Name: Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Poznaj metodę przygotowania wycinków mózgu myszy obejmujących cztery główne struktury słuchowe z wykorzystaniem dwukątnego cięcia i obrazowania flawoproteinowego. Technika ta umożliwia zachowanie integralności połączeń w regionach słuchowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 dla D. A. Llano i F31-DC-013501 dla B. J. Slatera, a także przez Fundację Carvera.
Autorzy chcieliby podziękować Jasonowi MacLeanowi i Matthew Banksowi za techniczne porady dotyczące obrazowania wapnia.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Illinois. Wszystkie zwierzęta były trzymane w placówkach opieki nad zwierzętami zatwierdzonych przez American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i zmniejszyć cierpienie na wszystkich etapach badania.
1. Przygotowanie i usunięcie mózgu myszy do krojenia
<ol>
	<li>Przygotuj się do inkubacji perfuzji i plastrów.
	<ol>
		<li>Około 30 minut przed krojeniem należy przygotować roztwór do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy i aCSF o niskiej zawartości wapnia do inkubacji plastra przed zapisem lub obrazowaniem.</li>
		<li>Rozłóż wszystkie niezbędne narzędzia (duże nożyczki z końcem, małe nożyczki sprężynowe, kleszcze anatomiczne, duże nożyczki lub gilotyna, nożyczki do tęczówki, kleszczyki jubilerskie, strzykawka 10 ml z igłą 27G x 1/2 cala, mały kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 2 cm i pipeta Pasteura ze złamaną końcówką do przenoszenia plastrów) do perfuzji i krojenia, i przygotuj tacę perfuzyjną.</li>
		<li>Ustawić komorę inkubacyjną z natlenionym aCSF w łaźni wodnej o temperaturze 32 oC i naczyniu hodowlanym wypełnionym roztworem tnącym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj etap krojenia do krojenia.
	<ol>
		<li>Wytnij mały kawałek 3% agaru o wymiarach około 1 cm3, aby użyć go jako zabezpieczenia dla mózgu i 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm jako guz, który zostanie użyty do podparcia układu scalonego.</li>
		<li>Przyklej backstop do sceny za pomocą kleju cyjanoakrylowego, a także wybrzuszenie po prawej stronie backstopu tak, aby tworzyły kąt 80o.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń mózg.
	<ol>
		<li>Głęboko znieczulić mysz p12-p20 (najlepiej p14-18) ketaminą 100 mg/kg i ksylaksyną 3 mg/kg (lub porównywalną procedurą zatwierdzoną przez komisję etyczną). 
		Uwaga: Potwierdź prawidłowy poziom znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca. Ponieważ zwierzę jest krótko pod narkozą, maść okulistyczna nie jest konieczna.</li>
		<li>Używając nożyczek z końcami, odsłoń klatkę piersiową od wyrostka mieczykowatego do szyi.
		<ol>
			<li>Znajdź wyrostek mieczykowaty i wykonaj poziome cięcie o długości około 1,5 cm.</li>
			<li>Wykonaj dwa pionowe nacięcia od końców poprzedniego cięcia poziomego do ramion, każde o około 1,5 cm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przetnij przeponę i połączenia żebrowo-chrzęstne, aby odsłonić serce.</li>
		<li>Małymi nożyczkami sprężynowymi wykonaj małe, 2-5 mm nacięcie w prawym przedsionku, od brzusznej do grzbietowej strony serca.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o wymiarach 27 G x 1/2 cala wstrzyknąć lewą komorę i szybko przelać zwierzętom roztwór do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy.</li>
		<li>Gdy krew się oczyści, użyj większych nożyczek, aby usunąć głowę. 
