Name: Terapia fotodynamiczna z mieszanymi fotouczulaczami z przewodzącego polimeru / fulerenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania nanocząstek polimeru przewodzącego z fullerenem do fotodynamicznej terapii nowotworów. Technika ta generuje reaktywne formy tlenu w komórkach rakowych pod wpływem światła.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Narodowej Fundacji Nauki (NSF) za finansowe wsparcie tej pracy poprzez nagrodę CAREER (CBET-0746210) oraz poprzez nagrodę CBET-1159500. Chcielibyśmy podziękować dr Turksonowi (Univ. of Hawaii Cancer Center) i dr Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) za pomoc w hodowli komórek.

1. Hodowla linii komórkowych
<ol>
	<li>Rozmrozić TE 71 (mysie komórki nabłonka grasicy), MDA-MB-231 (ludzkie komórki raka piersi), A549 (ludzkie komórki raka płuc) i OVCAR3 (ludzkie komórki nowotworowe jajnika), trzymając fiolki kriogeniczne w ciepłej wodzie przez mniej niż 2 minuty. Dodaj 10 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS do każdej linii komórkowej i wiruj przez 6 minut przy 106 x g.</li>
	<li>Zassać zawiesinę i dodać 3 ml pożywki do granulki. Prawidłowo wymieszać komórki, kilkakrotnie pipetując. Dodać ten roztwór komórkowy do wstępnie ogrzanej pożywki DMEM o pojemności 7 ml uzupełnionej 10% FBS w kolbach T75 i utrzymywać kolby w wilgotnej atmosferze 95% powietrza / 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Oznaczyć tę kolbę jako Przejście 0.</li>
	<li>Gdy zbieg komórek osiągnie 80%, zbierz komórki, inkubując je z 0,05% trypsyny przez 10 minut. Zneutralizuj trypsynę, dodając równą ilość pożywki. Odwirowywać ten roztwór przez 6 minut przy 106 x g. Usunąć zawiesinę i dodać do niej 3 ml świeżej pożywki. Dobrze wymieszać i przenieść niewielką ilość (100 μl) do kolby hodowlanej zawierającej 7 ml pożywki. Inkubować kolbę hodowlaną w inkubatorze. Oznaczyć kolbę jako Przejście 1.</li>
	<li>Hodować linie komórkowe aż do pasażu 11 lub 12.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie nanocząstek
<ol>
	<li>Przygotowanie ~10-6 M (dostosowany) nierozcieńczonego roztworu podstawowego MEH-PPV
	<ol>
		<li>W fiolce dodać 1 mg poli[2-metoksy-5-(2-etyloheksyloksyloksy)-1,4-fenylenwinylenu] (MEH-PPV) o masie cząsteczkowej (średnia Mn) 150 000-250 000 g / mol i 3 ml tetrahydrofuranu (THF). Mieszaj mieszaninę przez 2 godziny, podgrzewając w temperaturze 80 °C na płycie grzejnej.</li>
		<li>Przefiltrować powyższy roztwór do nowej fiolki za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Oznaczyć ten roztwór jako "nierozcieńczony roztwór podstawowy MEH-PPV". Roztwór ten będzie brał udział w otrzymywaniu nanocząstek po precyzyjnym dostrojeniu stężenia, jak opisano w krokach 2.1.3 i 2.1.4.</li>
		<li>Dodać 50 μl nierozcieńczonego roztworu podstawowego MEH-PPV do 3 ml THF. Oznaczyć ten roztwór jako "rozcieńczony roztwór podstawowy MEH-PPV". Przenieść do 1 cm kuwety kwarcowej i zmierzyć absorbancję przy 495 nm za pomocą spektroskopii UV-vis.</li>
		<li>Jeżeli absorbancja rozcieńczonego roztworu podstawowego MEH-PPV jest wyższa niż 0,17, należy rozcieńczyć nierozcieńczony roztwór podstawowy MEH-PPV, dodając jednorazowo więcej THF 1 ml i powtarzać krok 2.1.3 do momentu, gdy zmierzona absorbancja przy 495 nm znajdzie się w zakresie 0,13-0,17.</li>
		<li>Obliczyć molowość rozcieńczonego roztworu podstawowego MEH-PPV, stosując prawo Lamberta-Beera, jak pokazano poniżej. Tutaj absorbancja 0,15 jest używana jako przykład dla pozostałej części protokołu (tj. Dostosuj wszystkie poniższe obliczenia na podstawie zaobserwowanej absorbancji), zastosowany współczynnik ekstynkcji MEH-PPV wynosi 107 M-1 cm-1, a zastosowana długość ścieżki wynosi 1 cm. 
		A = ε x b x c (równanie 1) 
		(ε - molowy współczynnik ekstynkcji, A - absorbancja, b - długość drogi, c - stężenie roztworu) 
		0,15 = 107 M-1 cm-1 x 1 cm x c (równanie 2) 
		c = 1,5 x 10-8 M (równanie 3) 
		Użyj tego stężenia, aby znaleźć stężenie nierozcieńczonego roztworu podstawowego MEH-PPV w następujący sposób: 
		M1V1 = M2V2 (Równanie 4) 
		0,15 x 10-7 M x 3050 μl = M2 x 50 μl (Równanie 5) 
		M2 = 9,15 x 10-7 M (równanie 6) 
		Jest to stężenie "skorygowanego nierozcieńczonego roztworu podstawowego MEH-PPV".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie masy MEH-PPV w skorygowanym nierozcieńczonym roztworze podstawowym MEH-PPV
	<ol>
		<li>Obliczyć masę MEH-PPV w 1 ml dostosowanego nierozcieńczonego roztworu podstawowego, jak pokazano poniżej, wykorzystując molowość otrzymaną w sekcji 2.1.4 i masę cząsteczkową (Mw) MEH-PPV, która wynosi10,6 g/mol. 
		M = n/V (n – liczba moli, V – objętość w L) (Równanie 7) 
		Zatem masa MEH-PPV w 1 ml skorygowanego nierozcieńczonego roztworu podstawowego wynosi 9,15 x 10-4 g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszanie PCBM w MEH-PPV
	<ol>
