Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce
August 4th, 2015
Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.
Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesny pomiar receptora podobnego do i wiązania oraz obserwacja indukowanej przez wiązanie sygnalizacji wapniowej na pojedynczej komórce. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie biotyny i dostosowanie osmolarności ludzkich czerwonych krwinek lub erytrocytów, aby wykorzystać je jako ultraczuły przetwornik siły. Drugim krokiem jest funkcjonalizacja szklanych kulek w mikroskali, która obejmuje czyszczenie, dylatację i powlekanie ligandem.
Następnie limfocyty T są izolowane i inkubowane z barwnikiem wapnia mniej niż do godziny 2:00, co umożliwia obserwację wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia. Ostatnim krokiem jest przygotowanie mikropipet w komorze doświadczalnej, które są specjalnie wymagane do konfiguracji eksperymentu. Ostatecznie fluorescencyjna sonda siły błony biologicznej lub technika BFP służy do pokazania przyczepności komórki do kulki pokrytej ligandem, pomiaru kinetyki wiązania liganda receptora, a tymczasem monitorowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia.
Technika ta jest przydatna w zrozumieniu, w jaki sposób siła mechaniczna jest wyczuwana przez limfocyty T poprzez rozpoznawanie androgenów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że FBIP może jednocześnie mierzyć kinetykę wiązania liganda receptora i sygnalizację wewnątrzkomórkową. Trudne części tego protokołu obejmują ręczne wytwarzanie ścieżek mikro pep o odpowiednich średnicach, zbieranie komórek i pszczół za pomocą mikro PEP oraz montaż sondy siły, która na początku może ulec awarii, chociaż nie mógł być tutaj na demonstracji tego filmu.
Współautor Arnold G, który niedawno obronił doktorat w moim laboratorium, znacząco przyczynił się do wstępnej walidacji protokołu FBAP. Uzyskać od 8 do 10 mikrolitrów krwi z nakłucia palca i dodać do jednego mililitra wodorowęglanu węglanowego, strumień buforowy opuścić wir lub odkręcić mieszaninę pipetą i odwirować przez jedną minutę w temperaturze 900 G. Odrzucić supernatant przed wykonaniem buforu węglanowego. Umyj jeszcze raz.
Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów powstałego RBC, pakuj 171 mikrolitrów buforu węglanowego wodorowęglanu i 1049 mikrolitrów biotyny. Roztwór łącznika PEG NHS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Stosując te same procedury mycia, przed przepłukaniem powstałej mieszaniny RBC raz buforem wodorowęglanowym węglanowym, a następnie dwukrotnie buforem N dwa 5%.
Następnie rozcieńczyć nystatynę w N dwa 5% bufor. Aby uzyskać końcowe stężenie 40 mikrolitrów na mililitr, wymieszaj pięć mikrolitrów biotynylowanych RBC z 71,4 mikrolitrami roztworu nystatyny i inkubuj przez godzinę w temperaturze zero stopni Celsjusza. Na koniec umyj próbki dwukrotnie buforem N dwa 5% i przechowuj biotynylowane RBC z N dwoma 5% buforem plus 0,5% BSA w lodówce, zamontuj jeden kawałek trzycalowej mikropipety na ściągaczu mikropipet.
Kliknij przycisk pociągania, aby środek kapilary został podgrzany przez maszynę, a kapilara została pociągnięta na dwóch końcach, aby utworzyć dwie kapilary z ostrymi końcówkami, które są surowymi pipetami. Następnie zamontuj surową pipetę na uchwycie na pipetę mikropipety Kuź ciepło, aby stopić szklaną kulę na kuźni. Włóż końcówkę surowej pipety do szklanej kuli.
Ostudź szklaną kulę i pociągnij surową pipetę, aby rozbić ją od zewnątrz, pozostawiając końcówkę wewnątrz kuli. Powtarzaj tę procedurę, aż uzyskasz pożądany otwór końcówki, aby zbudować komorę komórkową, najpierw przyciąć do 40 milimetrów na 22 milimetry na 0,2 milimetra szkiełka nakrywkowego za pomocą noża do szkła na dwa kawałki o wymiarach 40 milimetrów na 11 milimetrów na 0,2 milimetra. Komora celi zbudowana jest na fundamencie domowej roboty uchwytu komory składającego się z dwóch kawałków metalowych kwadratów i uchwytu, który je ze sobą łączy.
