Name: Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Poznaj technikę fluorescencyjnej sondy siły biomembrany do jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania receptor-ligand i sygnalizacji wapniowej w pojedynczej limfocytie T. Ta metoda wykorzystuje biotynowane krwinki czerwone jako transduktory siły.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania związane z tym artykułem i rozwojem technologii fBFP w laboratorium Zhu były wspierane przez granty NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 i TW008753. Dziękujemy Evanowi Evansowi za wynalezienie tego inspirującego narzędzia eksperymentalnego oraz członkom laboratorium Evansa, Andrew Leungowi, Kojiemu Kinoshicie, Wesleyowi Wongowi i Kenowi Halvorsenowi, za pomoc w budowie BFP. Dziękujemy również innym członkom laboratorium Zhu, Fang Kongowi, Chenghao Ge i Kaitao Li, za ich pomoc w rozwoju oprzyrządowania.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+glycoprotein+Ib%2FV%2FIX+and+integrin+alpha+IIbbeta+3-dependent+calcium+signals+cooperatively+regulate+platelet+adhesion+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).</li>
<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Udany eksperyment z fBFP wiąże się z kilkoma krytycznymi kwestiami. Po pierwsze, aby obliczenia siły były wiarygodne, mikropipeta, RBC i koralik sondy powinny być ustawione jak najbliżej współosiowego. Występ RBC wewnątrz pipety powinien mieć około jednej średnicy pipety sondy, tak aby tarcie między RBC a pipetą było znikome. Dla typowego ludzkiego krwinki czerwonej optymalna średnica pipety wynosi 2,0-2,4 μm, co zapewnia najlepsze dopasowanie do równania 117,30. Po drugie, aby zapewnić, że pomiary w teście si...