		<li>Obliczyć masę estru metylowego kwasu fenylo-C61-masłowego (PCBM), który należy dodać do podstawowego roztworu MEH-PPV w celu wytworzenia 50% wagowych roztworu MEH-PPV domieszkowanego PCBM, gdzie 50% wag. PCBM definiuje się w odniesieniu do masy MEH-PPV (tj. połowy masy MEH-PPV). Na podstawie masy MEH-PPV uzyskanej w sekcji 2.2. 
		Masa PCBM/9,15 x 10-4 g MEH-PPV x 100% = 50% wag. PCBM (równanie 8) 
		Masa PCBM = 4,57 x 10-4 g (równanie 9)</li>
		<li>Odważyć 1 mg PCBM w fiolce i dodać 500 μl THF. Obliczyć stężenie PCBM w tym roztworze, używając masy cząsteczkowej PCBM jako 910.88 g/mol 
		Molarność roztworu PCBM = 0,001 g/(910,88 g/mol * 500 μl)(Równanie 10) 
		Molarność roztworu PCBM = 2,19 x 10-9 mol/μl(Równanie 11)</li>
		<li>Obliczyć objętość roztworu PCBM potrzebną do dodania do dostosowanego nierozcieńczonego roztworu podstawowego MEH-PPV w celu otrzymania 50% wag. roztworu MEH-PPV domieszkowanego PCBM w THF, używając molowości obliczonej w kroku 2.3.2 
		4,57 x 10-4 g PCBM x 1 mol/910,88 g x 1 μl/2,19 x 10-9 mol = 229 μl (Równanie 12) 
		Dodać 229 μl roztworu PCBM do 1 ml dostosowanego nierozcieńczonego roztworu podstawowego MEH-PPV i dobrze wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymywanie nanocząstek metodą wytrącania
	<ol>
		<li>Przenieść 1 ml zmieszanego roztworu MEH-PPV/PCBM do strzykawki o pojemności 1 ml z dołączoną igłą.</li>
		<li>Szybko wstrzyknąć 1 ml zmieszanego roztworu MEH-PPV/PCBM do 4 ml wody DI, mieszając z prędkością 1 200 obr./min. Natychmiast po wstrzyknięciu należy przerwać mieszanie. Użyj tych nanocząstek bez dalszego przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Inkubacja linii komórkowych z nanocząstkami do obrazowania
UWAGA: Wszystkie eksperymenty z obrazowaniem zostały przeprowadzone na szalkach Petriego o średnicy 35 mm
<ol>
	<li>Wychwyt nanocząstek w liniach komórkowych
	<ol>
		<li>Linie komórek hodowlanych do 12przejścia. W 12pasażu hodować komórki na 35 mm szalkach Petriego. Dostosuj stężenie komórek dodanych do 35-milimetrowych szalek Petriego tak, aby po 24 godzinach komórki zlewały się w 40%.</li>
		<li>Na tym etapie usunąć pożywkę DMEM uzupełnioną 10% FBS z szalek Petriego, dwukrotnie przemyć komórki 1x DPBS i dodać 100 μl zawiesiny nanocząstek do 2 ml DMEM do szalek Petriego.</li>
		<li>Po 24 godzinach usuń zawiesinę DMEM/nanocząstek z szalek Petriego i umyj komórki 1x DPBS 3 razy. Następnie utrwal komórki poprzez inkubację z 4% paraformaldehydem przez 10 minut. Umyć dwukrotnie DPBS. Wybarwić komórki za pomocą 300 nM DAPI, inkubując z barwnikiem przez 2 minuty. Umyć dwukrotnie DPBS. Następnie zachowaj komórki w DPBS do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie ROS
	<ol>
		<li>Hodowla linii komórkowych A549 i OVCAR3 na szalkach Petriego, po 6 sztuk na linię komórkową, jak wyjaśniono w sekcji 3.1.1. Oznacz szalki Petriego zgodnie z tabelą 1.</li>
		<li>Dodać 100 μl zawiesiny nanocząstek do 2 ml DMEM na trzy szalki Petriego, jak pokazano w tabeli 1, i inkubować przez 24 godziny. W przypadku szalek Petriego, które otrzymają lekkie dawki, umyj komórki po 24 godzinach i zawieś je w pożywce HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) bez barwnika.</li>
		<li>Rozgrzej lampę symulatora słonecznego przez 15 minut. Umieść filtr UV przed lampą, aby odfiltrować światło UV. Skalibruj lampę z referencyjnym ogniwem słonecznym, regulując moc lampy, aby uzyskać intensywność 0,5 słońca (50 mW/cm2) na powierzchni szalki Petriego. W tym konkretnym układzie taki warunek został osiągnięty dzięki mocy 218 W dostarczanej do lampy.</li>
		<li>Umieść szalki Petriego pod lampą (otwarta pokrywa) na 60 minut, co daje dawkę światła 180 J/cm2, jak pokazano w poniższych obliczeniach: 
		50 mW/cm2 x 3 600 s/1 000 = 180 J/cm2</li>
		<li>Usunąć HBSS i bez mycia dodać 2 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS do szalek Petriego. Inkubuj komórki przez kolejne 2 godziny.</li>
		<li>W celu kontroli pozytywnej inkubować komórki z nadtlenkiem wodoru (H2O2) w ilości 100 μM, przez 30 minut.</li>
		<li>Wybarwić komórki na wszystkich szalkach Petriego końcowym stężeniem 5 μM odczynnika wykrywającego ROS poprzez inkubację komórek z barwnikiem przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Utrwal komórki, inkubując z 4% paraformaldehydem przez 10 minut. Przemyć dwukrotnie DPBS. Wybarwić komórki za pomocą 300 nM DAPI, inkubując z barwnikiem przez 2 minuty. Umyć dwukrotnie DPBS. Następnie zachowaj komórki w DPBS do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Apoptoza i nekroza przez PI i aneksynę V FITC
	<ol>
		<li>Hoduj każdą linię komórkową na 5 szalkach Petriego. Trzy z tych szalek Petriego będą przeznaczone do eksperymentów, podczas gdy pozostałe 2 szalki Petriego będą próbkami kontrolnymi. Inkubować 3 szalki Petriego w celu eksperymentu z nanocząstkami, jak wyjaśniono w sekcji 3.1.2. Próbki kontrolne nie są inkubowane z nanocząstkami.</li>
		<li>Po 24 godzinach inkubacji wykonaj krok 3.2.3.</li>
