Name: Selektywne zubożanie mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego L-leucyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę selektywnego zubożenia mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego L-leucyny. Protokół umożliwia badanie interakcji mikroglej-neuron w kontekście neurozwyrodnień.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Aims2Cure, Wielka Brytania i UCL Impact Award, stypendium doktoranckie dla JMP oraz stypendium doktoranckie MRC Capacity Building w zakresie demencji dla JMP.

Wszystkie eksperymenty opisane tutaj zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) w Wielkiej Brytanii z 1986 roku.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
<ol>
	<li>Przygotuj dwa laboratoryjne nożyczki preparacyjne ze stali nierdzewnej i dwa kleszcze laboratoryjne ze stali nierdzewnej. Umieść wszystkie narzędzia w autoklawie i umieść w okapie hodowlanym O/N pod światłem ultrafioletowym (UV) w celu sterylizacji.</li>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej o minimalnej ilości niezbędnych pożywek (MEM) (10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 30 mM D-glukozy, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 6 μg/ml ampicyliny) i wysterylizować filtrem. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 24-dołkowe płytki hodowlane zawierające szkiełka nakrywkowe o grubości 14 mm i grubości 1. Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie i pokryć poli-d-lizyną (PDL) w stężeniu 100 mg/l, jak opisano wcześniej 3. Światło UV sterylizuje O / N.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozwiązań w zakresie kultur CGC
<ol>
	<li>Przygotować "roztwór A" (100 ml) w autoklawowanym, poddanym działaniu promieni UV, sterylnymdH2O, poddanym działaniu promieniowania UV, zawierający 250 mg glukozy, 300 mg albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 955 mg soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS] (wolną od Ca2+ i Mg+) oraz 1 ml 3,8% MgSO4·7H2O.</li>
	<li>Przygotować "roztwór B" (10 ml) zawierający 1 ml 5 mg/ml trypsyny rozcieńczonej w 9 ml roztworu A.</li>
	<li>Przygotować "roztwór C" (10 ml) zawierający 1000 jednostek DNazy, 0,5 mg inhibitora trypsyny sojowej, 100 μl 3,8% MgSO4·7H2O, rozcieńczony do 10 ml roztworem A.</li>
	<li>Przygotować roztwór D (20 ml) zawierający 3,2 ml roztworu C, rozcieńczony do 20 ml roztworem A.</li>
	<li>Przygotować roztwór zrównoważonej soli BSA/Earle'a (EBSS) zawierający EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4·7H2O i 4% BSA, pH 7,4, jak opisano wcześniej3.</li>
	<li>Przygotować LME, dodając czystą LME do 5 ml pożywki hodowlanej MEM, aby uzyskać końcowe stężenie 150 mM LME, przywrócić roztwór do pH 7,4 za pomocą pH-metru laboratoryjnego i wysterylizować filtr za pomocą 28 mm filtra strzykawkowego z polieterosulfonu (PES) 0,2 μm.</li>
</ol>
3. Hodowla CGC
<ol>
	<li>Zbierz móżdżek od 4-7 dniowych szczeniąt szczurów, jak opisano wcześniej3. Umieścić natychmiast na szalce Petriego zawierającej 5 ml roztworu A na lodzie.</li>
	<li>Odlej nadmiar roztworu z móżdżku i umieść tkankę w pokrywie szalki Petriego.</li>
	<li>Drobno posiekaj tkankę dobrze podpaloną żyletką w co najmniej trzech różnych kierunkach.</li>
	<li>Dodać rozdrobnioną chusteczkę do roztworu B (przepłukać szalkę Petriego roztworem, aby upewnić się, że utracono ograniczoną ilość tkanki) i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut. Wstrząsać delikatnie co kilka minut.</li>
	<li>Dodać roztwór D (20 ml) do probówki, aby zneutralizować trypsynę, wstrząsnąć i odwirować przy 65 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odlewać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 4 ml roztworu C. Dobrze rozprowadzić (około 10 razy każda) trzema pipetami ze szkła płomienistego o zmniejszającej się średnicy, aż zawiesina stanie się możliwie najbardziej jednorodna.</li>
	<li>Powoli i delikatnie dodaj kilka kropli tego homogenatu na wierzch BSA/EBSS. Jeśli zacznie zapadać się przez BSA/EBSS, rozcieraj więcej i/lub dodaj trochę więcej roztworu C. Homogenat powinien znajdować się w warstwie na wierzchu BSA/EBSS. Nie potrząsać. Wirować z prędkością 100 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad (miękki) w 1 ml pożywki MEM.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki w ilości 800 000 komórek/szkiełko nakrywkowe w 500 μl pożywki MEM. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 6% CO2 .</li>
	<li>Zmień podłoże następnego dnia (24-36 godzin po przygotowaniu). Przygotować roztwór pożywki MEM zawierający 10 μM inhibitora cyklu komórkowego arabinofuranozylocytydyny (AraC).
	<ol>
		<li>Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy zachować 250 μl starej pożywki na świeżej płytce 24-dołkowej, odessać resztę, dodać 250 μl normalnej pożywki MEM i odessać ją w celu przepłukania komórek, a następnie dodać 250 μl starej pożywki z powrotem do komórek i uzupełnić 250 μl pożywki zawierającej AraC. 