Adhezja między komórkami i komórka-komórka do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odbywa się poprzez wiązanie między receptorami na powierzchni komórki, białkami ECM i/lub lipidami1. Wiązanie pozwala komórkom tworzyć funkcjonalne struktury1, a także rozpoznawać, komunikować się i reagować na środowisko1-3. W przeciwieństwie do rozpuszczalnych białek (np. cytokin i czynników wzrostu), które wiążą się z trójwymiarowej (3D) fazy płynnej z receptorami na powierzchni komórki, receptory adhezyjne komórek tworzą wiązania ze swoimi ligandami w wąskiej szczelinie połączeniowej, aby połączyć dwie przeciwstawne powierzchnie, które ograniczają dyfuzję molekularną w dwuwymiarowym (2D) interfejsie4-7. W przeciwieństwie do kinetyki 3D, która jest zwykle mierzona za pomocą tradycyjnych testów wiązania (np. powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub SPR), kinetyka 2D musi być określona ilościowo za pomocą specjalistycznych technik, takich jak mikroskopia sił atomowych (AFM)8-10, komora przepływowa11,12, mikropipeta13,14, pęseta optyczna15 i sonda siły biomembrany (BFP)16-21.
Cząsteczki adhezyjne są czymś więcej niż tylko fizycznym połączeniem dla spójności komórkowej, są głównym składnikiem maszynerii sygnalizacyjnej dla komórki do komunikowania się z otoczeniem. Rośnie zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób zaangażowanie ligandów w cząsteczki adhezyjne inicjuje sygnalizację wewnątrzkomórkową i w jaki sposób początkowy sygnał jest przenoszony do wnętrza komórki. Intuicyjnie rzecz biorąc, właściwości wiązania receptor-ligand mogą wpływać na sygnały, które indukuje. Jednak trudno jest przeanalizować mechanistyczne relacje między interakcją zewnątrzkomórkową a wewnątrzkomórkowymi zdarzeniami sygnalizacyjnymi przy użyciu tradycyjnego zestawu testów biochemicznych ze względu na ich wiele ograniczeń, np. słabą rozdzielczość czasową i całkowity brak rozdzielczości przestrzennej. Istniejące metody, które umożliwiają zarówno biofizyczne (kinetyka wiązania receptor-ligand 2D), jak i biochemiczne (sygnalizacja) obserwacje żywych komórek, obejmują substraty o regulowanej sztywności22, układy filarów elastomerowych23 oraz komory przepływowe/urządzenia mikroprzepływowe ze zdolnością fluorescencji24-26. Odczyty sygnalizacji i wiązania receptor-ligand muszą być jednak uzyskiwane oddzielnie (najczęściej różnymi metodami), co utrudnia analizę czasowych i przestrzennych relacji charakterystyki wiązania wiązania ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi.
Konwencjonalny BFP to ultraczuła spektroskopia sił o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej17. Wykorzystuje elastyczną krwinkę czerwoną (RBC) jako czujnik siły, umożliwiając pomiar kinetyki 2D pojedynczej cząsteczki, właściwości mechanicznych i zmian konformacyjnych14,16,19-21,27-29. BFP oparty na obrazowaniu fluorescencyjnym (fBFP) koreluje kinetykę wiązania receptor-ligand z sygnalizacją komórkową wyzwalaną wiązaniem w skali pojedynczej cząsteczki. Dzięki tej konfiguracji w komórkach T zaobserwowano aktywność sygnalizacji komórkowej in situ w kontekście powierzchniowej stymulacji mechanicznej27. fBFP jest wszechstronny i może być stosowany do badań adhezji komórek i sygnalizacji, w której pośredniczą inne cząsteczki w innych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Jednozasadowy monohydrat fosforanu sodu (NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparat buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>Anhy. Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Preparat buforowy fosforanowy</td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Węglan/wodorowęglan preparat buforowy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5% preparat buforowy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5% preparat buforowy</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5% preparat buforowy</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Przygotowanie buforu N2-5%</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Funkcjonalizacja kulek</td></tr><tr><td>Biotyna-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>Biotynylacja RBC</td></tr><tr><td>Nystatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>Regulacja osmolarności RBC</td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu (NH4OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>Koralik szklany silanizacja</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>Silanizacja kulek szklanych</td></tr><tr><td>30% Nadtlenek wodoru (H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>Silanizacja kulek szklanych</td></tr><tr><td>Kwas octowy (lodowaty)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Silanizacja kulek szklanych</td></tr><tr><td>3-merkaptopropylotrimetoksysilan (MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funkcjonalizacja kulek szklanych Koraliki</td></tr><tr><td>ze szkła borokrzemianowego</td><td>Distrilab Particle Technology</td><td>9002</td><td>Funkcjonalizacja kulek szklanych</td></tr><tr><td>Streptawidyna&minus; Maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funkcjonalizacja kulek szklanych</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Ligand funkcjonalizujący</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>Wewnątrzkomórkowe ładowanie barwnikiem fluorescencji wapnia</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Wewnątrzkomórkowe ładowanie barwnika fluorescencji wapnia</td></tr><tr><td>Koraliki Quantibrite PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>Kwantyfikacja gęstości</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR II</td><td>Kwantyfikacja gęstości</td></tr><tr><td>Rurka kapilarna 0,7-1,0 mm x 30 cali</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>Produkcja mikropipet</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Instrument sutter</td><td>P-97</td><td>Produkcja mikropipet</td></tr><tr><td>Mikrosiła do pipet</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Produkcja mikropipet</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>Zespół komory</td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Zespół komory</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Zespół komory</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td>Zespół 309602 komory</td></tr><tr><td>Uchwyt na mikropipety</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>Montaż komory</td></tr><tr><td>Domowe części mechaniczne i adaptery zaprojektowane w domu przy użyciu obróbki CNC.&nbsp;</td><td>Instrument biofizyczny</td><td>Wszystkie części są dostosowywane zgodnie z projektami CAD.</td><td>System BFP</td></tr><tr><td>Mikroskop (odwrócony TiE)</td><td>System Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Obiektyw CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)</td><td>System Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Aparat, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>System BFP</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP system</td></tr><tr><td>Ręczna submikronowa głowica pomiarowa z pilotem o wysokiej rozdzielczości</td> System <td>Karl Suss</td><td>PH400</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny (5' x 3')</td><td>System TMC</td><td>77049089</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Ręczny etap translacyjny 3D</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie CAD 3D SolidWorks</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Wersja 2012 SP5</td><td>System BFP</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>LabVIEW National Instruments</td><td>Wersja 2009</td><td>System BFP, program BFP</td></tr><tr><td>Stolik translacyjny 3D piezoelektryczny</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>System BFP</td></tr><tr><td>Liniowy akumulator piezoelektryczny</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>System</td></tr><tr><td>BFP Oprogramowanie</td><td></td> Micromanager <td>Wersja 1.4</td><td>system fBFP, fluorescencja program do obrazowania</td></tr><tr><td>Dual Cam (DC-2)</td><td>Fotometria</td><td>77054724</td><td>system fBFP</td></tr><tr><td>Filtr emisyjny Dual Cam (T565LPXR)</td><td>Fotometria</td><td>77054725</td><td>system fBFP</td></tr><tr><td>Kamera fluorescencyjna</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>System fBFP</td></tr><tr><td>Folia parafinowa z tworzywa sztucznego (Parafilm)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>Uszczelnienie butelki</td><td>PM996</td></tr><tr><td>Węglan/ Bufor wodorowęglanowy (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td>8,4 g/l węglan sodu (Na2CO3), 10,6 g/l wodorowęglan sodu (NaHCO3</td></tr>)<tr><td>Bufor fosforanowy (pH 6,5-6,8)</td><td></td><td></td><td>27,6 g/l NaFosforan jednozasadowy (NaH2PO4 &bull; H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosforan dwuzasadowy (Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% bufor (pH 7,2)</td><td></td><td></td><td>20,77 g/L chlorek potasu (KCl), 2,38 g/L chlorek sodu (NaCl), 0,13 g/l jednozasadowy fosforan potasu (KH2PO4), 0,71 g/l anhy. fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4), 9,70 g/l sacharozy</td></tr></tbody></table>

sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Interakcje receptor-ligand błonowy pośredniczą w wielu funkcjach komórkowych. Kinetyka wiązania i dalsza sygnalizacja wyzwalana przez te interakcje molekularne są prawdopodobnie zakłócone przez środowisko mechaniczne, w którym zachodzi wiązanie i sygnalizacja. Niedawne badanie wykazało, że siła mechaniczna może regulować rozpoznawanie antygenu poprzez wyzwalanie receptora komórek T (TCR) i wyzwalanie go. Było to możliwe dzięki nowej technologii, którą opracowaliśmy i nazwaliśmy fluorescencyjną sondą siły biomembranowej (fBFP), która łączy spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek z mikroskopią fluorescencyjną. Wykorzystując ultra-miękką ludzką krwinkę czerwoną jako czuły czujnik siły, szybką kamerę i techniki śledzenia obrazowania w czasie rzeczywistym, fBFP wynosi ~1 pN (10-12 N), ~3 nm i ~0,5 ms w mocy, rozdzielczość przestrzenną i czasową. Dzięki fBFP można precyzyjnie zmierzyć kinetykę wiązania pojedynczego receptor-ligand pod wpływem regulacji siły i jednocześnie obrazować wewnątrzkomórkową sygnalizację wapniową wyzwalaną wiązaniem na pojedynczej żywej komórce. Ta nowa technologia może być wykorzystana do badania innych interakcji receptor-ligand błonowy i sygnalizacji w innych komórkach podlegających regulacji mechanicznej.

Technika BFP została opracowana przez laboratorium Evansa w 1995 roku 17. To narzędzie do pomiaru sił pikoniutonowych było szeroko stosowane do pomiaru oddziaływań białek unieruchomionych na powierzchniach, w celu analizy dwuwymiarowej kinetyki cząsteczek adhezyjnych oddziałujących z ich ligandami16,19,20,30, pomiaru elastyczności molekularnej21,29 oraz określania zmian konformacyjnych białek21. W przypadku fBFP dodaje się dodatkowy zestaw urządzeń do epi-fluorescencji z odpowi...

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesny pomiar wiązania receptorów oraz obserwacja indukowanego wiązaniem sygnalizowania wapniowego w pojedynczej komórce. Osiąga się to poprzez wstępną izolację biotyny i dostosowanie osmolarności ludzkich erytrocytów (RBC), aby wykorzystać je jako ultrasensytywny przetwornik siły. Drugim krokiem jest funkcjonalizacja mikroskalowych kulek szklanych, co obejmuje ich czyszczenie, dylatację oraz powlekanie ligandem.Następnie izoluje się limfocyty T i inkubuje je z barwnikiem wapniowym Fluo-4, co umożliwia obserwację wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia. Ostatnim krokiem jest przygotowanie mikro pipet w komorze eksperymentalnej, które są specjalnie wymagane do konfiguracji eksperymentu. Ostatecznie wykorzystuje się technikę fluorescencyjnej sondy siły błony biologicznej (BFP), aby wykazać adhezję komórki do kuleczki pokrytej ligandem, zmierzyć kinetykę wiązania receptor-ligand, a jednocześnie monitorować wewnątrzkomórkowy poziom wapnia.Technika ta jest przydatna w zrozumieniu, w jaki sposób siła mechaniczna jest wykrywana przez limfocyty T poprzez rozpoznawanie androgenów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami

fluorescence-biomembrane-force-probe-concurrent-quantitation-receptor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

W tym filmie sondy siły biomembranowej (BFP) są używane do pomiaru sił między receptorami i ligandami. Technika ta może wykrywać interakcje poprzez monitorowanie ciśnienia potrzebnego do zerwania wiązań między pMHC sprzężonym na kulkach sondy a TCR na komórkach docelowych.

Sonda wymuszająca biomembranę do ilościowego określania interakcji receptor-ligand

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Prezentujemy metodę pozyskiwania przebiegów czasu reporterowego fluorescencji z pojedynczych komórek za pomocą mikrowzorców. Protokół opisuje przygotowanie macierzy pojedynczych komórek, konfigurację i obsługę mikroskopii poklatkowej ze skanowaniem żywych komórek oraz narzędzie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym do automatycznej preselekcji, kontroli wizualnej i śledzenia przebiegów czasu fluorescencji zintegrowanych z komórkami na miejsce adhezji.

Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA) - wszechstronna technika ilościowego określania kinetyki komórkowej

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

Poznaj technikę fluorescencyjnej sondy siły biomembrany do jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania receptor-ligand i sygnalizacji wapniowej w pojedynczej limfocytie T. Ta metoda wykorzystuje biotynowane krwinki czerwone jako transduktory siły.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce (Wideo) | JoVE Journal

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Przeglądaj więcej filmów