Za pomocą wdzięku przyklej jedno szkiełko nakrywkowe do dolnej strony uchwytu komory w taki sposób, aby łączyło dwa metalowe kwadraty. Podobnie przyklej drugi szkiełko nakrywkowe do górnej strony, które utworzy równoległą komorę komórek szkiełka nakrywkowego. Następnie za pomocą pipety wstrzyknąć 200 mikrolitrów eksperymentalnego buforu pomiędzy dwa szkiełka nakrywkowe.
Upewnij się, że bufor jest przymocowany do obu szkiełek nakrywkowych. Delikatnie obróć i potrząśnij komorą, aby bufor dotknął obu końców komory. Następnie ostrożnie wstrzyknąć olej mineralny po obu stronach komory, otaczając eksperymentalną strefę buforową, uszczelniając w ten sposób bufor od otwartego powietrza.
Wstrzyknij zawiesiny prob. Koraliki to bcs i cele odpowiednio w górnym, środkowym i dolnym obszarze strefy buforowej. Aby rozpocząć eksperyment BFP, włącz mikroskop i źródło światła.
Umieść komorę na głównym stoliku mikroskopu. Następnym krokiem jest zainstalowanie wszystkich trzech mikropipet BFP. Sonda po lewej stronie ma na celu złapanie RBC.
Celem po prawej stronie jest złapanie komórki, a pomocnik po prawej stronie służy do złapania koralika do zainstalowania, użyj mikrowtryskiwacza, aby wypełnić mikro pipetę eksperymentalnym buforem. Zdejmij mikropipetę z uchwytu na pipety i przytrzymaj ją w niższym miejscu, aby płyn mógł kapać z końcówki. Szybko włóż mikropipetę do końcówki uchwytu, upewniając się, że do mikropipety nie dostały się pęcherzyki powietrza.
Podczas wkładania dokręć uchwytu, a następnie zamontuj każdy uchwyt pipety na odpowiednim mikromanipulatorze. Popchnij mikropipetę w kierunku komory, tak aby jej końcówki weszły w obszar buforowy komory. Dostosuj położenie mikropipety i znajdź je w polu widzenia mikroskopu.
Poruszaj się po etapie uchwytu komory, aby znaleźć kolonie trzech żywiołów. Jeden po drugim dostosuj położenie odpowiedniej mikropipety, obracając pokrętła manipulatorów, aby końcówka mikropipety zbliżyła się do jednej komórki lub kulki, zassać komórkę lub kulkę. Regulując ciśnienie wewnątrz odpowiedniej mikropipety, wszystkie trzy mikropipety wychwytują odpowiadające im elementy.
Poruszaj się po stoliku z uchwytem komory, aby znaleźć otwartą przestrzeń z dala od kolonii wstrzykniętych elementów, w których zostanie przeprowadzony eksperyment. Przełącz tryb wizualny mikroskopu, aby zobrazować obraz w programie komputerowym. Przesuń wszystkie trzy elementy na końcówkach pipet w pole widzenia programu.
Następnie wyrównaj koralik sondy i RBC i ostrożnie manewruj koralikiem sondy do wierzchołka RBC. Teraz krótko uderz koralik w RBC i delikatnie cofnij, wyreguluj ciśnienie mikropipety pomocniczej, aby delikatnie zdmuchnąć koralik tak, aby pozostał przyklejony do wierzchołka RBC. Odsuń pipetę pomocniczą i wyrównaj cel i koralik sondy w programie.
W oknie pola widzenia użyj narzędzi programowych, aby zmierzyć odpowiednie promienie mikropipety sondy, RBC i okrągły obszar styku między RBC a koralikiem sondy. Wartości te pozwalają na oszacowanie stałej sprężystości RBC za pomocą równania podanego w protokole tekstowym. Po wprowadzeniu do programu żądanej stałej sprężystości RBC, narysuj poziomą linię w poprzek wierzchołka RBC, co da krzywą w sąsiednim oknie wskazującą jasność każdego piksela.
Wzdłuż tej linii przeciągnij linię progu tak, aby znajdowała się mniej więcej na połowie głębokości krzywej. Następnie wybierz żądany tryb eksperymentu, test fluktuacji termicznej, test częstotliwości adhezji lub test siły zaciskowej. Ustaw parametry zgodnie z potrzebami.
