poniżej dolnego siekacza.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie pociągnij skórę na szyi doogonowo, aż będzie widać brzuszną ścianę tchawicy.</li>
	<li>Delikatnie cofnij język i włóż kaniulę z wygiętą końcówką pochyloną w kierunku brzusznej powierzchni myszy. Podobnie jak w ppkt 1.4, delikatnie pociągnąć za skórę na szyi i wprowadzić kaniulę do tchawicy. 
	UWAGA: Przy odrobinie wprawy cewnik będzie widoczny przesuwający się w dół tchawicy. Jeśli trafi do przełyku, nie będzie wizualnej obserwacji ruchu cewnika. W tchawicy nie wykonuje się żadnych nacięć.</li>
	<li>Gdy cewnik jest widoczny w tchawicy na szyi, przesuń go o około 5 mm, aby niezawodnie przeszedł przez struny głosowe, ale nadal znacznie powyżej carina.</li>
	<li>Przygotować się do wkroplenia do 50 μl płynu, wstrzykując go przez cewnik za pomocą końcówki pipety z żelem. Umieść końcówkę w piaście typu luer, ale przed wstrzyknięciem uważnie obserwuj ruch płynu w końcówce synchronicznie z oddechem myszy. Następnie wstrzyknąć zakroplony płyn.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml natychmiast wykonaj stosunkowo szybkie napompowanie 0,6 ml powietrza do płuc przez cewnik, aby pomóc rozprowadzić płyn głęboko w płucach. Wyjmij kaniulę.</li>
	<li>Wyjmij kaniulę. </li>
	<li>Użyj niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego, aby zamknąć małą ranę pooperacyjną zgodnie z instrukcją dołączoną do opakowania VetBond. Umieść myszy w indywidualnych klatkach i monitoruj je wizualnie, dopóki się nie obudzą i nie będą zachowywać się normalnie bez żadnych oznak dyskomfortu.</li>
</ol>
2. Unieruchomienie płuc
UWAGA: Gdy wszystkie procedury eksperymentalne zostaną wykonane na myszy, płuca mogą być przygotowane do przetwarzania histologicznego poprzez utrwalenie formaldehydem (lub innym pożądanym utrwalaczem).
<ol>
	<li>Poświęć mysz za pomocą procedury akceptowalnej przez IACUC. W przypadku reprezentatywnej myszy pokazanej na filmie stosuje się zwichnięcie szyjki macicy znieczulonej myszy.</li>
	<li>Wykonaj tracheostomię (jeśli jeszcze tego nie zrobiono), chirurgicznie odsłaniając brzuszną stronę tchawicy, wykonując małe nacięcie i wkładając końcówkę igły 18 G do tchawicy i wiążąc ją nitką.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz klatkę piersiową z nacięciem w linii środkowej, odetnij przeponę i usuń boczne ściany klatki piersiowej, aby odsłonić płuca.</li>
	<li>Podłączyć końcówkę typu luer igły do zbiornika na stojaku pierścieniowym zawierającym formaldehyd. Zobacz rysunek 3.</li>
	<li>Ustaw górną powierzchnię formaldehydu 25 cm powyżej poziomu myszy. Zobacz rysunek 3. Następnie upewnij się, że w rurce mocującej nie ma powietrza, wypuszczając płyn z końca kurka. Podłącz końcówkę typu luer kaniuli tchawicy do rurki zbiornika. Otwórz kurek, aby napompować płuca formaldehydem. Pozostaw płuca pod ciśnieniem przez co najmniej 20 minut.</li>
	<li>Otwórz kurek, aby napompować płuca formaldehydem. Pozostaw płuca pod ciśnieniem przez co najmniej 20 minut.</li>
	<li>Następnie zwiąż tchawicę poza końcem igły. Pomocne może być powolne odciąganie igły, aby odsłonić więcej niekaniulowanej tchawicy. Po bezpiecznym związaniu wyjmij kurek.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj płuca.</li>
	<li>Umieść płuca w formaldehydzie na noc. Dłuższe czasy są w porządku, a niektóre plamy lub procedury mogą określać określone czasy. Również wszelkie inne płynne utrwalacze, takie jak z-fix, mogą być używane do wkraplania i zanurzania.</li>
	<li>Przed dalszym przetwarzaniem histologicznym należy zmierzyć stałą objętość płuc zgodnie z opisem poniżej.</li>
</ol>
3. Pomiar stałej objętości płuc
<ol>
	<li>Zmierz objętość płuc za pomocą zasady Archimedesa, jak pokazano na rysunku 4. Usunąć nieruchome płuco z formaldehydu i wyciąć serce oraz wszelką inną tkankę niepłucną.</li>