		Uwaga: Komórki mogą być używane od 6 dni in vitro (DIV).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Selektywne zubożanie mikrogleju (wykonywane przy 6 DIV)
<ol>
	<li>Dodać czystą LME do 5 ml oddzielnej podwielokrotności pożywki MEM, aby uzyskać końcowe stężenie 150 mM LME.</li>
	<li>Przywróć roztwór do pH 7,4 i wysterylizuj filtr za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 28 mm z sulfonu polieterowego (PES) 0,2 μm.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór do stężenia 50 mM (2 x LME) w pożywce MEM i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut wraz z normalną pożywką MEM dla kultur kontrolnych.</li>
	<li>Usunąć połowę (250 μl) pożywki MEM z kultur CGC i zachować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Traktować komórki pożywką MEM zawierającą 2 x LME (250 μl), tj. rozcieńczoną w stosunku 1:1, co daje stężenie studzienki 25 mM, lub wstępnie podgrzaną pożywką MEM bez LME (250 μl) dla kultur kontrolnych.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 6% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyć komórki dwukrotnie w świeżej, wstępnie podgrzanej pożywce MEM w celu usunięcia pożywki zawierającej LME, a następnie zastąpić zatrzymaną pożywkę hodowlaną i równą objętość świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MEM do odpowiednich studzienek.</li>
	<li>Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze (nawilżonym 6% CO2 w temperaturze 37 °C) i pozostawić na 24 godziny przed dalszym leczeniem.</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable%2C+yet+not+extraordinary%2C+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li>
<li>Evans, G. J., &Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+neurotransmitter+release+by+dihydropyridine-sensitive+calcium+channels+involves+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation.</a> Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).</li>
<li>Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways+mobilized+in+microglia+and+neurones+as+a+consequence+of+chromogranin+A-induced+microglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation.</a> J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).</li>
<li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li>
<li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li>
<li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+rat+cerebellar+granule+neurons+and+application+to+identify+neuroprotective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents.</a> Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).</li>
<li>Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+of+the+accessory+cell+necessary+for+mitogen-stimulated+T+and+B+cell+responses+in+human+peripheral+blood%3A+delineation+by+its+sensitivity+to+the+lysosomotropic+agent%2C+L-leucine+methyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester.</a> J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).</li>
<li>Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+glia+release+factors+with+opposing+actions+upon+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival.</a> J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).</li>
<li>Guillemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtention+and+characterization+of+primary+astrocyte+and+microglial+cultures+from+adult+monkey+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains.</a> J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).</li>
<li>Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+expression+in+cultures+enriched+for+mature+oligodendrocytes+is+due+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia.</a> J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).</li>
<li>Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+p53+activation+is+detrimental+to+neuronal+sysnapses+during+activaton-induced+inflammation%3A+implications+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration.</a> Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).</li>
<li>Frade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+induces+release+of+glutathione+from+cultured+rats+astrocytes+%E2%80%93+a+possible+neuroprotective+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism.</a> J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).</li>
<li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li>
<li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase%2C+phosphatidylinositol-3-kinase%2FAkt+and+delta-Notch+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li>
<li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejszymi krokami zapewniającymi skuteczną selektywną eliminację mikrogleju z CGC i/lub kultur mieszanych są: 1) utrzymanie sterylnej i zdrowej hodowli CGC; 2) filtr sterylizujący pożywkę zawierającą LME i przywracający roztwór do pH 7,4; 3) utrzymywanie zatrzymanych mediów CGC i mediów zawierających LME w temperaturze 37 °C w celu uniknięcia szoku cieplnego; oraz 4) szybkie działanie w celu skrócenia czasu przetrzymywania komórek poza inkubatorem.
Użyliśmy 25 mM LME do zuboże...

