Name: Zastosowanie biosensorów enzymatycznych do ilościowego oznaczania endogennego ATP lubH2O2w nerkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj zastosowanie biosensorów enzymatycznych do ilościowego oznaczania endogennego ATP i H₂O₂ w tkankach nerek. Ta metoda umożliwia badaczom pomiar sygnałów komórkowych w czasie rzeczywistym in vivo i ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy Sarissa Biomedical za ich pracę w rozwoju czujników użytych w niniejszym manuskrypcie. Badania te były wspierane przez granty Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) i HL 122662 (A. Staruschenko i A. Cowley), projekt finansowany przez Medical College of Wisconsin Research Affairs Committee #9306830 (O. Palygin) oraz Advancing a Healthier Wisconsin Research and Education Program #9520217, oraz Young Investigator Grant przyznany przez National Kidney Foundation (O. Palygin).

Następujące procedury dla zwierząt są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Uprzednią zgodę uzyskano od Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC). 
UWAGA: Review instrukcji producenta czujnika należy wykonać podczas projektowania eksperymentu i przed ich użyciem. Postępowanie zgodnie z tymi instrukcjami zapewni optymalne wyniki podczas korzystania z czujników.
1. Kalibracja czujnika
<ol>
	<li>Przygotować świeże roztwory podstawowe przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Utwórz bufor A zawierający 10 mM buforu NaPi, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2 i 2 mM glicerolu. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Przechowywać w temperaturze 2-8 °C.</li>
	<li>Używając podstawowego stężenia ATP (100 mM) przechowywanego w temperaturze -20 °C, utwórz świeży roztwór kalibracyjny 10 mM ATP, dodając 10 μl zapasu do 90 μl buforu A.</li>
	<li>Ponownie uwodnić czujnik ATP, umieszczając jego końcówkę (rysunek 2) w komorze do ponownego nawodnienia zawierającej bufor A na co najmniej 10 minut w temperaturze 2-8 °C. 
	UWAGA: Po ponownym nawodnieniu czujniki nie powinny być wystawione na działanie powietrza przez dłużej niż 20 sekund, w przeciwnym razie czułość czujnika może ulec zmniejszeniu. Jeśli przewiduje się długą ekspozycję na powietrze, zanurz czujnik na krótko w roztworze glicerolu. Czujniki mogą być używane do wielu eksperymentów, ale muszą one odbyć się tego samego dnia, co ponowne wypełnianie czujnika. Czujniki mogą być przechowywane w komorze hydratacji z buforem A do 24 godzin.</li>
	<li>Włącz potencjostat dwukanałowy (Rysunek 3) i uruchom oprogramowanie systemu nagrywania.</li>
	<li>Przygotować komorę kalibracyjną z 3 ml buforu A. Umieścić elektrodę odniesienia w komorze kalibracyjnej. Wyjmij każdy czujnik z komory nawadniania, a następnie podłącz go do manipulatora i włóż do roztworu komory kalibracyjnej. 
	UWAGA: Użyj standardowej szalki Petriego pokrytej silikonem jako komory kalibracyjnej. Wszystkie kalibracje i badania należy przeprowadzić w klatce Faradaya na wysokowydajnym laboratoryjnym stole powietrznym, aby zredukować szum sygnału podczas zapisów amperometrycznych (rysunek 4). Kalibracje najlepiej wykonywać jak najbliżej rozpoczęcia zbierania danych. W przypadku zastosowań in vivo optymalnym czasem na kalibrację jest okres rekonwalescencji zwierzęcia po operacji.</li>
	<li>Kalibracja ex vivo
	<ol>
		<li>Wykonaj woltamperometrię cykliczną w komorze kalibracyjnej, zmieniając przełączanie czujników od -500 mV do +500 mV z szybkością 100 mV/s przez 10 cykli. To znacznie poprawia czułość czujników. Na rysunku 5 przedstawiono ślady zaobserwowane w ciągu 10 cykli.</li>
		<li>Spolaryzuj czujniki na +600 mV po ostatnim cyklu. Prąd czujnika zaniknie do asymptoty. Stały odczyt uzyskuje się po minimum 5 minutach. Zapisz odczyt zerowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja czujnika in vivo
	<ol>
		<li>Nie wykonuj cyklicznej woltamperometrii na czujnikach in vivo. Zamiast tego spolaryzuj czujnik w komorze kalibracyjnej na 30 sekund do +500 mV. Następnie ustaw potencjostat na 0 mV i pozwól, aby prąd czujnika wzrósł do asymptoty. Prąd czujnika zajmie co najmniej 2 minuty do asymptoty. Zapisz odczyt zerowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolejno dodawaj do komory określone ilości roztworu ATP, aby uzyskać linię kalibracyjną obejmującą żądany zakres wykrywania. Roztwór ATP początkowo wytwarza ostry pik w sygnale czujnika, po którym następuje zanik, gdy ATP rozchodzi się równomiernie w całej komorze. Rejestruj wartości sygnału, gdy poziom sygnału ustabilizuje się po każdym dodaniu ATP. Ryciny 6A i 7 pokazują śladowe i sugerowane stężenia ATP zarówno dla badań ex vivo, jak i in vivo. 
	UWAGA: Ważne jest, aby potwierdzić selektywność elektrod za pomocą zmiataczy analitów. W obecnym protokole wykorzystano apirazę do zbadania specyficzności czujnika ATP i katalazy dla sygnałuH2O2(ryc. 6B). Jeśli mają być podawane leki, przed badaniem należy ustalić pomiary ich reaktywności za pomocą czujników.</li>