	<li>Użyj wcześniej skonstruowanego, prostego, domowego urządzenia podtrzymującego drut, które służy do utrzymywania płuc całkowicie pod wodą. 
	UWAGA: To urządzenie musi być kompatybilne z dowolną używaną wagą. Typowe urządzenie pokazane na rysunku 5 składa się z plastikowych pipet i cienkiego (20 G) drutu. System ten dobrze współpracuje z wagą używaną na filmie, ale można go łatwo dostosować do większości wag laboratoryjnych.</li>
	<li>Umieścić zlewkę z ≈200 ml wody na wadze i wytarować z klatką podtrzymującą w wodzie. Zobacz rysunek 6. Wyjmij metalową klatkę; Umieść płuco na powierzchni wody i wciśnij klatkę pod wodę.</li>
	<li>Zapisz masę na wadze. Liczba ta odzwierciedla objętość wypartej wody, a zatem jest bezpośrednią miarą objętości płuc. Należy uważać, aby płuco, szew lub jakakolwiek część drucianej klatki nie dotykała boków ani dna zlewki.</li>
	<li>Aby uzyskać dokładność, powtórz ten pomiar. Wyjmij płuco z wody i osusz na chusteczce. Ponownie wytarować zlewkę z umieszczoną klatką i powtórzyć pomiar objętości płuc. Następnie należy uśrednić oba pomiary objętości. 
	UWAGA: Jeśli płuca pozostaną w formalinie dłużej niż około tygodnia, powietrze w płucach zostanie rozpuszczone w płynie. Kiedy tak się stanie, płuco zapadnie się, więc nie jest już konieczne używanie żadnego urządzenia, jak na rysunku 5, aby utrzymać płuco zanurzone. W takim przypadku objętość można zmierzyć, po prostu przytrzymując płuco za jeden ze sznurków szwowych, aż zostanie całkowicie zanurzone, jak pokazano na rysunku 4.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li>
<li>Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cellular+profile+and+lung+function+with+repeated+bronchoalveolar+lavage+in+individual+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice.</a> Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).</li>
<li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation%3A+description%2C+evaluation+and+comparison+with+transillumination%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).</li>
<li>Spoelstra, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+simple+method+for+endotracheal+intubation+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory%22%5BJournal%5D)">A novel and simple method for endotracheal intubation of mice.</a> Laboratory. 41, 128-135 (2007).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retrograde+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">A technique for retrograde intubation in mice.</a> Lab animal. 35, 39-42 (2006).</li>
<li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).</li>
<li>Vergari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+review+for+medical+and+pharmacological+sciences%22%5BJournal%5D)">A new method of orotracheal intubation in mice.</a> European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).</li>
<li>Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-assisted+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Video-assisted orotracheal intubation in mice.</a> Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).</li>
<li>Hastings, R. H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Laryngoscopy+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li>
<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li>
<li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).</li>
<li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601(2013).</li>
<li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li>
<li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li>
<li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+10%25+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Reveiw+of+Respiratory+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li>
<li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549(2006).</li>
<li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li>
</ol>