Ludzki mózg składa się z około 85 miliardów neuronów i kolejnych 85 miliardów komórek nieneuronalnych, w tym komórek glejowych1. Przez większą część ostatnich 100 lat neuronaukowcy skupiali się głównie na populacji komórek nerwowych, wierząc, że komórki glejowe są niewiele więcej niż pasywnymi komórkami podporowymi, które zapewniają strukturalne wsparcie neuronom – stąd grecka etymologia słowa "glej" przetłumaczona na angielski jako "klej". Ostatnio jednak staje się coraz bardziej oczywiste, że interakcje neuronalno-glejowe mogą być znacznie bardziej fundamentalne dla podstawowych aspektów neurobiologii, neurofizjologii oraz genezy i progresji wielu chorób neurodegeneracyjnych. Komórki ziarniste móżdżku (CGC), najliczniejsza jednorodna populacja neuronów w ludzkim mózgu, dominują w móżdżku i stanowią ponad 90% jego składników komórkowych. W związku z tym komórki te były szeroko stosowane in vitro jako system modelowy do badania rozwoju, funkcji i patologii neuronów2-6.
Jednak kultury CGC nadal zawierają mikroglej i inne komórki glejowe w prawdopodobnie znacznych proporcjach. W rezultacie, dane CGC przypuszczalnie wykazujące bezpośrednie odpowiedzi neuronalne na różne terapie komórkowe mogą w rzeczywistości wynikać – częściowo lub całkowicie – z pośredniej wtórnej odpowiedzi sąsiedniego gleju w hodowli. Aby to ocenić, selektywnie wyeliminowaliśmy mikroglej z kultur neuronalnych CGC za pomocą estru metylowego L-leucyny (LME). LME jest środkiem lizomotropowym pierwotnie używanym do selektywnego niszczenia makrofagów7 i od tego czasu jest również używany do selektywnego zubożania mikrogleju z kultur glejowych nerwowych, astrocytów i mieszanych8,9,10. LME jest internalizowany przez makrofagi i mikroglej, gdzie powoduje rozerwanie lizosomów, a następnie apoptozę13,14. Makrofagi i mikroglej są charakterystycznie bogate w lizosomy, co powoduje, że są one szczególnie wrażliwe po ekspozycji na leczenie LME. Protokół ten zapewnia potężny, a jednocześnie prosty i łatwy sposób ustalenia udziału mikrogleju w eksperymentach z wykorzystaniem CGC i innych systemów hodowli neuronalnych/glejowych.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>Zakrzywiony koniec ułatwia usuwanie móżdżku&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>Prosty, ostry czubek ułatwia preparację gryzoni P4-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorowodorek estru metylowego L-leucyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7517-19-3</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór EBSS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27964-99-4</td><td>Szkiełka nakrywkowe pokryć 1 dzień przed użyciem&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DNaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-ED1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab31630</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

selektywne zubożanie mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego l-leucyny

