Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie wycinka korowego Calot Thal z czterema głównymi strukturami słuchowymi: okrężnicą dolną, wzgórzem słuchowym, częścią słuchową jądra siatkowatego wzgórza i korą słuchową. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie mózgu z myszy. Drugim krokiem jest zablokowanie mózgu w ramach przygotowań do krojenia.

Następnie wytnij mózg, aby uzyskać plasterki zawierające połączenie korowe Calot thal. Ostatnim krokiem jest wykorzystanie obrazowania flawoprotein do oceny łączności. Ostatecznie wycinek mózgu zawierający połączenie kory szyjnej może być wykorzystany do różnych eksperymentów, aby lepiej zrozumieć przetwarzanie informacji w obszarach słuchowych środkowego i czwartego mózgu Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki blokowania mózgu przed krojeniem są trudne do nauczenia, ponieważ wymaga złożonego cięcia pod podwójnym kątem, co jest kluczem do uzyskania nienaruszonych projekcji.

Technikę zademonstruje BJ Slater, doktorant w moim laboratorium, Aby przygotować etap cięcia do krojenia, wytnij mały kawałek 3% świdra o długości około jednego centymetra sześciennego, który ma być użyty jako zabezpieczenie dla mózgu, i kolejny kawałek o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 milimetra na trzy milimetry, który zostanie użyty jako guzek do podparcia wzgórka dolnego. Następnie przyklej backstop do sceny za pomocą kleju cyjanoakrylowego, a następnie przyklej guzek po prawej stronie backstopu tak, aby tworzyły kąt 80 stopni na slajdzie oznaczonym dwiema liniami pod kątem 90 stopni i ukośną linią pod kątem 17 stopni od lewego górnego rogu do prawego dolnego rogu, umieść grzbietową stroną mózgu do góry w punkcie przecięcia dwóch linii. Za pomocą żyletki usuń od dwóch do czterech milimetrów rostralnego końca mózgu, aby uzyskać płaską powierzchnię.

Następnie połóż mózg stroną rozpieszczoną do góry na nowo utworzonej płaskiej powierzchni. Wyrównaj grzbietową powierzchnię mózgu z linią poziomą, a linię środkową mózgu z pionową linią zaznaczoną na szkiełku. Następnie wyrównaj żyletkę z linią 17 stopni.

Przechyl maszynkę do golenia pod kątem 30 stopni i usuń około trzech milimetrów prawej kory w podwójnym ukośnym cięciu, aby zamontować mózg na etapie vibrato. Umieść mały kawałek bibuły filtracyjnej po brzusznej stronie mózgu, tak aby długi wymiar był prostopadły do linii środkowej. Ostrożnie nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na obszar przed ogranicznikiem i po lewej stronie wybrzuszenia.

Następnie umieść podwójnie ukośnie przyciętą stronę mózgu na kleju, tak aby rozpieszczona część mózgu i tylna część mózgu były podparte o guzek, a prawa strona mózgu była oparta o backstop. W tej procedurze szybko umieść stopień tnący w vibrato, zbuduj stolik z roztworem do cięcia. Następnie wyrównaj ostrze z górną częścią mózgu.

Usuń od jednego do 1,5 milimetra z czubka mózgu. Następnie pokrój i usuń więcej plasterków o wielkości od 300 do 500 mikrometrów, poruszając się głębiej. Gdy wzgórek dolny, przyśrodkowe ciało i boczne jądro ICT są widoczne, zakręt zębaty powinien mieć kształt litery C, a struktura powinna być wyrównana.

Uzyskaj około dwóch plasterków po 600 mikrometrów. Są to plastry kory szyjnej. Następnie przenieś je do komory przetrzymywania w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Aby uzyskać obraz autofluorescencji flawoproteiny, zbieraj obrazy z częstotliwością czterech herców przez 105 sekund. Oświetl tkankę niebieskim światłem o długości od 470 do 490 nanometrów i uchwyć powyżej 515 nanometrów, upewniając się, że obraz nie jest ani zbyt ciemny, ani przepalony. Następnie użyj stymulacji elektrycznej, aby aktywować tkankę w celu uzyskania obrazu wapnia.

Zbieraj obrazy z częstotliwością 10 Hz przez 25 sekund. Oświetl tkankę światłem o długości 365 nanometrów i uchwyć fluorescencję powyżej 510 nanometrów. Ponownie, upewnij się, że obraz nie jest ani zbyt ciemny, ani przepalony.

Następnie użyj stymulacji elektrycznej, aby aktywować komórki. Ten obraz pokazuje potwierdzenie połączenia kory szyjnej w wycinku mózgu przez autofluorescencję flawoproteiny. Stymulacja elektryczna podawana z częstotliwością 0,05 herca do dolnej części jelita grubego była obrazowana z częstotliwością czterech herców, a cztery razy przetwarzano, aby pokazać moc przy tej stymulacji.

Częstotliwość, wzgórze słuchowe, wzgórze, siateczkowa, jądro i kora słuchowa są aktywowane synaptycznie. Oto niepołączony wycinek. Stymulację elektryczną jelita grubego dolnego z aktywacją obserwowano tylko we wzgórzu słuchowym.

Cała ścieżka nie została uchwycona, prawdopodobnie z powodu tego, że jedno z cięć było nieco poza płaszczyzną. Z projekcjami korowymi Alam. Ten obraz pokazuje nietypową aktywację kory słuchowej.

Elektryczna stymulacja jelita grubego dolnego aktywowała korę słuchową bez widocznego sygnału. We wzgórzu słuchowym jest prawdopodobne, że wzgórze było nadal aktywowane, ale nie znajdowało się na powierzchni obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać wycinek kory wzgórzowej AAL i ocenić jego połączenie.