	<li>Dodać 3 μl apirazy z zapasu 2 mg/ml (89 UN/mg) w celu zbadania swoistości czujnika ATP (prąd wytwarzany przez aplikację ATP powinien spaść do poziomu zerowego (rysunek 7).</li>
	<li>Dodać 3 μl katalazy z zapasu 2 mg/ml (100 UN/mg) w celu zbadania swoistości czujnika zerowego (prąd wytwarzany przez aplikacjęH2O2powinien spaść do odczytu zerowego).</li>
</ol>
2. Chirurgia zwierząt w badaniach sensorycznych
<ol>
	<li>Chirurgia ex vivo
	<ol>
		<li>Znieczulić zwierzę doświadczalne izofluranem (5% indukcji, 1,5 do 2,5% konserwacji) / klasy medycznejO2 lub inną zatwierdzoną metodą. 15' 12 Zwierzęta muszą być stale monitorowane w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu znieczulenia. Stabilna częstość oddechów i reakcja na szczypanie palców u nóg służą do potwierdzenia prawidłowego znieczulenia. 
		Uwaga: Zwierzę należy poddać eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC. Po zakończeniu wszystkich procedur niezapewniających przeżycia należy poddać eutanazji głęboko znieczulone zwierzęta poprzez torakotomię wywołującą odmę opłucnową, aby zapewnić humanitarną śmierć zwierzęcia12.</li>
		<li>Umieść szczura na stole chirurgicznym z kontrolowaną temperaturą w pozycji leżącej. Zachowując odpowiednią głębokość znieczulenia, należy wykonać nacięcie w linii środkowej o długości około 5 cm w linii z lewą nerką i odsłonić dystalną aortę brzuszną.</li>
		<li>Owiń ligaturę wokół trzewnej i górnej tętnicy krezkowej oraz aorty brzusznej powyżej tych tętnic, ale nie podwiązuj. Owiń dwie ligatury wokół aorty brzusznej poniżej tętnic nerkowych.</li>
		<li>Zacisnąć aortę brzuszną powyżej ligatur. Zawiąż dolną ligaturę. Cewnikować aortę brzuszną za pomocą rurki polietylenowej (PE50). Zabezpiecz cewnik drugą ligaturą aorty.</li>
		<li>Zdejmij zacisk i podwiąż tętnice krezkowe i trzewne. Ukrwić nerkę w dawce 6 ml/min zrównoważonym roztworem soli Hanksa w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty, aż nerka zostanie całkowicie zblanszowana.</li>
		<li>Wyciąć nerkę i cewnik, połączoną część aorty. Umieścić nerkę na szalce Petriego o pojemności 3 ml wypełnionej roztworem do kąpieli. 
		Uwaga: Protokół eksperymentu można przeprowadzić w RT. Roztwór do kąpieli zawiera w mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH 7,35 skorygowane NaOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chirurgia in vivo
	<ol>
		<li>Znieczulij szczura przy użyciu zatwierdzonych protokołów IACUC. Do analizy in vivo znieczulić szczury ketaminą (20 mg/kg i.m.) i inaktyną (50 mg/kg i.p.). Zwierzęta muszą być stale monitorowane w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu znieczulenia. Stabilna częstość oddechów i reakcja na uszczypnięcie palca u nogi są stosowane w celu potwierdzenia prawidłowego znieczulenia.</li>
		<li>Po uzyskaniu odpowiedniej głębokości znieczulenia umieść szczura w pozycji leżącej na uziemionej powierzchni o kontrolowanej temperaturze znajdującej się na stole powietrznym. Powierzchnię należy wstępnie podgrzać i utrzymywać w temperaturze 36 °C.</li>
		<li>Zachowując odpowiednią głębokość znieczulenia, należy wykonać nacięcie w linii środkowej około 5 cm w linii nerki.</li>
		<li>Użyj szwu, aby odchylić i zakotwiczyć tkankę skórną i podskórną tak, aby widoczna była cała nerka. Umieść nerkę w miseczce nerkowej, aby zminimalizować wszelkie artefakty ruchowe.</li>
		<li>Stosować wlew dożylny 2% BSA: 0,9% NaCl w dawce 1 ml/100 g/h przez żyłę szyjną, aby utrzymać objętość krwi. Kanulokować oba moczowody do zbierania moczu. Umieść opaski wokół tętnic krezkowych górnych i trzewnych oraz dystalnej aorty w celu manipulacji ciśnieniem perfuzji nerkowej (ryc. 10A).</li>
		<li>Jeśli podczas eksperymentów in vivo wymagane jest zastosowanie środków farmakologicznych, zaleca się wprowadzenie cewnika śródmiąższowego (ryc. 10B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustawienia akwizycji danych
<ol>
	<li>Otwórz program do akwizycji danych i ustaw jego polaryzację zarówno dla eksperymentów ex vivo, jak i in vivo na Anodic Positive. Ustaw program tak, aby zapisywał dane jako kod ASCII.</li>
	<li>Ustaw mikromanipulatory tak, aby szybko wprowadzić czujniki do nerek. 
	UWAGA: Alternatywnie użyj atrapy sondy dołączonej do mikromanipulatora, aby uzyskać pożądane rozmieszczenie czujników.</li>
	<li>Akwizycja danych ex vivo
	<ol>
		<li>Wykonać perfuzję nerki roztworem do kąpieli (z 2.1.6) przez kaniulowaną aortę ze stałą szybkością 650 μl/min. Za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie usunąć torebkę nerkową, która jest niezbędna do wprowadzenia czujnika.</li>
		<li>Zabezpiecz nerkę gumowymi opaskami przymocowanymi do nerki i przymocowanymi do naczynia pokrytego silikonem za pomocą szpilek.</li>