		<li>Umieścić 3 eksperymentalne szalki Petriego pod lampą (otwarta pokrywa) i wyjąć jedną po 20 minutach, jedną po 40 minutach i jedną po 60 minutach. W ten sposób otrzymano trzy próbki, które poddano działaniu dawek światła wynoszących odpowiednio 60, 120 i 180 J/cm2 (obliczenia w sekcji 3.2.4). Następnie podaj lekką dawkę 180 J/cm2 na jedną z kontrolnych szalek Petriego. Jest to kontrola z dawką światła stosowaną przy braku nanocząstek. Nie stosować dawki światła do pozostałej próbki kontrolnej (bez nanocząstek i bez zastosowania dawki światła).</li>
		<li>Zastąp HBSS pożywką DMEM uzupełnioną 10% FBS i trzymaj szalki Petriego w inkubatorze przez 4 godziny.</li>
		<li>Wybarwić komórki na eksperymentalnych i kontrolnych szalkach Petriego 20 μl aneksyny V FITC, inkubując komórki z barwnikiem przez 15 minut. Przemyć dwukrotnie DPBS. Wybarwić komórki 300 nM DAPI oraz 300 nM PI (jodek propidyny) przez inkubację z barwnikami przez 2 minuty. Umyć dwukrotnie DPBS. Następnie zachowaj komórki w DPBS do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wewnętrzna cytotoksyczność nanocząstek
<ol>
	<li>Liczenie komórek i hodowla na płytkach 96-dołkowych
	<ol>
		<li>Zebrać komórki z kolb hodowlanych, usuwając pożywkę i dwukrotnie myjąc komórki DPBS, a następnie inkubację komórek z 0,05% trypsyną przez 10 minut. Dodać 2 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS do otrzymanego roztworu komórkowego. Odpowiednio wymieszaj roztwór, aby rozdzielić skupiska komórek na singlety.</li>
		<li>Weź 100 μl zawiesiny komórkowej i dodaj do 900 μl pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS. Dobrze wymieszaj. Umieścić 10 μl tej zawiesiny na hemocytometrze. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i dostosować stężenie zawiesiny komórek w 4.1.1 do 5 x 104 komórek/ml.</li>
		<li>Weź 5 96-dołkowych płytek oznaczonych jako 0 godz., 24 godz., 48 godz., 72 godz. i 96 godz. Dodać 50 μl roztworów komórkowych 5 x 104 komórek/ml (TE 71 i A549) do studzienek, jak pokazano w tabeli 2, wysiewając w ten sposób 2,500 komórek/basenik. Wykonaj tę samą procedurę dla linii komórkowych OVCAR3 i MDA-MB-231.</li>
		<li>Po 24 godzinach przemyć studzienki 1x DPBS i dodać 50 μl rosnących stężeń nanocząstek do studzienek, jak pokazano w tabeli 2. Przygotować różne stężenia nanocząstek, dodając 20, 100 i 180 μl zawiesiny nanocząstek z 2.4.2 do DMEM, aby uzyskać końcową objętość 2 ml, co daje stężenia nanocząstek odpowiednio 0,4 x 10-4 mg/ml, 2,0 x 10-4 mg/ml i 3,6 x 10-4 mg/ml. Każda linia komórkowa ma trzy razy dla każdego stężenia nanocząstek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar żywotności komórek w ciemności
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl MTT do płytki 0 h natychmiast po dodaniu nanocząstek. Inkubować płytkę przez 4 godziny, aby uformowały się kryształy formazanu. Dodać 50 μl roztworu solubilizacyjnego do studzienek. Inkubować płytkę przez 6 godzin, aby rozpuścić kryształy formazanu.</li>
		<li>Zmierzyć żywotność komórek płytki 0 h, rejestrując absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
		<li>W przypadku 24-godzinnej płytki przemyj komórki 1x DPBS i dodaj 50 μl pożywki do każdego dołka po 24-godzinnej inkubacji z nanocząstkami. Dodać MTT i odczytać tabliczkę zgodnie z opisem w 4.2.1 i 4.2.2.</li>
		<li>W przypadku płytek 48-godzinnych, 72-godzinnych i 96-godzinnych należy przemyć komórki 1x DPBS i dodać 50 μl pożywki do dołków po 24-godzinnej inkubacji z nanocząstkami. Inkubuj komórki przez pozostałe okresy czasu.</li>
		<li>4.2.5) Zmierz żywotność komórek w określonych punktach czasowych, jak wyjaśniono w 4.2.1 i 4.2.2.</li>
		<li>Powtórz cały eksperyment 3 razy (n = 3)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiar żywotności komórek po PDT
<ol>
	<li>Liczenie komórek i hodowla na płytkach 96-dołkowych.
	<ol>
		<li>Oznaczyć zestaw płytek 96-dołkowych, jak pokazano w Tabeli 3, zarówno dla płytek TE 71 + A549, jak i płytek OVCAR3 + MDA-MB-231. Układ płyt będzie taki sam, jak pokazano w 4.1.3.</li>
		<li>Wysiewać 96-dołkowe płytki, jak wyjaśniono w sekcji 4.1, w tym samym układzie, jak pokazano w tabeli 2 w sekcji 4.1.2.</li>
		<li>Po upływie 24 godzin dodać nanocząstki do płytek, jak wyjaśniono w ppkt 4.1.4.</li>
		<li>24 godziny po dodaniu nanocząstek przemyj komórki 1x DPBS i dodaj 50 μl HBSS do każdej studzienki.</li>
		<li>Napromienić płytki odpowiednimi dawkami światła, jak wyjaśniono w ppkt 3.2.3.</li>
		<li>Zastąp HBSS 50 μl pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS i inkubuj płytki przez odpowiednie okresy czasu po PDT.</li>
		<li>Po każdym okresie czasu należy zmierzyć żywotność komórki, jak wyjaśniono w 4.2.1 i 4.2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Absorpcja nanocząstek
	<ol>
		<li>Włącz lampy mikroskopu i lasera na 30 minut przed obrazowaniem. Umieścić szalkę Petriego zawierającą utrwalone komórki (jak wyjaśniono w ppkt 3.1) na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Zbierz fluorescencję z nanocząstek i DAPI za pomocą filtrów, jak pokazano w Tabeli 4. Nałóż obrazy kontrastu fazowego, nanocząstek i DAPI w oprogramowaniu ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie ROS
