Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne
September 18th, 2015
Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie wycinka korowego Calot Thal z czterema głównymi strukturami słuchowymi: okrężnicą dolną, wzgórzem słuchowym, częścią słuchową jądra siatkowatego wzgórza i korą słuchową. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie mózgu z myszy. Drugim krokiem jest zablokowanie mózgu w ramach przygotowań do krojenia.
Następnie wytnij mózg, aby uzyskać plasterki zawierające połączenie korowe Calot thal. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie obrazowania flawoprotein do oceny łączności. Ostatecznie wycinek mózgu zawierający połączenie kory szyjnej może być wykorzystany do różnych eksperymentów, aby lepiej zrozumieć przetwarzanie informacji w obszarach słuchowych środkowego i czwartego mózgu Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki blokowania mózgu przed krojeniem są trudne do nauczenia, ponieważ wymaga złożonego cięcia pod podwójnym kątem, co jest kluczem do uzyskania nienaruszonych projekcji.
Technikę zademonstruje BJ Slater, doktorant w moim laboratorium, Aby przygotować etap cięcia do krojenia, wytnij mały kawałek 3% świdra o długości około jednego centymetra sześciennego, który ma być użyty jako zabezpieczenie dla mózgu, i kolejny kawałek o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 milimetra na trzy milimetry, który zostanie użyty jako guzek do podparcia wzgórka dolnego. Następnie przyklej backstop do sceny za pomocą kleju cyjanoakrylowego, a następnie przyklej guzek po prawej stronie backstopu tak, aby tworzyły kąt 80 stopni na slajdzie oznaczonym dwiema liniami pod kątem 90 stopni i ukośną linią pod kątem 17 stopni od lewego górnego rogu do prawego dolnego rogu, umieść grzbietową stroną mózgu do góry w punkcie przecięcia dwóch linii. Za pomocą żyletki usuń od dwóch do czterech milimetrów rostralnego końca mózgu, aby uzyskać płaską powierzchnię.
Następnie połóż mózg stroną rozpieszczoną do góry na nowo utworzonej płaskiej powierzchni. Wyrównaj grzbietową powierzchnię mózgu z linią poziomą, a linię środkową mózgu z pionową linią zaznaczoną na szkiełku. Następnie wyrównaj żyletkę z linią 17 stopni.
Przechyl maszynkę do golenia pod kątem 30 stopni i usuń około trzech milimetrów prawej kory w podwójnym ukośnym cięciu, aby zamontować mózg na etapie vibrato. Umieść mały kawałek bibuły filtracyjnej po brzusznej stronie mózgu, tak aby długi wymiar był prostopadły do linii środkowej. Ostrożnie nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na obszar przed ogranicznikiem i po lewej stronie wybrzuszenia.
Następnie umieść podwójnie ukośnie przyciętą stronę mózgu na kleju, tak aby rozpieszczona część mózgu i tylna część mózgu były podparte o guzek, a prawa strona mózgu była oparta o backstop. W tej procedurze szybko umieść stopień tnący w vibrato, zbuduj stolik z roztworem do cięcia. Następnie wyrównaj ostrze z górną częścią mózgu.
Usuń od jednego do 1,5 milimetra z czubka mózgu. Następnie pokrój i usuń więcej plasterków o wielkości od 300 do 500 mikrometrów, poruszając się głębiej. Gdy wzgórek dolny, przyśrodkowe ciało i boczne jądro ICT są widoczne, zakręt zębaty powinien mieć kształt litery C, a struktura powinna być wyrównana.
Uzyskaj około dwóch plasterków po 600 mikrometrów. Są to plastry kory szyjnej. Następnie przenieś je do komory przetrzymywania w temperaturze 32 stopni Celsjusza.
Aby uzyskać obraz autofluorescencji flawoproteiny, zbieraj obrazy z częstotliwością czterech herców przez 105 sekund. Oświetl tkankę niebieskim światłem o długości od 470 do 490 nanometrów i uchwyć powyżej 515 nanometrów, upewniając się, że obraz nie jest ani zbyt ciemny, ani przepalony. Następnie użyj stymulacji elektrycznej, aby aktywować tkankę w celu uzyskania obrazu wapnia.
Zbieraj obrazy z częstotliwością 10 Hz przez 25 sekund. Oświetl tkankę światłem o długości 365 nanometrów i uchwyć fluorescencję powyżej 510 nanometrów. Ponownie, upewnij się, że obraz nie jest ani zbyt ciemny, ani przepalony.
Następnie użyj stymulacji elektrycznej, aby aktywować komórki. Ten obraz pokazuje potwierdzenie połączenia kory szyjnej w wycinku mózgu przez autofluorescencję flawoproteiny. Stymulacja elektryczna podawana z częstotliwością 0,05 herca do dolnej części jelita grubego była obrazowana z częstotliwością czterech herców, a cztery razy przetwarzano, aby pokazać moc przy tej stymulacji.