		<li>Umieścić elektrodę odniesienia blisko nerki na szalce Petriego, tak aby jej końcówka była zanurzona w roztworze buforowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja danych in vivo
	<ol>
		<li>Umieść nerkę w miseczce nerkowej. W zależności od odmiany i wieku zwierzęcia należy używać miseczki o rozmiarze luźno trzymającej nerkę. Rycina 8 przedstawia dwa rozmiary miseczek nerkowych. Podobne bańki są używane do różnych podejść fizjologicznych skoncentrowanych na analizie funkcji nerek, takich jak mikronakłucie itp.16, 
		Uwaga: Pozycja miseczki nerkowej ma kluczowe znaczenie dla usunięcia mechanicznego hałasu wytwarzanego przez oddychanie zwierzęcia, ale nie powinna zakłócać ani blokować perfuzji nerek lub przepływu moczu.</li>
		<li>Odczekaj 45 minut czasu odzyskiwania przed rozpoczęciem zbierania danych.</li>
		<li>Za pomocą igły 26-30G wykonaj otwór do nakłucia w żądanym miejscu i na głębokości czujnika w nerce. Osusz otwór na powierzchni, aby usunąć wysięk krwi. Dodaj roztwór glicerolu na powierzchnię nerki. Zapobiegnie to wysychaniu powierzchni nerki podczas eksperymentu.</li>
		<li>Wyjmij pierwszy czujnik z komory nawadniania i przymocuj go do mikromanipulatora. Szybko, w ciągu 20 sekund, włóż elektrodę do świeżo utworzonego otworu w nerce. Powtórz kroki 3,5-3,9 dla czujnika wartości null.</li>
		<li>Włożyć elektrodę referencyjną do nerki, w odległości około 1 cm od czujników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz potencjostat i aktywuj program nagrywający na komputerze. Rycina 9 przedstawia ostateczną konfigurację akwizycji danych ex vivo nerek. Rycina 10 przedstawia ostateczną konfigurację pozyskiwania danych nerek in vivo z wprowadzonym cewnikiem.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Zaimportuj plik danych ASCII do Origin lub innego podobnego oprogramowania.</li>
	<li>Zależność prądu koncentracji
	<ol>
		<li>Użyj funkcji dopasowania liniowego/ekstrapolacji, aby zbudować liniową zależność stężenia (oś x) do prądu (oś y) dla punktów kalibracji ATP lubH2O2 (rysunki 6 i 7). 
		Liniowa linia dopasowania: Y = Mx + B</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrównaj prąd ze stężeniem</li>
	<li>Odejmij zmierzone ślady czujnika zerowego od ścieżek czujnika ATP, aby uzyskać rzeczywisty prąd wytwarzany przez wewnątrzkomórkowe ATP.</li>
	<li>Przeliczyć wartości ATP w pA uzyskane metodą amperometrii na nM, stosując równanie kalibracyjne wyszczególnione w ppkt 4.2.1. Określ stężenie odjętego śladu danych czujnika ATP, importując każdy skorygowany prąd do wartości "x" i rozwiązując dla y (stężenie analitu).</li>
	<li>Podobnie, w razie potrzeby oblicz stężenieH2O2z równania kalibracyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li>
<li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li>
<li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li>
<li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li>
<li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices%3A+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li>
<li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger%2C+H2O2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li>
<li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li>
<li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747(2014).</li>
<li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+depolarization+evokes+ATP%2C+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus%3A+a+microelectrode+biosensor+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li>
<li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes%3A+potential+roles+in+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li>
<li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats%3A+role+in+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li>
<li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li>
<li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1(2014).</li>
<li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+electrode+biosensors%3A+theory+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem+Anal%22%5BJournal%5D)">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li>
<li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li>
<li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li>
<li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li>
<li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li>
<li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly%28pyrrole-ammonium%29+and+poly%28pyrrole-lactobionamide%29+films+as+host+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li>
<li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li>
<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li>
<li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li>
</ol>