	<ol>
		<li>Włącz lampy mikroskopu na 30 minut przed obrazowaniem. Umieścić szalkę Petriego zawierającą komórki (jak wyjaśniono w sekcji 3.2) na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Zbierz fluorescencję z nanocząstek, DAPI i odczynnika wykrywającego ROS za pomocą filtrów, jak pokazano w Tabeli 4. Nałóż na siebie kontrast fazowy, nanocząstki, DAPI i ROS wykrywające obrazy odczynników w oprogramowaniu ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Apoptoza i nekroza przez PI i aneksynę V FITC
	<ol>
		<li>Włącz lampy mikroskopu na 30 minut przed obrazowaniem. Umieścić szalkę Petriego zawierającą komórki (jak wyjaśniono w sekcji 3.3) na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Zbierz fluorescencję z nanocząstek, DAPI, PI i Annexin V FITC za pomocą filtrów, jak pokazano w tabeli 4. Nałóż obrazy kontrastu fazowego, nanocząstek, DAPI, PI i Annexin V FITC w oprogramowaniu ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for cancer.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).</li>
<li>Dougherty, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy.</a> J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).</li>
<li>Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanotechnology%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges.</a> Nat Rev Cancer. 5 (3), 161-171 (2005).</li>
<li>Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+apoptosis+in+response+to+photodynamic+therapy%3A+what%2C+where%2C+why%2C+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how.</a> Photochem Photobiol Sci. 1 (1), 1-21 (2002).</li>
<li>Ormond, A., Freeman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+Sensitizers+for+Photodynamic+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy.</a> Materials. 6 (3), 817-840 (2013).</li>
<li>Pass, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+Therapy+in+Oncology+-+Mechanisms+and+Clinical+Use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use.</a> J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).</li>
<li>Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+electron+transfer+from+a+conducting+polymer+to+buckminsterfullerene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene.</a> Science. 258 (5087), 1474-1476 (1992).</li>
<li>Sperandio, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+electron-transfer+mechanisms+for+radical-enhanced+photodynamic+therapy+mediated+by+water-soluble+decacationic+C-70+and+C84O2+Fullerene+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomed-Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives.</a> Nanomed-Nanotechnol. 9 (4), 570-579 (2013).</li>
<li>Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-Dispersible+Fullerene+Aggregates+as+a+Targeted+Anticancer+Prodrug+with+both+Chemo-+and+Photodynamic+Therapeutic+Actions%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions.</a> Small. 9 (4), 613-621 (2013).</li>
<li>Grynyuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+fullerene+C-60+disturbs+prooxidant-antioxidant+balance+in+leukemic+L1210+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Materialwiss+Werkstofftech%22%5BJournal%5D)">Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells.</a> Materialwiss Werkstofftech. 44 (2-3), 139-143 (2013).</li>
<li>Liu, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separately+doped+upconversion-C-60+nanoplatform+for+NIR+imaging-guided+photodynamic+therapy+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells.</a> Chem Commun. 49 (31), 3224-3226 (2013).</li>
<li>Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+pristine+versus+functionalized+fullerenes%3A+mechanisms+of+cell+damage+and+the+role+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress.</a> Arch Toxicol. 86 (12), 1809-1827 (2012).</li>
<li>Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Functionalized+Fullerenes+in+Tumor+Theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics.</a> Theranostics. 2 (3), 238-250 (2012).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+heterojunction+solar+cells+with+internal+quantum+efficiency+approaching+100%25%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%.</a> Nat Photonics. 3 (5), 297-302 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby osiągnąć absorpcję nanocząstek, konieczne było utrzymanie pewnych krytycznych środków podczas wytwarzania nanocząstek. Przygotowano 10-6 M roztwór MEH-PPV (zmieszany z 50% wag. PCBM) w THF do wstrzykiwania do wody DI, ponieważ zaobserwowano, że stężenie tego roztworu odgrywa ważną rolę w określaniu wielkości powstających nanocząstek. Stężenie sprawdzono za pomocą spektroskopii UV-vis. Należy zauważyć, że w kroku 2.1.3 protokołu konieczne było rozcieńczenie początkowo przygotowanego roztworu MEH-PPV (nieroz...