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Mikroglej, rezydujące immunokompetentne komórki OUN, odgrywają wieloaspektową rolę w modulowaniu i kontrolowaniu funkcji neuronów, a także pośredniczą w odporności wrodzonej. Pierwotne modele hodowli komórek gryzoni znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat interakcji neuronalno-glejowych, ale dopiero niedawno zastosowano metody specyficznego eliminowania mikrogleju z kultur mieszanych. Jedną z takich technik – opisaną tutaj – jest zastosowanie estru metylowego L-leucyny, czynnika lizomotropowego, który jest internalizowany przez makrofagi i mikroglej, gdzie powoduje zakłócenie lizosomalne, a następnie apoptozę13,14. Eksperymenty z użyciem estru metylowego L-leucyny mają moc identyfikacji wkładu mikrogleju w otaczające środowisko komórkowe w różnych warunkach hodowli. Korzystając z protokołu zoptymalizowanego w naszym laboratorium, opisujemy, jak wyeliminować mikroglej z hodowli komórek ziarnistych móżdżku gryzoni P5. Takie podejście pozwala ocenić względny wpływ mikrogleju na dane eksperymentalne, a także określić, czy mikroglej odgrywa rolę neuroprotekcyjną czy neurotoksyczną w modelach hodowlanych schorzeń neurologicznych, takich jak udar, choroba Alzheimera czy Parkinsona.

Zdolność tej techniki do selektywnego usuwania mikrogleju z CGC i/lub kultur mieszanych opiera się na późniejszej możliwości dokładnej identyfikacji i odróżnienia mikrogleju od otaczających go komórek przez badacza. Można to osiągnąć przy użyciu markera specyficznego dla mikrogleju, takiego jak izolektyna-B4, co zilustrowano na Rysunku 1. Jak pokazano na Rysunku 2, nie odnotowano zauważalnych zmian w gęstości i morfologii astrocytów oraz neuronów w odniesieniu do każdej z głównych grup b...

Mikroglej może wpływać na neurony i inne komórki glejowe w hodowli za pomocą różnych autonomicznych mechanizmów niekomórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół selektywnego usuwania mikrogleju z pierwotnych kultur neuronalnych. Metoda ta może potencjalnie wyjaśnić rolę interakcji mikrogleju i neuronów, co ma implikacje dla schorzeń neurodegeneracyjnych, w których zapalenie nerwów jest cechą charakterystyczną.

Selektywne zubożanie mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego L-leucyny