Czujniki do nagrania wideo tego manuskryptu zostały dostarczone przez Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Wielka Brytania).

Obecne protokoły zostały opracowane w celu zapewnienia zwiększonej rozdzielczości czasowej i przestrzennej sygnalizacji ATP iH2O2 dla nerek izolowanych, perfundowanych i perfundowanych in vivo krwią. Różnice między zastosowanymi tutaj protokołami i czujnikami zapewniają optymalne pozyskiwanie danych zarówno dla środków farmakologicznych, jak i badań fizjologicznych. Protokoły składają się z 1) kalibracji czujnika, 2) zabiegu chirurgicznego, 3) konfiguracji akwizycji danych i 4) ana...

Enzymatyczne biosensory mikroelektrodowe (również określane jako czujniki w niniejszym manuskrypcie) były cennym narzędziem do badania dynamicznych procesów sygnalizacyjnych w żywych komórkach i tkankach. Czujniki zapewniają zwiększoną rozdzielczość czasową i przestrzenną komórkowych cząsteczek sygnalizacyjnych w biologicznie istotnych stężeniach. Zamiast pobierać próbki i analizować płyny pozakomórkowe pobierane w odstępach czasu przez długi czas, czujniki te reagują tak szybko, jak ich enzymy reagują na analit, zapewniając w ten sposób pomiary w czasie rzeczywistym1,2. Szybkie wykrywanie śródmiąższowych stężeń czynników autokrynnych i parakrynnych, takich jak puryny lub nadtlenek wodoru, oraz dynamika ich uwalniania mogą być wykorzystane do ustalenia profilu działania leków w warunkach normalnych i patologicznych 3. Obecnie większość zastosowań wykorzystujących czujniki dotyczy wycinków tkanki mózgowej i kultur komórkowych4-10. Protokoły szczegółowo opisane w tym manuskrypcie mają na celu ustalenie środków do dokładnego pomiaru stężeń analitów w czasie rzeczywistym w całych nerkach.
Następujące protokoły zostały opracowane do badania śródmiąższowej sygnalizacji ATP i H2O2 w nerkach. W natywnym środowisku nerek zewnątrzkomórkowe ATP jest szybko katabolizowane przez endogenne ektonukleotydazy do swoich pochodnych (ADP, AMP i adenozyny). Zastosowane tutaj czujniki są wysoce selektywne w stosunku do ATP w stosunku do innych puryn lub produktów degradacji ATP11. Jest to ogromna zaleta, ponieważ umożliwia dokładne monitorowanie stałych i dynamicznych stężeń uwalniania ATP oraz jego funkcji sygnalizacyjnej. Śródmiąższowe stężenie ATP mierzy się za pomocą kombinacji dwóch mikroelektrod, czujnika ATP i czujnika Null. Czujnik Null w połączeniu z aplikacjami katalazy jest w stanie wykryć śródmiąższowe stężeniaH2O2 12. W poniższych protokołach zastosowano dwie różne konstrukcje czujników, które mają charakterystykę optymalną dla zastosowań ex vivo lub in vivo.
Oba projekty opierają się na sekwencyjnej reakcji katalitycznej kinazy glicerolowej i oksydazy glicero-3-fosforanowej zawartych w warstwie enzymatycznej czujnika i są napędzane przez obecność ATP. W zestawie czujników stosowanych w badaniach ex vivo,H2O2, końcowy produkt reakcji enzymatycznej, jest wykrywany przez utlenianie na elektrodzie drutowej platynowo-irydowej (Pt-Ir). Czujniki do badań in vivo opierają się natomiast na redukcjiH2O2na złotej elektrodzie pokrytej mediatorem, przeznaczonej do tkanek perfundowanych krwią. Na rysunku 1 przedstawiono schemat obu protokołów opisanych w tym manuskrypcie. Czujnik Null jest identyczny z odpowiadającym mu czujnikiem ATP, z wyjątkiem tego, że nie ma związanych enzymów. Dlatego oprócz wykrywaniaH2O2 za pomocą enzymu katalazy, czujnik Null mierzy zakłócenia niespecyficzne. Stężenia ATP oblicza się, odejmując od sygnału czujnika ATP wykryte zakłócenia niespecyficzne Null i tłoH2O2. Na rynku dostępnych jest również kilka czujników do wykrywania innych analitów, w tym adenozyny, jonozyny, hipoksantyny, acetylocholiny, choliny, glutaminianu, glukozy, mleczanu, d-seryny do zastosowań ex vivo lub adenozyny, jonozyny i hipoksantyny do in vivo w połączeniu z odpowiednim czujnikiem Null.
Zdolność czujnika do dokładnego wykrywania analitów zależy od prawidłowych kalibracji wstępnych i końcowych13. Gwarantuje to, że analiza uwzględnia dryft czułości czujnika, który występuje podczas stosowania w tkankach biologicznych. W czujniku znajduje się zapas glicerolu, który jest używany jako odczynnik w reakcjach enzymatycznych czujnika. Jeśli czujnik nie jest używany w roztworach do kąpieli zawierających glicerol, z czasem zostanie wypłukany. Krótsze czasy nagrywania są wtedy konieczne, aby zminimalizować dryft czujnika. Ponadto zanieczyszczenie czujników przez endogenne proteazy i fragmenty białek może znacznie zmniejszyć czułość czujników14.
Niniejszy manuskrypt ustanawia użycie enzymatycznych biosensorów mikroelektrodowych do preparatów nerek ex vivo i in vivo. Kwantyfikacja analitów w czasie rzeczywistym dostarcza bezprecedensowych szczegółów sygnalizacji komórkowej, które mogą ujawnić nowe informacje na temat mechanizmów chorób nerek i czynników farmakologicznych.