W terapii fotodynamicznej (PDT) fotosensybilizatory są podawane do tkanki docelowej, a po wystawieniu na działanie światła fotosensybilizator generuje reaktywne formy tlenu (ROS). Formy ROS, takie jak tlen singletowy i ponadtlenek, mogą indukować stres oksydacyjny, a następnie uszkodzenia strukturalne komórek i tkanek1-4. Ze względu na łatwość zastosowania metoda ta była aktywnie badana i przeprowadzono badania kliniczne5,6. Pozostają jednak istotne kwestie, takie jak ciemna toksyczność substancji uczulających, wrażliwość pacjenta na światło (ze względu na nieselektywną dystrybucję substancji uczulającej) oraz hydrofobowość substancji uczulających (co prowadzi do zmniejszonej biodostępności i potencjalnej toksyczności ostrej).
Tutaj przedstawiamy metodę wytwarzania i oceny in vitro przewodzących nanocząstek polimerowych zmieszanych z fulerenem jako fotosensybilizatorów nowej generacji dla PDT. Nanocząstki powstają w wyniku samoagregacji półprzewodnikowego polimeru MEH-PPV (poli[2-metoksy-5-(2-etyloheksylooksy)-1,4-fenylenwinylenu]) z fulerenowym PCBM (ester metylowy kwasu fenylo-C61-masłowego), gdy materiały te rozpuszczone w kompatybilnym rozpuszczalniku są szybko wstrzykiwane do niekompatybilnego rozpuszczalnika (rysunek 1A). Wybór MEH-PPV jako polimeru gospodarza jest motywowany jego wysokim współczynnikiem ekstynkcji, który prowadzi do wysokiego tempa tworzenia trypletów oraz zarówno wydajnego, jak i ultraszybkiego transferu ładunku i energii do fulerenu PCBM7. Właściwości te są idealne do uwrażliwiania tlenu singletowego i tworzenia ponadtlenków w PDT.
Fuleren został faktycznie zastosowany w PDT zarówno w postaci molekularnej, jak i nanocząsteczkowej8-13. Jednak ciężka cytotoksyczność zahamowała dalszy rozwój12. Tutaj pokazujemy, że zamknięcie fulerenu w matrycy gospodarza MEH-PPV w celu uzyskania kompozytowych nanocząstek MEH-PPV / PCBM skutkuje materiałem uczulającym PDT, który nie jest wewnętrznie cytotoksyczny, wykazuje specyficzność w stosunku do komórek rakowych ze względu na wielkość nanocząstek i ładunek powierzchniowy oraz daje wysoce skuteczne leczenie PDT przy niskich dawkach światła ze względu na wyżej wymienione właściwości fotofizyczne.