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Ogólnym celem tej procedury jest selektywna eliminacja komórek mikrogleju z kultur komórek ziarnistych sella. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę populacji cgcs i przechowywanie ich w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 6% carbon dioxide. Drugim krokiem jest przygotowanie roztworu LME w medium MEM, aby uzyskać końcowe stężenie 150 millimolar LME.Następnie usuwa się drugą połowę pożywki MEM z kultur CGC i pozostawia ją w inkubatorze, a kultury CGC zastępuje się równą objętością LME zawierającego pożywkę MEM i umieszcza w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 6% carbon dioxide przez jedną godzinę. Ostatnim krokiem jest dwukrotne przemycie kultur CGC świeżą, uprzednio ogrzaną pożywką MEM.Zastąp zachowane pożywkę kulturacyjną równą objętością świeżej pożywki, a następnie przenieś komórki do inkubatora na 24 godziny przed dalszą obróbką. Ostatecznie, w celu wykazania specyficznego usunięcia komórek mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku, stosuje się immunochemię oraz mikroskopię fluorescencyjną. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii, takie jak: jaki wpływ wywiera mikroglej na neurony w różnych warunkach oraz jakie znaczenie mają te efekty dla naszego rozumienia schorzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ praca z kulturami pierwotnymi wymaga precyzji i szybkości. Procedurę należy rozpocząć od pobrania móżdżków od szczurząt w wieku od czterech do siedmiu dni. Należy je niezwłocznie umieścić w szalce Petriego zawierającej 5 ml roztworu A, schłodzonej na lodzie.Następnie usuń nadmiar roztworu z móżdżków i umieść tkankę na pokrywie szalki Petriego. Następnie drobno posiekaj tkankę za pomocą żyletki, tnąc w co najmniej trzech różnych kierunkach. Po tym dodaj posiekaną tkankę do roztworu B. Umieść ją w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez pięć minut, delikatnie wstrząsając co kilka minut.Następnie do probówki należy dodać 20 mililitrów roztworu D w celu neutralizacji trypsyny, a następnie mieszać w wirówce przy 60 5G przez pięć minut. Po tym czasie należy odlać nadsącz S. Próbkę resuspensowano w czterech mililitrach roztworu CT i poddano trzykrotnej trituracji, używając do tego trzech wypalanych szklanych pipet o stopniowo zmniejszającej się średnicy, aż do uzyskania jak najbardziej homogenicznej zawiesiny.Następnie powoli i ostrożnie dodaj kilka kropel tego homogenatu na powierzchnię B-S-A-E-B-S-S. Jeśli homogenat zacznie opadać przez B-S-A-E-B-S-S-T, wykonaj dodatkowe miareczkowanie i dodaj nieco więcej roztworu C. Homogenat powinien utworzyć warstwę na powierzchni B-S-A-E-B-S-S. Wiruj przez pięć minut przy 100 G, nie potrząsając próbką. Następnie usuń nadsącz i resuspenduj osad.W jednym mililitrze pożywki MEM należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru i wysiać je w zagęszczeniu 800 000 komórek na szkiełko podstawowe. Następnie należy dodać 500 µL pożywki MEM i umieścić próbkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 6% CO2. Następnie należy przygotować roztwór pożywki MEM zawierający 10 µM inhibitora cyklu komórkowego RC. Dla każdego szkiełka podstawowego należy pozostawić 250 µL starej pożywki w nowej płytce 24-dołkowej, a resztę odessać.Dodaj 250 µL zwykłej pożywki MEM, aby wypłukać komórki. Następnie dodaj do komórek 250 µL starej pożywki i uzupełnij objętość o 250 µL pożywki zawierającej RSE. W tej procedurze dodaj czyste LME do 5 mL pożywki MEM, aby uzyskać stężenie końcowe 150 mM LME.Przywrócić odczyn roztworu do pH 7.4 za pomocą roztworu kwasowego. Następnie przefiltrować go sterylnie, używając 28 milimetrowego filtra strzykawkowego PES o porach 0.2 mikrometra. Następnie rozcieńczyć roztwór LME do stężenia 50 milimolar w podłożu MEM.Następnie umieść go w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C na 10 minut, wraz z normalną pożywką MEM dla kultur kontrolnych. Po 10 minutach pobierz 250 µl pożywki MEM z każdej kultury CGC. Następnie utrzymuj pożywki w temperaturze 37 °C.Następnie komórki traktuje się pożywką MEM zawierającą dwukrotne stężenie LME lub podgrzaną pożywką MEM bez LME. W przypadku kultur kontrolnych komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w atmosferze z dodatkiem 6% dwutlenku węgla przez jedną godzinę. Następnie komórki przemywa się dwukrotnie świeżą, podgrzaną pożywką MEM, aby usunąć pożywkę zawierającą LME. Po tym czasie zastępuje się pozostałą pożywkę hodowlaną równą ilością świeżej, podgrzanej pożywki MEM.Na koniec inkubować hodowle w 6% uwilgotnionym dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed dalszą obróbką. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne obrazy z eksperymentów przeprowadzonych na hodowlach CGC po traktowaniu 25 do 75 milimolarnym LME przez jedną godzinę, a następnie przemyciu. Immunochemię wykonano z użyciem DPI w celu ilościowego oznaczenia całkowitej liczby komórek oraz tych wykazujących morfologię apoptotyczną, a także ISO lectin B four w celu identyfikacji i ilościowego oznaczenia mikrogleju. Wykres ten przedstawia ilościowe oznaczenie komórek wykazujących morfologię apoptotyczną; tutaj przedstawiono reprezentatywne obrazy z eksperymentów przeprowadzonych na hodowlach CGC po traktowaniu 25 milimolarnym LME przez jedną godzinę.Immunocytochemię przeprowadzono z użyciem DAPI oraz przeciwciała anty-beta-tubulinie III w celu identyfikacji zmian w gęstości neuronalnej, a także przeciwciała anty-GFAP w celu identyfikacji zmian w gęstości i morfologii astrocytów. Obrazy kontroli negatywnej przedstawiają hodowle CGC, w których pominięto inkubację z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje około dwóch godzin, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury.