<table><tbody><tr><td>Zestaw</td><td>czujników Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>Zestaw zawiera butelkę do przechowywania, komorę nawadniającą, przewody elektrod i elektrody referencyjne. W zestawie znajduje się również wybór czujników przez użytkownika.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>przechowywać w temperaturze 2-8 oC przed użyciem</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>przechowywać w temperaturze 2-8 oC przed użyciem</td></tr><tr><td>Sarissaprobe null sensor 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>przechowywać w temperaturze 2-8 oC przed użyciem</td></tr><tr><td>Sarissagold null sensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>przechowywać w temperaturze 2-8 oC przed użyciem</td></tr><tr><td>Instrukcja obsługi Sarissaprobe ATP</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwukanałowy potencjostat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Typ II Klatka Faradaya</td></tr><tr><td>Program do akwizycji danych</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz światłowodowy</td><td>Mikromanipulator Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator stojak magnetyczny</td> stół powietrzny <td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>wentylator izofluranowy</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>igła</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>szpilki</td><td></td><td></td><td>do rozwarstwiania Standardowe szpilki preparacyjne</td></tr><tr><td>cewnik</td><td></td><td></td><td>Rurka polietylenowa (PE50)</td></tr> <tr><td>cewnik klej tkankowy</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>szew</td><td>Wygląd</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>gumki</td><td></td><td></td><td>dowolne gumki o szerokości 2-4 mm</td></tr><tr><td>silikonowe</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr>standardowy zestaw <td></td><td></td><td>do preparacji</td><td>Zestaw powinien zawierać skalpel i sissory do sekcji&nbsp;</td></tr><tr><td>Miseczka</td><td></td><td></td> nerkowa <td>Własnego projektu</td></tr><tr><td>standardowe chemikalia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM roztwór ATP</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>izofluranowa</td><td>maszynka do strzyżenia</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inaktyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>maszynka do strzyżenia</td><td>ketaminy</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie biosensorów enzymatycznych do ilościowego oznaczania endogennego atp lubh2o2w nerkach