<table><tbody><tr><td>Poli[2-metoksy-5-(2-etyloheksylooksy)-1,4-fenylenwinylen] (MEH-PPV)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>536512-1G</td><td>średnia Mn&nbsp; 150 000-250 000</td></tr><tr><td>[6,6]-fenyl C61&nbsp; Ester metylowy kwasu masłowego (PCBM)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>684449-500MG</td>><td>99,5%</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>EMD</td><td>TX0284-6</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td> Drisolv 1 ml <td>National Scientific Company</td><td>37510-1</td><td>Do filtracji roztworu MEH-PPV</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>VWR</td><td>28145-495</td><td>25 mm, 0,2 i mikro; m,</td></tr><tr><td>strzykawka PTFE 1 ml</td><td>Hamilton Company</td><td>81320</td><td>Do wstrzykiwania roztworu MEH-PPV do wody w celu wytworzenia nanocząstek</td></tr><tr><td>Modyfikacja Dulbecco Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-350</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka bez czerwieni fenolowej (HBSS)</td><td>Jakość biologiczna (VWR)</td><td>10128-740</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco, 1x bez wapnia i magnezu (DPBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-436</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, regularna (inaktywowana termicznie) (FBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 1x 0,25%</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-664</td><td>Trypsyna/2,21 mM EDTA w HBSS bez wodorowęglanu sodu, wapnia i magnezu Testowany na parwowirus świń</td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>15710</td><td>16% paraformaldehydu rozcieńcza się do 4% przez dodanie PBS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>&nbsp; Biotium VWR</td><td>89139-054</td><td>Pipety do barwienia jądrowego</td></tr><tr><td>5 ml</td><td>VWR</td><td>82050-478</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>VWR</td><td>82050-771</td><td>do testów MTT</td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych z otworami wentylacyjnymi</td><td>Greiner Bio-One (VWR)</td><td>82050-538</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sondy molekularne</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A13199</td><td>barwnik do apoptozy</td></tr><tr><td>Celltiter 96 non-R 1000 testy</td><td>Promega (VWR)</td><td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td><td>MTT</td></tr><tr><td>CellROX Zielony odczynnik, do wykrywania stresu oksydacyjnego</td><td>Invitrogen</td><td>C10444</td><td>Dla ROS detekcja</td></tr><tr><td>Spektrometr UV-vis</td><td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr fluorescencyjny</td><td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamiczne rozpraszanie światła</td><td>PD2000DLS, Detektor</td><td></td><td></td>precyzyjny</tr><tr><td>Inkubator</td> Mikroskop konfokalny <td>NuAir DH Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Soczewka <td>obiektywu zanurzeniowego</td> <td>Zeiss Axioskop2</td><td></td> 63X</tr><tr><td>Mikroskop epiluminescencyjny</td><td>Olympus IX71</td><td></td><td>60X soczewka obiektywowa zanurzona w wodzie, Andor Zyla Kamera sCMOS</td></tr><tr><td>Symulator słoneczny Newport</td><td>67005 Oriel Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Referencyjne ogniwo słoneczne</td><td>Oriel&nbsp;</td><td></td><td>VLSI Standards Incorporated</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek Ex808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific Partnership</td><td>3200</td><td>Do liczenia komórek</td></tr></tbody></table>