Kliknij start, co pozwala programowi przesunąć pipetę docelową i wprowadzić i wyłączyć cel z sondą Zbieranie danych zostanie wykonane i równoległe, co rejestruje pozycję kulki pro w czasie rzeczywistym. Zatrzymaj program, klikając przycisk zatrzymaj eksperyment, w którym momencie wyskoczy okno. Aby umożliwić zapisanie pozyskanych danych do wykorzystania należy zastosować funkcję fluorescencji w układzie BFP, w którym włączono źródło światła wzbudzającego oraz kamerę fluorescencyjną, które sterowane są osobnym programem.
Następnie wybierz parametry obrazowania fluorescencyjnego, w tym wzmocnienie ekspozycji i kanały wzbudzenia. Postępuj zgodnie ze wszystkimi przygotowaniami w protokole eksperymentu BFP, w tym ustawieniem sondy i celu, aby umożliwić wizualizację obrazu fluorescencyjnego na żywo komórki docelowej, który jest wzbudzany przez światło wzbudzające o długości 340 nanometrów lub 380 nanometrów. Użyj narzędzia do dzielenia na sekcje, aby z grubsza przeciąć obszar, w którym komórka pozostanie przez cały okres nagrywania.
Następnie jednocześnie kliknij rekord i zacznij klikać. Zapis pozwala światłu o długości 340 nanometrów i 380 nanometrów na przemian wzbudzać wewnątrzkomórkową matrycę fluorescencyjną. Para odpowiadających im obrazów fluorescencyjnych będzie rejestrowana naprzemiennie mniej więcej raz na sekundę.
Kliknięcie przycisku start rozpoczyna eksperyment BFP w celu analizy interakcji molekularnej oraz eksperyment obrazowania fluorescencyjnego w celu monitorowania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej, a następnie przejście do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W krzywych surowych danych siły w czasie siła jest uzyskiwana ze śledzenia zmiany położenia pro koralika. W przypadku braku adhezji siła powróci do zera w sygnale czasu odwrócenia siły po wycofaniu komórki docelowej z powierzchni ściegu.
I odwrotnie, w przypadku siły zrywającej, adhezja objawi się szybkim podniesieniem siły do dodatniego poziomu podczas cofania, a następnie szybkim powrotem do zera. W wydarzeniu życiowym pozytywna siła zostanie zaciśnięta, aby urzeczywistnić plateau. Długość płaskowyżu to całe życie.
Poprzez wielokrotne przeprowadzanie cykli eksperymentów VFP zostanie wyprowadzona krzywa siły w funkcji czasu. Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne kilku lub dwóch załadowanych limfocytów T po wzbudzeniu przez kanały świetlne o długości 340 nanometrów i 380 nanometrów. Oba obrazy pokazują wyraźne kontury komórki, co wskazuje, że komórka była dobrze wybarwiona Po uzyskaniu danych dotyczących kinetyki wiązania i danych fluorescencyjnych z limfocytu T, zarówno krzywa skumulowanego czasu życia, jak i krzywa poziomu wapnia są przedstawione na tym samym rysunku, aby znaleźć korelację między nimi.
Teraz powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment A-F-B-I-P. Podczas tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać, aby sprawdzić, czy sonda siły nie ma żadnych wad, takich jak średnica mikropipety, długość występu gumowej komórki i położenie stopki.
Wszystko to wpłynie na dokładność pomiaru siły. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się biologią molekularno-mechaniczną do badania mechanizmu transdukcji mechanicznej we wszystkich możliwych systemach biologicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę do równoczesnego pomiaru kinetyki wiązania receptor-ligand podczas obserwacji sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T. Metoda wykorzystuje biotynylowane czerwone krwinki jako przetworniki siły i mikroskopiczne szklane kulki do funkcjonalizacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Immunologia
- Biofizyka
Tło
- Rozumienie interakcji receptor-ligand jest kluczowe dla badań immunologicznych.
- Sygnalizacja wapniowa odgrywa kluczowa rolę w aktywacji limfocytów T.
- Techniki pomiaru jednoczesnego zwiększają dokładność danych.
- Metody przetwarzania siły mogą dostarczyć wglądu w kinetykę wiązania.
Cel badania
- Pomiar kinetyki wiązania receptor-ligand w czasie rzeczywistym.
- Obserwacja sygnalizacji wapniowej indukowanej przez zdarzenia wiązania.
- Opracowanie metody mającej zastosowanie do analizy pojedynczych komórek.
Stosowane metody
- Izolacja biotyny i dostosowanie osmolarności ludzkich czerwonych krwinek.