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatyczne biosensory mikroelektrodowe są powszechnie używane do pomiaru sygnalizacji zewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym. Większość ich zastosowania ogranicza się do wycinków mózgu i kultur komórek neuronalnych. Ostatnio technologia ta została zastosowana do całych narządów. Postępy w projektowaniu czujników umożliwiły pomiar sygnalizacji komórkowej w nerkach z perfuzją krwi in vivo. Niniejsze protokoły wymieniają kroki potrzebne do pomiaru sygnalizacji ATP i H2O2 w śródmiąższu nerki szczura. W protokołach ex vivo i in vivo stosowane są dwie oddzielne konstrukcje czujników. Oba typy czujników są pokryte cienką enzymatyczną biowarstwą na warstwie permselektywności, aby zapewnić szybko reagujące, czułe i selektywne bioczujniki. Warstwa permselektywności chroni sygnał przed zakłóceniami w tkance biologicznej, a warstwa enzymatyczna wykorzystuje sekwencyjną reakcję katalityczną kinazy glicerolowej i oksydazy glicerolowo-3-fosforanowej w obecności ATP do produkcji H2O2. Zestaw czujników wykorzystanych do badań ex vivo wykrył ponadto analit poprzez utlenianieH2O2na elektrodzie drutowo-platynowo-irydowej (Pt-Ir). Czujniki do badań in vivo opierają się natomiast na redukcjiH2O2na złotej elektrodzie pokrytej mediatorem, przeznaczonej do tkanek perfundowanych krwią. Końcowe stężenie zmiany są wykrywane przez amperometrię w czasie rzeczywistym, a następnie kalibrację do znanych stężeń analitu. Dodatkowo specyficzność sygnału amperometrycznego można potwierdzić poprzez dodanie enzymów, takich jak katalaza i apiraza, które odpowiednio rozkładająH2O2i ATP. Czujniki te również w dużym stopniu opierają się na dokładnych kalibracjach przed i po każdym eksperymencie. Poniższe dwa protokoły ustanawiają badanie wykrywania ATP iH2Ow czasie rzeczywistym w tkankach nerek i mogą być dalej modyfikowane w celu rozszerzenia opisanej metody do stosowania w innych preparatach biologicznych lub całych narządach.

Konstrukcja enzymatycznego biosensora mikroelektrodowego umożliwia detekcję analitych w czasie rzeczywistym w całych nerkach. Ogólny schemat eksperymentu dla badań ex vivo lub in vivo przedstawiono na Rysunku 1. Stosowane sensory oraz procedury chirurgiczne różnią się w zależności od tego, czy badanie jest prowadzone ex vivo, czy in vivo.
Aby uzyskać powtarzalne wyniki, kluczowe jest przeprowadzenie dokładnych kalibracji przed i po ...

Enzymatyczne biosensory mikroelektrodowe umożliwiają pomiary w czasie rzeczywistym zewnątrzkomórkowej sygnalizacji komórkowej w biologicznie istotnych stężeniach. Poniższe protokoły rozszerzają zastosowania bioczujników na wykrywanie ex vivo i in vivo ATP iH2O2w nerkach.

Zastosowanie biosensorów enzymatycznych do ilościowego oznaczania endogennego ATP lubH2O2w nerkach