terapia fotodynamiczna z mieszanymi fotouczulaczami z przewodzącego polimeru / fulerenu

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

W tym artykule opisano metodę wytwarzania i powtarzalnej oceny in vitro przewodzących nanocząstek polimerowych zmieszanych z fulerenem jako fotosensybilizatorów nowej generacji do terapii fotodynamicznej (PDT). Nanocząstki powstają w wyniku hydrofobowego oddziaływania półprzewodnikowego polimeru MEH-PPV (poli[2-metoksy-5-(2-etyloheksyloksylsy)-1,4-fenylenwinylenu]) z fulerenowym PCBM (ester metylowy kwasu fenylo-C61-masłowego) w obecności niekompatybilnego rozpuszczalnika. MEH-PPV ma wysoki współczynnik ekstynkcji, który prowadzi do wysokiego tempa tworzenia trypletów oraz wydajnego transferu ładunku i energii do fulerenowego PCBM. Te ostatnie procesy zwiększają wydajność systemu PDT poprzez wspomagane fulerenem tryplety i tworzenie rodników oraz ultraszybką dezaktywację wzbudzonego MEH-PPV. Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że ten nanocząsteczkowy system uwrażliwiający PDT jest wysoce skuteczny i wykazuje nieoczekiwaną specyficzność dla linii komórek rakowych.

Wchłanianie i cytotoksyczność wewnętrzna nanocząsteczek
Nanocząstki z blendy MEH-PPV/PCBM (50% wag.) inkubowano z liniami komórkowymi TE 71, MDA-MB-231, A549 i OVCAR3. Poziom domieszkowania PCBM ustalono na 50% wag. PCBM, co według wcześniejszych badań zapewnia optymalne właściwości przeniesienia ładunku i energii pomiędzy polimerami sprzężonymi a fulerenami14. Obrazy fluorescencyjne przedstawiające pobieranie nanocząstek ukazano na Rysunku 1B. Komórki inkubowano z ...

Ten protokół opisuje metodę wytwarzania przewodzących nanocząstek polimerowych zmieszanych z fulerenem. Nanocząstki te zostały zbadane pod kątem ich potencjalnego zastosowania jako fotouczulacze nowej generacji w terapii fotodynamicznej (PDT).