Opisane tutaj procedury mają kilka zalet. Po pierwsze, wymagany sprzęt jest prosty i niedrogi. Po drugie, intubację można wykonać szybko z niewielką liczbą błędów. Po trzecie, zdolność do unieruchomienia płuc pod stałym ciśnieniem, a następnie zmierzenia ustalonej objętości płuc pozwala na prawidłowe określenie ilościowe struktur lub komórek w płucach10.
Jednym z możliwych minusów intubacji jest drobna operacja. Może to ograniczyć możliwość powtórzenia procedury, jeśli wymagane jest...

Z wielu powodów, rak płuc nie był szeroko badany na myszach. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest to, że dostęp do płuc in vivo jest bardzo utrudniony, a analiza ilościowa nieruchomych płuc nie jest powszechnie wykonywana. Metody opisane w tym artykule mają na celu zaradzenie tej sytuacji. Celem niniejszego artykułu jest opisanie prostych metod, które znacznie pomogą w konfiguracji i analizie płuc myszy z rakiem płuc lub innymi patologiami. Chociaż żadne z tych podejść nie jest całkowicie nowe, nie zostały one przedstawione razem jako samodzielne metody w uproszczony sposób, jak opisano tutaj.
Było wiele manuskryptów, które opisywały metody intubacji płuc myszy, głównie w celu powtórzenia czynności płucnej lub płukania oskrzelowo-pęcherzykowego u pojedynczych myszy w badaniach podłużnych. Od czasu tego oryginalnego artykułu pojawiło się kilka innych artykułów, które opisywały różne podejścia do intubacji myszy 1-9. Chociaż wszystkie te metody mogą być z powodzeniem stosowane, zwykle wymagają znacznego szkolenia i często nie są pozbawione nietrywialnej awaryjności. Ponadto, aby przeprowadzić pomiary czynności płuc, kaniula musi być na tyle ciasno dopasowana do tchawicy, aby nie było przecieku powietrza. Jednak innym praktycznym zastosowaniem intubacji jest dostarczanie określonych czynników (komórek rakowych lub innych zniewag) lub leków terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Taka procedura nie wymaga ściśle przylegającej kaniuli ani żadnego wyrafinowanego sprzętu do czynności płuc. Nowatorska cecha tej metody pokazana tutaj polega na drobnym zabiegu chirurgicznym, który umożliwia intubację bez możliwości wejścia kaniuli do przełyku. To proste podejście umożliwia udaną intubację przy stosunkowo niewielkim przeszkoleniu lub doświadczeniu. Przy użyciu tego podejścia można leczyć nawet 30 myszy/godz., a wskaźnik niepowodzeń zbliża się do zera.
Gdy myszy są gotowe do złożenia w ofierze, uszkodzone lub rakowe płuca mogą zostać usunięte do analizy histologicznej i patologicznej. Jednakże, aby prawidłowo określić ilościowo wszelkie zmienne histologiczne w celu porównania z innymi płucami, niezbędna jest standaryzacja procedur fiksacji i prawidłowe określenie ilościowe stałej objętości płuc10. W tym artykule szczegółowo opisano proste procedury, które umożliwiają ustandaryzowane procedury stabilizacji, a także sposób pomiaru stałej objętości płuc. Objętość jest istotną metryką w kwantyfikacji histologii, ponieważ bez takiego określenia objętości można zmierzyć tylko gęstości względne10. Jednak gdy objętość płuc jest znana, można określić ilościowo bezwzględne pomiary komórek i inne pomiary strukturalne w płucach.

<table><tbody><tr><td>Waga laboratoryjna</td><td>Ohaus</td><td>Adventurer Pro Model AV 313&nbsp;</td><td>Można używać innych wag, jeśli mają zakres 1-300 g</td></tr><tr><td>Cewnik dożylny 20 g Luer</td><td>Insylte</td><td></td><td>Kilku innych możliwych dostawców, np. ,</td></tr><tr><td>Butelka laboratoryjna</td> Jelco Optiva 500 ml <td>Różne Kilku</td><td></td><td>innych możliwych dostawców</td></tr></tbody></table>

metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc myszy

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Możliwość bezpośredniego wstrzykiwania żywych czynników, komórek lub substancji chemicznych do płuc bez ranienia lub zabijania myszy jest ważnym narzędziem w badaniach nad rakiem płuc. Chociaż istnieje wiele opublikowanych metod pokazujących, jak intubować myszy w celu pomiaru funkcji płuc, żadna z nich nie jest pozbawiona potencjalnych problemów z szybkim wkraplaniem tchawicy w dużych kohortach myszy. W niniejszej pracy opisano prostą i szybką metodę, która umożliwia badaczowi przeprowadzenie takich wkropleń w sposób efektywny. Metoda nie wymaga żadnych specjalnych narzędzi ani oświetlenia i można się jej nauczyć przy bardzo niewielkiej praktyce. Polega na znieczuleniu myszy, wykonaniu małego nacięcia na szyi w celu uwidocznienia tchawicy, a następnie bezpośrednim wprowadzeniu cewnika dożylnego. Małe nacięcie jest szybko zamykane klejem tkankowym, a myszy mogą dojść do siebie. Wykwalifikowany uczeń lub technik może wykonywać wpaplanie średnio 2 minuty na mysz. Po ustaleniu nowotworu często zachodzi potrzeba ilościowej analizy histologicznej płuc. Tradycyjnie patolodzy zwykle nie zawracają sobie głowy standaryzacją inflacji płuc podczas fiksacji, a analizy często opierają się na systemie punktacji, który może być dość subiektywny. Chociaż czasami może to być wystarczające do oszacowania wielkości guza płuca, każda właściwa stereologiczna kwantyfikacja struktury płuc lub komórek wymaga powtarzalnej procedury utrwalania, a następnie pomiaru objętości płuc. Tutaj opisujemy proste, niezawodne procedury zarówno mocowania płuc pod ciśnieniem, jak i dokładnego pomiaru ustalonej objętości płuc. Jedynym wymogiem jest waga laboratoryjna, która jest dokładna w zakresie od 1 mg do 300 g. Przedstawione tutaj procedury mogą zatem znacznie poprawić zdolność do tworzenia, leczenia i analizowania raka płuc u myszy.

Procedura opisana w pierwszym protokole sama w sobie nie prowadzi do żadnych uogólnionych wyników. Opisuje ona jedynie bardzo niezawodny sposób wprowadzania substancji bezpośrednio do tchawicy. Rysunek 7 przedstawia przykład płuca, do którego wprowadzono błękit trypanu metodą opisaną w niniejszej pracy. Widoczny jest rozległy rozkład barwnika, podobny do tego, który obserwowano w przypadku innych barwników lub znaczników podawanych bezpośrednio do tchawicy myszy11,12. Metodę tę wykorzystaliśmy...

Celem tego artykułu jest opisanie prostych metod, które znacznie pomogą w konfiguracji i analizie płuc myszy z rakiem płuc lub innymi patologiami. Przedstawiamy 3 protokoły do prostego i niezawodnego przeprowadzania wkraplania płuc, stabilizacji i pomiarów objętości płuc.

Metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc myszy

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

Ogólnym celem przedstawionej tutaj procedury jest zademonstrowanie prostych metod, które znacznie pomogą w przygotowaniu i analizie myszy z rakiem płuc lub innymi patologiami płuc. Pierwszą z nich jest metoda bezpośredniego wprowadzania komórek nowotworowych lub preparatów chemicznych do płuc. Następnie opisano utrwalanie pośmiertne oraz pomiary objętości płuc.Jest to realizowane poprzez uprzednią intubację myszy za pomocą lekko zmodyfikowanej kaniuli dożylnej. Następnie interesowany płyn jest podawany przez kaniulę do płuca. Następnie, po zakończeniu wszystkich eksperymentów in vivo i śmierci myszy.Płuca są połączone z zbiornikiem do fiksacji. W końcowym etapie płuca są preparowane, a następnie mierzona jest ich objętość. Ostatecznie możliwe jest porównanie morfologii ilościowej utrwalonej tkanki płucnej pomiędzy eksperymentalnymi próbkami płuc.Główną zaletą tej nowej techniki implantacji w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że w przypadku naszej metody istnieje niemal zerowe ryzyko błędnego wprowadzenia kaniuli do tchawicy. Procedura utrwalania płuc pod stałym ciśnieniem jest prosta i pozwala na uzyskanie spójnej fiksacji w różnych płucach. Wreszcie, metoda pomiaru objętości utrwalonego płuca myszy umożliwia właściwą normalizację w celu kwantyfikacji komórek płucnych i elementów strukturalnych.Zastosuj tę metodę, aby zapewnić bezpośrednie podanie leku lub innego badanego środka do płuca oraz dokładny i precyzyjny pomiar płuca. Przed rozpoczęciem procedury należy ręcznie wygiąć końcówkę komercyjnej kaniuli dożylnej o długości jednej cala i rozmiarze 20 G w lekki łuk.Następnie, po potwierdzeniu znieczulenia poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy, nałożyć maść do oczu dorosłej myszy i unieruchomić ją w pozycji grzbietowej na pochyłej platformie za pomocą dużego segregatora biurowego i pętli chirurgicznych. Ogolić brzuszną część szyi i zdezynfekować skórę 70% alkoholem. Następnie, używając ostrych nożyczek, wykonać niewielkie nacięcie chirurgiczne na szyi, około 12 milimetrów poniżej dolnego siekacza.Następnie za pomocą pęsety delikatnie odciągnij skórę w okolicy szyi, aż stanie się widoczna brzuszna ściana tchawicy. Następnie ostrożnie odsunie język i wprowadź kaniulę z zagiętą końcówką, skierowaną w stronę brzusznej powierzchni myszy. Ponownie delikatnie odciągnij skórę szyi, tak jak właśnie zaprezentowano.Wprowadź kaniulę do tchawicy, gdy cewnik będzie widoczny w świetle tchawicy, a następnie przesuń cewnik o około pięć milimetrów, aby przejść przez struny głosowe. Teraz umieść końcówkę pipety do nakładania żelu, zawierającej 50 µL preparatu, w łączniku cewnika. Potwierdź, że ruch cieczy w końcówce pipety jest zsynchronizowany z oddechem myszy.Następnie wstrzyknij preparat za pomocą jednofazowej strzykawki o pojemności 1 ml. Natychmiast napompuj płuca 0,6 ml powietrza przez cewnik, aby pomóc w rozprowadzeniu cieczy i pogłębieniu oddechu w płucach. Następnie usuń kaniulę.Zamknij ranę chirurgiczną, stosując niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego, a następnie umieść mysz w indywidualnej klatce i monitoruj jej stan do czasu pełnego powrotu do zdrowia. Po ostatnim punkcie czasowym eksperymentu wykonaj niewielkie nacięcie w okolicy szyi zwierzęcia, aby odsłonić brzuszną stronę tchawicy. Następnie wprowadź do tchawicy końcówkę kikutowej igły o rozmiarze 18 G.Za pomocą nici przywiąż igłę do tchawicy i ostrożnie otwórz klatkę piersiową, wykonując nacięcie w linii środkowej. Następnie odetnij przeponę i usuń boczne ściany klatki piersiowej, aby odsłonić płuca. W następnej kolejności upewnij się, że w przewodach do fiksacji nie ma powietrza, wypuszczając formaldehyd przez koniec kurka.Następnie podłącz wężyki doprowadzające formalinę i z rezerwuaru bezpośrednio do końcówki kaniuli igły tracheotomijnej. Ustaw górną powierzchnię formaliny na wysokość 25 centymetrów powyżej poziomu pyska i otwórz kurek, aby wypełnić płuca utrwalaczem. Po pozostawieniu płuc pod ciśnieniem przez co najmniej 20 minut, powoli wycofaj igłę, aby odsłonić większą część niekaniulowanej tchawicy, jednocześnie wiążąc tchawicę za końcem pozostawionego fragmentu igły.Po pewnym powiązaniu tchawicy należy usunąć kurek i ostrożnie wypreparować płuca. Następnie płuca należy umieścić w formaldehydzie na noc. Tutaj przedstawiono typowe urządzenie do stabilizacji płuc podczas wyznaczania stałej objętości płuc, wykonane z plastikowych pipet i cienkiego drutu 20 gauge; służy ono do uprzedniego pomiaru stałej objętości płuc, a następnie do wycięcia serca oraz każdej innej tkanki niepłucnej z płuc.Następnie ustaw na wadze zlewkę zawierającą około 200 milliliters wody, wyposażoną w drucianą podpórkę, i przeprowadź taryzację urządzenia. Następnie zdejmij podpórkę. Połóż płuco na powierzchni wody i użyj urządzenia, aby docisnąć tkankę pod powierzchnię wody.Upewniając się, że szew płucny lub jakakolwiek część urządzenia nie dotyka ścianek ani dna zlewki, odczytaj wagę na wadze. Wartość ta odzwierciedla objętość wypartej wody i stanowi zatem bezpośredni pomiar objętości płuc. Następnie osusz płuca za pomocą ręcznika papierowego, ponownie zanurz zlewka z urządzeniem i powtórz pomiar objętości płuc.Następnie należy wyciągnąć średnią z tych dwóch pomiarów objętości. Przedstawiono przykład płuca, do którego wprowadzono błękit trypanowy w sposób zaprezentowany powyżej. Należy zwrócić uwagę na szeroki rozkład barwnika, podobny do tego, który zaobserwowano w przypadku innych znaczników barwnikowych podawanych bezpośrednio do tchawicy myszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność przy wprowadzaniu kaniuli i trzymać jej końcówkę stroną brzuszzną do góry.Opisane tutaj techniki są przydatne w badaniach nad rakiem płuc, ale można je również zastosować w większości innych modeli chorób płuc u myszy.