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Ogólnym celem opisanych procedur jest pomiar w czasie rzeczywistym endogennych stężeń śródmiąższowych TP oraz nadtlenku wodoru w całych nerkach. Osiągnięto to poprzez uprzednią rehydratację i kalibrację czujników do zastosowań ex vivo i in vivo przy znanych stężeniach TP oraz nadtlenku wodoru. W przypadku instalacji czujników ex vivo, nerka została poddana instrumentacji chirurgicznej i oczyszczona z krwi.Procedurę tę wykonuje się poprzez przepłukanie nerki przez aortę. Następnie nerka szczura jest izolowana chirurgicznie, umieszczana w komorze rejestracyjnej i perfundowana solą fizjologiczną. W procedurze in vivo TP oraz nadtlenek wodoru są mierzone przy użyciu czujników ex vivo.Wykonuje się nacięcie, aby umożliwić wizualizację ukrwionej nerki. Nerkę umieszcza się w specjalnej nasadce stabilizującej, a następnie można zainstalować cewnik śródmiąższowy do aplikacji leków. Dalsze pomiary stężeń ATP i nadtlenku wodoru w śródmiąższu nerek są przeprowadzane przy użyciu sensorów in vivo.Ostatecznie protokoły te umożliwiają wykorzystanie enzymatycznych biosensorów mikroelektrodowych do pomiarów TP i nadtlenku wodoru w czasie rzeczywistym w przestrzeni śródmiąższowej nerek. Główną zaletą biosensorów enzymatycznych jest ich zdolność do bezpośredniego pomiaru endogennych stężeń śródmiąższowych w tkankach biologicznych. W niniejszym opracowaniu technologia ta została wykorzystana do wykrywania stężeń TP i nadtlenku wodoru w śródmiąższu izolowanej nerki perfundowanej solą fizjologiczną lub in vivo.Precyzja biosensorów enzymatycznych umożliwia pomiary w czasie rzeczywistym podstawowej i dynamicznej regulacji stężeń zewnątrzkomórkowego ATP lub nadtlenku wodoru. Pomiary te pozwalają określić profile działania leków lub przebiegu choroby w odrębnych funkcjonalnie obszarach nerek. Nawodnij oba sensory – ATP oraz kontrolny (null) – umieszczając ich końcówki w osobnych komorach nawadniających zawierających bufor A przez co najmniej 10 minut w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.Włącz dwukanałowy potencjostat POTENTIA i uruchom oprogramowanie systemu rejestracyjnego. Skonfiguruj program tak, aby zapisywał dane w kodzie A-S-C-I-I, a polaryzację czujnika ustaw na dodatnią anodową. Przygotuj komorę kalibracyjną z trzema mililitrami buforu, a następnie zanurz elektrodę odniesienia w komorze.Wyjąć każdy czujnik z roztworu rehydratacyjnego. Przymocować je do mikromanipulatorów i wprowadzić do roztworu w komorze kalibracyjnej. Wszystkie kalibracje i badania należy przeprowadzić w klatce Faradaya na wysokiej klasy laboratoryjnym stole pneumatycznym w celu zredukowania szumów sygnału.Podczas pomiarów pyrometrycznych przeprowadź cykliczną telemetrię napięciową dla czujników ex vivo w komorze kalibracyjnej. Poprzez cykliczne zmianianie napięcia na czujnikach od -500 mV do +500 mV z szybkością 100 mV/s przez 10 cykli, co znacząco poprawia czułość czujników, spolaryzuj czujniki do poziomu +600 mV.Po ostatnim cyklu prąd czujnika spadnie do poziomu bazowego. Odczyt stabilny uzyskuje się po upływie co najmniej pięciu minut. Należy zarejestrować odczyt zerowy, a następnie sukcesywnie dodawać określone ilości roztworu ATP do komory, aby stworzyć krzywą kalibracyjną obejmującą pożądany zakres detekcji czujnika ATP.Roztwór A TP wywoła początkowo ostry pik sygnału w czujniku, po którym nastąpi spadek w miarę równomiernego dyfundowania A TP w całej komorze. Wartości sygnału należy zarejestrować po ustabilizowaniu się poziomu sygnału. Przy każdym dodawaniu A TP, należy dodać trzy µL z roztworu zapasowego o stężeniu dwóch mg/mL, aby przetestować swoistość czujnika A TP.Prąd generowany przez aplikację TP powinien spadać do poziomu zerowego po kolejnym dodawaniu określonych ilości roztworu nadtlenku wodoru do komory w celu utworzenia linii kalibracyjnej obejmującej zakres detekcji; wartości sygnału zerowego sensora należy zapisać po ustabilizowaniu się poziomu sygnału. Przy każdym dodaniu nadtlenku wodoru należy dodać 3 µL cattle lace ze stoku o stężeniu 2 mg/mL, aby przetestować specyficzność sensora zerowego. Prąd generowany przez aplikację nadtlenku wodoru powinien spadać do odczytu zerowego w badaniach ex vivo.Wykonać podwiązanie wokół tętnicy trzewnej, tętnicy krezkowej górnej oraz aorty brzusznej powyżej tych tętnic. Nie podwiązywać jednak w tym miejscu; należy wykonać dwa podwiązania wokół aorty brzusznej poniżej tętnicy nerkowej. Podwiązać aortę brzuszną dystalnie poniżej tętnicy nerkowej.Zaciśnij aortę klamrą co najmniej jeden centymetr powyżej podwiązania i poniżej tętnicy nerkowej. Wprowadź cewnik z rurki polietylenowej do aorty brzusznej w przestrzeni między najniższym podwiązaniem a klamrą. Zabezpiecz cewnik drugim podwiązaniem aorty.Zdejmij zacisk i podwiąż tętnice krezkowe i trzewne oraz aortę powyżej tych tętnic. Płucz nerkę z prędkością 6 ml/min roztworem soli Hank'a w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut, aż nerka stanie się całkowicie blada. Dodatkowo można wprowadzić cewnik do żyły nerkowej w celu zbierania płynu odpływowego.Używając pęsety chirurgicznej, ostrożnie usuń torebkę nerkową, co jest niezbędne do wprowadzenia czujnika. Wycięcie nerki powinno obejmować fragment aorty z podłączonym cewnikiem. Umieść nerkę w szalce Petriego o pojemności trzech mililitrów wypełnionej roztworem kąpielowym.Przepłucz nerkę roztworem kąpielowym przez kaniulowaną aortę ze stałą prędkością 650 microliters per minute. Unieruchom nerkę za pomocą gumek recepturek przymocowanych nad nerką i przypiętych do pokrytej silikonem płytki za pomocą pinsetów. Umieść elektrodę odniesienia w pobliżu nerki w szalce Petriego, tak aby jej końcówki były zanurzone w roztworze kąpielowym.Ustaw mikromanipulatory w sposób umożliwiający szybkie wprowadzenie sensorów do nerki. Alternatywnie można użyć atrapy sondy przymocowanej do każdego mikromanipulatora, aby pomóc w uzyskaniu pożądanego rozmieszczenia każdego sensora, przy czym czynność ta nie powinna trwać dłużej niż 20 sekund. Wyjmij sensor z komory rehydratacyjnej, przymocuj go do mikromanipulatora i zanurz sensor w roztworze kąpieli w naczyniu.Jeśli przewiduje się dłuższy czas ekspozycji na powietrze, należy krótko zanurzyć czujnik w roztworze glicerolu przed każdym pomiarem. Spolaryzuj czujniki za pomocą potencjostatu do wartości +600 mV i poczekaj, aż prąd osiągnie stabilny poziom. Wprowadź każdy czujnik na tę samą głębokość w nerkę.Przeprowadź analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym. Konstrukcja enzymatycznego biosensora z mikroelektrodą umożliwia detekcję analitów oraz całych nerek w czasie rzeczywistym w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Precyzyjna kalibracja przed i po pomiarach jest krytyczna.Rysunek ten przedstawia reprezentatywny zapis sygnału generowanego przez X pvo, TP oraz czujniki null podczas kalibracji czujnika TP. Procedura kalibracji pozwala na wyznaczenie dopasowania liniowego, które jest wykorzystywane do obliczania dynamicznych zmian TP. Kalibracja czujnika null odbywa się poprzez dodawanie znanych stężeń nadtlenku wodoru do roztworu kąpieli, a następnie rejestrowane są wartości parametryczne asim do am. Dodanie katalizatorów do roztworu kąpieli powoduje szybki spadek prądu.Sensor in vivo generuje podobny zapis, jednak wykrywa prądy redukcyjne zamiast utleniających, w związku z czym prąd ma wartość ujemną. Kalibracja również daje dopasowanie liniowe w zakresie od 0.3 do 80 µM. Przedstawiono tutaj swoistość sensora in vivo względem TP w porównaniu z innymi produktami purynowymi. Na tej rycinie zademonstrowano indukowane przez angiotensynę II zmiany stężenia endogennego nadtlenku wodoru w przestrzeni śródmiąższowej w świeżo wyizolowanych nerkach szczurów odpornych i wrażliwych na sól.Angiotensyna II indukuje gwałtowny wyrzut nadtlenku wodoru z obu nerek. Jednakże maksymalne amplitudy były znacząco wyższe w nerkach szczurów wrażliwych na sól, szczególnie przy stosowaniu diety bogatej w sól. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że końcówka czujnika oraz powierzchnia kory nerek są delikatne i w związku z tym uszkodzenie którejkolwiek z nich upośledzi dokładność pomiarów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru substancji endogennych oraz całych organów, takich jak nerka. Będą Państwo również w stanie precyzyjnie przeprowadzić kalibracje oraz procedury chirurgiczne niezbędne do pomyślnego wykonania pomiarów. Metodę tę zastosowaliśmy do badania podstawowych poziomów TP oraz nadtlenku wodoru w nerce, a także ich uwalniania.Jednakże to samo podejście można zastosować do wyznaczania stężeń adenozyny, glutaminianu, glukozy i niektórych innych substancji, pod warunkiem zastosowania odpowiednich sensorów.