Terapia fotodynamiczna z mieszanymi fotouczulaczami z przewodzącego polimeru / fulerenu

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie nowej generacji fotouczulacza do zastosowań w terapii fotodynamicznej (PDT) w leczeniu nowotworów. Zostaje to osiągnięte poprzez adaptację metody wytwarzania przez wytrącanie w celu otrzymania wodnych dyspersji nanopartykul przewodzących polimerów. W drugim kroku nanopartykule są inkubowane z komórkami nowotworowymi in vitro, a następnie poddawane naświetlaniu w celu wygenerowania reaktywnych form tlenu (ROS), które są aktywnymi rodnikami uczestniczącymi w procesie PDT.Następnie skuteczność leczenia ocenia się za pomocą analiz ilościowych i obrazowania jakościowego, aby określić frakcje komórek żywych oraz komórek w stanie TED w populacji komórkowej. Wyniki wykazują, że agresywne nowotwory, takie jak rak jajnika, modelowany tutaj za pomocą OAR three, obficie pobierają nanocząsteczkowy fotouczulacz opisany w niniejszej pracy i że leczenie PDT jest wysoce skuteczne in vitro. W takim przypadku skuteczność PDT koreluje bezpośrednio z ilością nanocząsteczek pobranych przez poszczególne linie komórkowe.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak chemioterapia, radioterapia i chirurgia, jest możliwoś

photodynamic-therapy-with-blended-conducting-polymerfullerene

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. W tym filmie z protokołem metoda oparta na PDT jest stosowana do oceny potencjału fototoksycznego potencjalnego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc.

Test fototoksyczności in vitro: metoda oparta na PDT do oceny potencjału fototoksycznego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. Ten film opisuje analizę skuteczności przeciwnowotworowej in vivo przy użyciu fotouczulacza zawierającego nanocząstki u myszy z nowotworem, w celu określenia potencjału fototoksycznego fotouczulacza.

Analiza skuteczności przeciwnowotworowej PDT in vivo: technika określania potencjału fototoksycznego fotouczulacza u myszy z nowotworem

Organiczne cząsteczki barwnika i nanocząstki nanocząsteczkowe pokryte kwasem oleinowym nie są rozpuszczalne w wodzie. Protokół ten opisuje metodę "plug and play", która umożliwia przenoszenie cząsteczek barwnika organicznego i przekształcanie cząstek w górę z ich początkowego rozpuszczalnika hydrofobowego do wody.

Metoda "plug and play" do tworzenia dyspergowalnych w wodzie nanozespołów zawierających amfifilowy polimer, barwniki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę

Opisano metodę stymulacji aktywności elektrycznej kultur komórkowych in vitro za pomocą światła widzialnego, opartą na użyciu organicznych polimerów półprzewodnikowych.

Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Przedstawiono protokół syntezy i przygotowania nanocząstek składających się z elektroaktywnych polimerów.

Elektroaktywne nanocząstki polimerowe wykazujące właściwości fototermiczne

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest alternatywnym wyborem w leczeniu raka płuc. Aby zwiększyć efekt terapeutyczny PDT, opracowano nanocząstki ukierunkowane na raka płuc w połączeniu z chemioterapią. Oceniano zarówno skuteczność przeciwnowotworową PDT in vitro, jak i in vivo z przygotowanymi nanocząstkami.

Skuteczność przeciwnowotworowa terapii fotodynamicznej nanocząstkami ukierunkowanymi na raka płuc

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie zastosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy. Przedstawiamy protokół PDT in vitro przeznaczony do symulacji PDT, który może być wykorzystany do badania różnic w inkubacji PS i parametrach leczenia światłem.

Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej

Rosnąca częstość występowania lekoopornych Candida albicans jest poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) może stanowić strategię walki z lekoopornymi infekcjami grzybiczymi. Niniejszy protokół opisuje skuteczność aPDT za pośrednictwem Rose bengal na wielolekoopornym szczepie C. albicans in vitro.

Terapia fotodynamiczna za pośrednictwem róży bengalskiej w celu zahamowania Candida albicans

Tutaj opisujemy nowatorskie, proste i tanie urządzenie do skutecznego przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT) przy użyciu dwuwymiarowej hodowli komórek HeLa i werteporfiny jako fotosensybilizatora.

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D

Ten protokół opisuje wytwarzanie i charakterystykę fotoczułego nanozespołu barwnika prolekowego. Metodologia uwalniania leku z nanocząstek poprzez demontaż wyzwalany światłem, w tym układ napromieniania światłem, jest wyraźnie opisana. Leki uwalniane z nanocząstek w wyniku napromieniowania świetlnego wykazywały doskonałe działanie antyproliferacyjne na ludzkie komórki nowotworu jelita grubego.

Łatwe przygotowanie i fotoaktywacja nanozespołów prolek-barwnik

Poznaj metodę wytwarzania nanocząstek polimeru przewodzącego z fullerenem do fotodynamicznej terapii nowotworów. Technika ta generuje reaktywne formy tlenu w komórkach rakowych pod wpływem światła.

Terapia fotodynamiczna z mieszanymi fotouczulaczami z przewodzącego polimeru / fulerenu

Przeglądaj więcej filmów