instillation-and-fixation-methods-useful-in-mouse-lung-cancer-research

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Instylacje wewnątrzkrtaniowe pozwalają na dostarczanie substancji bezpośrednio do płuc. Procedura ta umożliwia wprowadzenie instylatu do dystalnych obszarów płuc, dlatego jest często stosowana w badaniach nad pęcherzykami pęcherzykowymi. Przedstawiamy szczegółowy protokół dla zwierząt przeżywalnych dotyczący wykonywania instylacji wewnątrzkrtaniowych u myszy.

Bezpośrednia instylacja substancji rozpuszczonych do tchawicy myszy w celu podania do płuc

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Ten film opisuje metodę wszczepiania komórek gruczolakoraka płuc w płucach myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych za pomocą środka wywołującego zwłóknienie - bleomycyny. Metoda ta znacznie usprawnia ortotopowe wszczepianie komórek raka płuc do płuc...

Wszczepienie gruczolakoraka: metoda wszczepiania komórek rakowych do płuc myszy

Ten film opisuje prostą i niezawodną metodę wprowadzania płynu do tchawicy w celu wkroplenia płuc, utrwalenia i pomiaru objętości płuc.

Wkraplanie i utrwalanie płuc: wprowadzanie płynu do tchawicy i mocowanie płuc w celu zmierzenia ustalonej objętości płuc

Ten artykuł opisuje szybką i efektywną metodę intubacji myszy do pomiarów funkcji płuc lub wkraplania płuc, która pozwala myszom na regenerację i badanie w późniejszym czasie.  Zabieg polega na niedrogim światłowodowym źródle światła, które bezpośrednio oświetla tchawicę.

Prosta metoda intubacji płuc myszy

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.

Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Celem tej metody jest przedstawienie prostej i efektywnej metody perfuzji, napełniania i utrwalania płuc myszy w celu zbadania patologii guza płuc i oceny przerzutów do płuc.

Perfuzja i inflacja płuca myszy w celu histologii guza

Prezentujemy metodę modelu patogenezy grzybów, która zachowuje naturalne położenie zarodników grzybów w drogach oddechowych płuc do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Poznaj metody wkraplania i utrwalania płuc myszy w badaniach nad rakiem. Techniki te obejmują intubację, instalację komórek nowotworowych oraz pomiar objętości płuc. Protokoły umożliwiają precyzyjną analizę patologii w modelach zwierzęcych.

Metody wkraplania i utrwalania przydatne w badaniach nad rakiem płuc myszy

Przeglądaj więcej filmów