Częstotliwość, wzgórze słuchowe, wzgórze, siateczkowa, jądro i kora słuchowa są aktywowane synaptycznie. Oto niepołączony wycinek. Stymulację elektryczną jelita grubego dolnego z aktywacją obserwowano tylko we wzgórzu słuchowym.
Cała ścieżka nie została uchwycona, prawdopodobnie z powodu tego, że jedno z cięć było nieco poza płaszczyzną. Z projekcjami korowymi Alam. Ten obraz pokazuje nietypową aktywację kory słuchowej.
Elektryczna stymulacja jelita grubego dolnego aktywowała korę słuchową bez widocznego sygnału. We wzgórzu słuchowym jest prawdopodobne, że wzgórze było nadal aktywowane, ale nie znajdowało się na powierzchni obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać wycinek kory wzgórzowej AAL i ocenić jego połączenie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę przygotowania skorupy korowej Calot Thal, koncentrując się na głównych strukturach słuchowych w mózgu myszy. Technika ta poprawia zrozumienie łączności w obszarach słuchowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Przetwarzanie słuchowe
- Techniki krojenia mózgu
Tło
- Celem badania jest zbadanie przetwarzania słuchowego w mózgu myszy.
- Koncentruje się na czterech głównych strukturach słuchowych: dolne wzgórza, tał, jądro siatkowe tał i kora słuchowa.
- Zrozumienie tych połączeń jest kluczowe dla badania przetwarzania informacji w obszarach słuchowych.
- Metoda obejmuje złożone techniki krojenia w celu zachowania struktury mózgu.
Cel badania
- Przygotowanie krojów mózgu, które zachowują integralność połączeń słuchowych.
- Fascynacja eksperymentami, które poprawiają zrozumienie przetwarzania informacji słuchowych.
- Demonstracja znaczenia precyzyjnych technik krojenia w przygotowaniu krojów mózgu.
Stosowane metody
- Usuwanie mózgu myszy do krojenia.
- Blokowanie mózgu w celu przygotowania do krojenia.
- Wykonywanie podwójnego kątowego cięcia w celu uzyskania krojów.
- Wykorzystanie obrazowania flawoprotein do oceny łączności w krojuach.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie rejestruje połączenia między głównymi strukturami słuchowymi.
- Obrazownie flawoprotein ujawnia integralność szlaków słuchowych.
- Wykazano skuteczność podwójnego kątowego cięcia w zachowaniu projekcji.
- Dostarczono niezawodną technikę do przyszłych eksperymentów z przetwarzaniem słuchowym.
Konkluzje
- Badanie przedstawia usprawnioną metodę przygotowywania krojów mózgu słuchowego.
- Podkreśla znaczenie precyzyjnych technik krojenia w badaniach neuronaukowych.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia przetwarzania informacji słuchowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Preserving colliculo-thalamocortical connectivity in mouse brain slices enables rigorous interrogation of auditory information processing across multiple brain regions. This approach supports predictive confidence in mechanistic studies by maintaining both ascending and descending pathways, critical for target validation and pathway de-risking in early discovery. The integration of 3-D printed chamber components and multi-scale optical imaging enhances reproducibility and cross-study comparability, strengthening portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional mapping of auditory circuits for mechanistic de-risking.
- Supports validation of synaptic connectivity across midbrain and forebrain structures.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of sensory information flow.
- Provides a platform for assessing the impact of cortical modulation on subcortical processing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized brain slice preparations for reproducible functional assays.
- Allows rapid assessment of connectivity using flavoprotein autofluorescence imaging.
- Supports quantitative evaluation of network activation in response to electrical stimulation.
- Enables scalable preparation of slices for compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with in vivo auditory processing for translational continuity.
- Permits investigation of disease-relevant disruptions in auditory pathways.
- Supports biomarker discovery by linking functional activation patterns to molecular readouts.
- Facilitates risk-adjusted advancement of targets with validated circuit-level effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling multi-scale analysis of auditory circuits from single-slice preparations. It supports workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Provides a robust platform for testing circuit-level hypotheses and clarifying pathway function.
- Screening: Offers reproducible, quantitative readouts of network activation for assay development.
- Analytics: Delivers optical and electrophysiological measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro circuit function to in vivo sensory processing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable preparation for diverse mechanistic and screening studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets with validated circuit engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in complex brain slicing and alignment techniques.
- Needs access to 3-D printing for custom chamber components and advanced optical imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of slicing and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Connectivity assessment is limited by slice quality and imaging depth.