		Uwaga: Nie ocenialiśmy systematycznie użyteczności perfuzji. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że perfuzja przezsercowa u tak młodych myszy może być wykonana z prawie 100% sukcesem i ma tę zaletę, że eliminuje czerwone krwinki, które mogą fluoryzować i zakłócać obrazowanie.</li>
		<li>Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek do wygiętej tęczówki przeciąć czaszkę między oczami, a następnie zaczynając od nacięcia między oczami, ostrożnie przeciąć od przodu do tyłu wzdłuż szwu linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić mózgu pod spodem. 
		Uwaga: Opona twarda zwykle odpada wraz z czaszką. Jeśli to konieczne, usuń oponę twardą przed ostrożnym usunięciem mózgu.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy jubilerskich podważ czaszkę i ostrożnie usuń mózg, a następnie umieść mózg w roztworze do cięcia. Uważaj, aby nie uszkodzić kory mózgowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie mózgu do krojenia
<ol>
	<li>Przygotowanie mózgu do montażu na scenie wibratomu.
	<ol>
		<li>Za pomocą szkiełka oznaczonego dwiema liniami o temperaturze 90o i ukośną linią o godzinie 17o od góry po lewej do prawej strony, przecinającej się w miejscu, w którym spotykają się dwie linie, umieść mózg grzbietową stroną do góry, za pomocą żyletki usuń 2-4 mm rostralnego końca mózgu, tworząc płaską powierzchnię.</li>
		<li>Umieść ogonową stronę mózgu do góry na nowo utworzonej płaskiej powierzchni i wyrównaj grzbietową powierzchnię mózgu z poziomą, a linię środkową mózgu z linią pionową.</li>
		<li>Dopasuj żyletkę do linii 17o, przechyl maszynkę pod kątem 30o i usuń około 3 mm prawej kory w podwójnym ukośnym cięciu (17o od płaszczyzny poziomej i 60o od koronalnej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż mózgu na etapie wibratomowym.
	<ol>
		<li>Umieść mały kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 2 cm po brzusznej stronie mózgu tak, aby długi wymiar był prostopadły do linii środkowej.</li>
		<li>Ostrożnie nałóż niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na obszar przed ogranicznikiem (i po lewej stronie wybrzuszenia).</li>
		<li>Umieść podwójnie ukośnie przyciętą powierzchnię mózgu do kleju tak, aby część ogonowa mózgu i tyłomózgowie były oparte o guz, a prawa strona mózgu była oparta o backstop.</li>
		<li>Delikatnie dociśnij mózg, upewniając się, że cała powierzchnia styka się z komorą krojenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Uzyskanie warstwy koliculo-wzgórzowo-korowej
<ol>
	<li>Szybko przejdź do etapu cięcia i umieść w wibratomie, wypełnij stolik roztworem do cięcia.</li>
	<li>Dopasuj ostrze do górnej (brzusznej strony) mózgu.</li>
	<li>Usuń 1-1,5 mm z wierzchołka mózgu, usuń plastry 300-500 μm i oceń głębokość po usunięciu. 
	Uwaga: Gdy IC, MGB i jądro kolankowate boczne (LGN) są widoczne, a zakręt zębaty tworzy kształt litery "C", weź od jednego do dwóch plasterków o grubości 600 μm. Zobacz rysunek 3A.</li>
	<li>Plastry umieścić w nagrzanej (32 oC) komorze do przechowywania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wycinka
<ol>
	<li>Preparat do obrazowania autofluorescencji flawoprotein.
	<ol>
		<li>Przygotować aCSF do perfuzji plastra w standardowej elektrofizjologicznej komorze rejestracyjnej, pęcherzyk aCSF z 95% O2/5% CO2 .</li>
		<li>Pociągnij szklaną elektrodę do stymulacji. Należy pamiętać, że wiele różnych elektrod stymulujących i konfiguracji (szkło, wolfram, włókno węglowe, monopolarne, bipolarne) działa bardzo dobrze w połączeniu z obrazowaniem autofluorescencji flawoprotein.</li>
		<li>Włącz komputer, kamerę, mikromanipulator, źródło światła, oprogramowanie do stymulacji, oprogramowanie do przechwytywania obrazu.</li>
		<li>Wykonaj perfuzję komory nagraniowej za pomocą natlenionego aCSF, umieść niestandardowy mostek (projekt dostępny w materiałach uzupełniających), aby podnieść plaster w komorze. 