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Opisujemy użycie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych biosensorów, które są oparte na GFP, do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży.

Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży

Tutaj opisujemy testy biochemiczne, które mogą być użyte do scharakteryzowania zależnych od ATP enzymów przebudowujących chromatynę pod kątem ich zdolności do 1) katalizowania przesuwania się nukleosomów zależnych od ATP, 2) angażowania się w substraty nukleosomów i 3) hydrolizy ATP w sposób zależny od nukleosomu lub DNA.

Testy biochemiczne do analizy aktywności enzymów remodelujących chromatynę zależnych od ATP

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Proteazy są ściśle regulowanymi enzymami zaangażowanymi w podstawowe procesy biologiczne, a rozregulowana aktywność proteazy napędza postęp złożonych chorób, takich jak rak. Celem tej metody jest stworzenie nanoczujników, które mierzą aktywność proteazy in vivo, wytwarzając sygnał rozszczepienia, który jest wykrywalny w moczu gospodarza i dyskryminuje chorobę.

Nanoczujniki do wykrywania aktywności proteazy in vivo w diagnostyce nieinwazyjnej

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz został opracowany do pomiaru aktywności proteaz metodą fluorometrii. Nadaje się on również do wykrywania śladowych ilości zanieczyszczeń proteazami. Metoda opiera się na proteolitycznej hydrolizie opatentowanej formulacji substratu kazeinowego znakowanego FITC.

Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Poznaj zastosowanie biosensorów enzymatycznych do ilościowego oznaczania endogennego ATP i H₂O₂ w tkankach nerek. Ta metoda umożliwia badaczom pomiar sygnałów komórkowych w czasie rzeczywistym in vivo i ex vivo.

Zastosowanie biosensorów enzymatycznych do ilościowego oznaczania endogennego ATP lub_H2O2w nerkach

Przeglądaj więcej filmów