- Funkcjonalizacja mikroskopicznych szklanych kulek ligandami.
- Izolacja i inkubacja limfocytów T z barwnikiem wapniowym.
- Przygotowanie mikro pipet w komorze eksperymentalnej.
Główne wyniki
- Skuteczna pomiar kinetyki wiązania receptor-ligand.
- Monitorowanie poziomów wapnia wewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym.
- Demonstracja techniki fluorescencyjnego biobłonowego sondowania sił.
- Wgląd w dynamikę adhezji limfocytów T.
Wnioski
- Technika zapewnia potężne narzędzie do badania interakcji pojedynczych komórek.
- Zwiększa zrozumienie mechanizmów aktywacji limfocytów T.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne typy komórek i ścieżki sygnalizacyjne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Measuring receptor-ligand binding kinetics and downstream signaling under physiological force conditions addresses a critical gap in target validation for immunotherapies. The fluorescence biomembrane force probe (fBFP) enables concurrent quantification of molecular interactions and intracellular calcium flux in single live cells, providing mechanistic de-risking for T-cell receptor-targeted biologics. This capability supports predictive confidence in early discovery by linking biophysical binding parameters to functional signaling outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating receptor-ligand binding kinetics under force with calcium signaling activation in T cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of binding and signaling, reducing mechanistic ambiguity in immuno-oncology target selection.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying ligands that induce sustained signaling under physiologically relevant mechanical conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (biotinylated RBCs as force sensors, ligand-coated beads) for downstream screening applications requiring force-regulated binding readouts.
- Operational Value: Delivers quantitative, reproducible measurements of binding kinetics (force, lifetime, rupture events) and calcium signaling with high spatiotemporal resolution (~1 pN, ~3 nm, ~0.5 msec).
- Assay Readiness: Enables scalable compound evaluation by providing a platform that integrates force transduction with fluorescent signaling readouts for hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses primary human T cells and physiological force ranges to model disease-relevant TCR-ligand interactions in immunological contexts.
- Mechanistic De-risking: Links binding kinetics to calcium signaling outcomes, informing structure-function relationships for lead optimization in T-cell engagers or checkpoint modulators.
- Preclinical Model: Supports disease-relevant system validation by demonstrating how mechanical regulation affects antigen recognition and triggering in T cells.
Pipeline & Workflow Integration
The fBFP method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification, where binding kinetics and signaling correlation inform go/no-go decisions before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how mechanical force regulates TCR-ligand binding and downstream calcium flux in live T cells.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs (binding lifetime, rupture force, calcium flux) that enable comparison of ligand variants or therapeutic candidates under controlled force conditions.
- Analytics: Provides correlated force versus time curves and fluorescence intensity readouts that allow teams to link biophysical binding parameters to functional signaling responses.
- Translational Research: Connects single-cell binding kinetics to calcium signaling continuity, supporting biomarker alignment for T-cell activation states in preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for studying any membrane receptor-ligand interaction under mechanical regulation, applicable across immunology, oncology, and neuroscience targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity between binding events and functional outcomes in immune cell targets.
- Operational Value: Standardizes force-regulated binding and signaling measurements through calibrated ultra-sensitive RBC force transducers and real-time imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying ligands that produce sustained signaling under physiological force, reducing late-stage biological risk in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on correlated binding kinetics and signaling thresholds observed in single live cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell manipulation, micro pipette fabrication, and fluorescence microscopy for force probe assembly and calibration.
- Depends on instrumentation including high-speed cameras, micro manipulators, force feedback systems, and dual-excitation fluorescence setups for calcium imaging.
- Necessitates cross-team standardization of RBC preparation, bead functionalization, and calcium dye loading protocols to ensure reproducibility across users.
- Involves adaptation considerations for different cell types (beyond T cells) and ligand pairs, requiring optimization of osmolarity, biotinylation, and force clamp parameters.
- Includes practical limitations such as low throughput due to manual cell/bead capture and dependence on operator skill for micro pipette tip quality and chamber sealing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:28
Human RBCs Isolation, Biotinylation and Osmolarity Adjustment
4:07
Preparation for Micropipettes and a Cell Chamber
6:24
BFP Experiment
10:25
Fluorescence BFP (FBFP) Experiment
11:51
Results: Representative T-cell Receptor and Peptide MHC Binding Kinetics Data & Calcium Fluorescence Data from the FBFP Experiment
13:14
Conclusion