		Uwaga: Szybkość perfuzji może się różnić w zależności od indywidualnej konfiguracji; Stosuje się tutaj 5-15 ml/min.</li>
		<li>Umieść plasterek w komorze, obniż poziom płynu w komorze, aby zapobiec oderwaniu się plastra od mostu, jednocześnie umieszczając specjalnie skonstruowaną harfę na warstwie, uważając, aby nie umieszczać strun harfy nad interesującymi ścieżkami (Rysunek 1A). Zwiększ poziom cieczy do około 1-2 mm powyżej plasterka, aby utrzymać przepływ płynu CSF powyżej i poniżej plasterka. 
		Uwaga: Jeśli konieczna jest zmiana położenia, użyj pipety Pasteura ze złamanym końcem lub pozwól, aby poziom płynu mózgowo-rdzeniowego wzrósł i używaj kleszczy z najwyższą ostrożnością.</li>
		<li>Włóż elektrodę chlorku srebra do szklanej elektrody wypełnionej CSF, włóż szklaną elektrodę do mikromanipulatora i podłącz do izolatora bodźca, a następnie ostrożnie umieść szklaną elektrodę w IC / istocie białej, prowadząc do wzgórza (patrz rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu autofluorescencji flawoprotein.
	<ol>
		<li>Zbieraj obrazy z częstotliwością 4 Hz (przy użyciu obiektywu makro 2X z korekcją do nieskończoności (NA 0,13)) i aparatu przez 105 sekund, jednocześnie stymulując elektrycznie (każda stymulacja składa się z 1 sekundy 40 Hz, 2 ms pulsuje tkankę przy 0,05 Hz pięć razy), oświetlając tkankę niebieskim światłem 470-490 nm i rejestrując powyżej 515 nm. Upewnij się, że obraz nie jest ani zbyt ciemny, ani przepalony, patrz Rysunek 3 w lewej kolumnie w celach informacyjnych. 
		Uwaga: Czas zbierania, częstotliwość zbierania i częstotliwość stymulacji można zmienić, aby dopasować do eksperymentu, niestandardowy program zawarty w materiałach uzupełniających można modyfikować jako taki.</li>
		<li>Eksportuj obrazy do Matlaba i korzystaj z niestandardowego programu dostępnego w materiałach uzupełniających do analizy mocy spektralnej obrazów przy 0,05 Hz. Wynikowy obraz będzie pokazywał połączone ścieżki. 
		Uwaga: Program niestandardowy wykorzystuje szybką transformację Fouriera wartości pikseli w szeregach czasowych do wytworzenia obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat do obrazowania wapnia.
	<ol>
		<li>Przygotować małą komorę inkubacyjną, używając 3 cm naczynia hodowlanego i podniesionej membrany hodowlanej, aby umożliwić CSF dotarcie zarówno do góry, jak i do dołu plastra, a następnie umieścić na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę na poziomie około 32 oC.</li>
		<li>Napełnij małą komorę inkubacyjną ciepłym aCSF i powoli bąbelkuj 95% O2/5% CO2 .</li>
		<li>Zmieszać 2 μl kwasu pluronowego F-127 i 50 μg Fura-2AM rozpuszczonych w 48 μl DMSO.</li>
		<li>Umieść plasterek w małej komorze inkubacyjnej na podniesionej membranie i ostrożnie za pomocą mikropipety dodaj mieszaninę barwiącą bezpośrednio nad MGB (lub inną strukturą będącą przedmiotem zainteresowania).</li>
		<li>Przykryj plastry, aby zapobiec bieleniu przed obrazowaniem i pozostaw plastry do inkubacji przez 45 minut - 1 godzinę.</li>
		<li>Wyjmij plastry do podgrzewanej komory na 10-15 minut, aby zmyć nadmiar materiału.</li>
		<li>Wykonaj kroki od 4.1.1 do 4.1.6, aby przygotować się do stymulacji i obrazowania wycinka kolikulologiczno-wzgórzowo-korowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu wapnia.