selective-depletion-microglia-from-cerebellar-granule-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje technikę izolowania mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy. Po pierwsze, kora przechodzi segmentację i homogenizację w celu usunięcia neuronów i innych komórek glejowych, zachowując mikroglej. Następnie zawiesina komórkowa jest poddawana działaniu mikrokulek magnetycznych antymieliny i pola magnetycznego, skutecznie oddzielając komórki mikrogleju i szpiku od resztek mieliny i komórek zawierających mielinę.

Izolacja mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy. Komórki są traktowane antymetabolitem w celu wyeliminowania proliferujących komórek glejowych i wytworzenia czystej kultury neuronów ziarnistych móżdżku.

Izolacja i hodowla pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku myszy

Ten film demonstruje technikę selektywnego usuwania mikrogleju z pierwotnej hodowli neuronów szczura. Neurony ziarniste móżdżku są traktowane antymetabolitem w celu wyeliminowania proliferujących komórek glejowych. Dodatkowo są one traktowane środkami ukierunkowanymi na lizosomy w celu usunięcia mikrogleju z hodowli.

Selektywne usuwanie mikrogleju z hodowli neuronów granulatu móżdżku szczura

Ten film pokazuje izolację i hodowlę komórek progenitorowych móżdżku z móżdżku móżdżku. Progenitorzy neuronów ziarnistości móżdżku są izolowane i oczyszczane poprzez adhezję różnicową, skutecznie usuwając astrocyty. Ci wyhodowani przodkowie następnie różnicują się w neurony ziarniste móżdżku.

Izolowanie i hodowla mysich progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku

Ten film demonstruje protokół ekstrakcji komórek mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgach myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Protokół obejmuje preparację uszkodzonej tkanki mózgowej zawierającej komórki mikrogleju, potraktowanie tkanki określonymi enzymami w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki oraz wykorzystanie kulek magnetycznych specyficznych dla receptora mikrogleju do wyizolowania komórek mikrogleju.

Izolowanie mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgu myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Ten film przedstawia generowanie modelu uszkodzenia neuronów przy użyciu reaktywnych form tlenu (ROS) w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy. Szczegółowo opisuje proces wywoływania stresu oksydacyjnego poprzez dodawanie wysokich stężeń nadtlenku wodoru. Narażenie na ROS powoduje pęknięcia nici DNA i niestabilność genomu. Dodatkowo utlenianie białek komórkowych upośledza ich funkcje, podczas gdy peroksydacja lipidów narusza integralność błony. Ta kaskada prowadzi do uwalniania...

Modelowanie śmierci neuronalnej wywołanej reaktywnymi gatunkami tlenu w neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Ten protokół opisuje, jak dokładnie mierzyć żywotność neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny (FDA) i jodku propidyny (PI) w hodowanych ziarnistych neuronach móżdżku, pierwotnej hodowli neuronalnej używanej jako model in vitro w badaniach neurologicznych i neurofarmakologicznych.

Ocena żywotności neuronów za pomocą podwójnego barwienia dioctanu fluoresceiny i jodku propidium w hodowli neuronów ziarnistych móżdżku

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Poznaj metodę selektywnego zubożenia mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego L-leucyny. Protokół umożliwia badanie interakcji mikroglej-neuron w kontekście neurozwyrodnień.

Selektywne zubożanie mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego L-leucyny

Przeglądaj więcej filmów