	<ol>
		<li>Zbieraj obrazy z częstotliwością 10 Hz (przy użyciu obiektywu 20X zanurzonego w wodzie) przez 25 sekund, jednocześnie stymulując elektrycznie (każda stymulacja składa się z jednego impulsu o długości 2 ms) tkankę przy 0,2 Hz pięć razy, jednocześnie oświetlając tkankę światłem 365 nm i rejestrując fluorescencję powyżej 510 nm.</li>
		<li>Eksportuj obrazy do Matlaba i korzystaj z niestandardowego programu dostępnego w materiałach uzupełniających do analizy mocy spektralnej obrazów przy 0,2 Hz. Wynikowy obraz pokaże aktywne komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li>
<li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+%28barrel%29+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li>
<li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+thalamocortical+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+meth%22%5BJournal%5D)">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li>
<li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li>
<li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li>
<li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li>
<li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li>
<li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Paradigm+for+Optical+Imaging%3A+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li>
<li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li>
<li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse%3A+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje ulepszenia w stosunku do wcześniej opisanego kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu u myszy p12-20 w celu zbadania przepływu informacji w układzie słuchowym1. Metoda ta ma wiele zalet w porównaniu z innymi, podobnymi preparatami do wycinków mózgu, ponieważ utrzymuje połączenia między większą liczbą obszarów mózgu w jednym wycinku, co daje badaczom nowe narzędzia do zrozumienia interakcji i wzajemnych oddziaływań między jądrami słuchowymi w przodomózgowiu. W tym protokole wprowadzono kil...

W systemie słuchowym, mimo że między peryferiami sensorycznymi a wzgórkiem dolnym dochodzi do znacznego przetwarzania dodatkowego, zanim dotrze ono do kory słuchowej, następuje znaczne dodatkowe przetwarzanie. Wiemy bardzo mało o tym, jak odbywa się to przetwarzanie, a zatem niewiele o tym, jak ta transformacja pozwala mózgowi interpretować napływające informacje sensoryczne. Z wyjątkiem węchu, każdy ze zmysłów ma bardzo podobną organizację, przy czym sygnały peryferyjne są początkowo przekazywane z wysoką wiernością, która maleje, gdy sygnał wznosi się do kory. Następnie kora mózgowa wysyła projekcje do niższych struktur, aby dalej modulować napływające informacje. Ten złożony system był badany na różne sposoby in vivo, a także w wielu preparatach in vitro. W pierwszym przypadku wszystkie połączenia są nienaruszone, co umożliwia badaczowi zbadanie dowolnego zestawu połączeń, przy jednoczesnej kontroli wejścia sensorycznego i wyjścia pomiarowego w dowolnym obszarze. Przy takim podejściu kontrola nad dużą różnorodnością innych bodźców, w tym innymi bodźcami sensorycznymi, pobudzeniem i uwagą, jest niewielka lub żadna, co prowadzi do intensywnie złożonego wyjścia. In vitro wycinki mózgu zostały pocięte w celu uchwycenia pojedynczego zestawu projekcji lub dwóch połączonych obszarów mózgu, co pozwala naukowcom stymulować i oceniać różne aferenty lub obszary mózgu. Często są to plastry wzgórzowo-korowe lub tektowzgórzowe, w których zachowane są dane wejściowe do wzgórza lub wzgórza i jego wyjście do kory2-5. Preparaty te pozwalają na szeroką gamę manipulacji farmakologicznych, elektrycznych i optogenetycznych. Jednak mając tylko dwa regiony mózgu, przede wszystkim oceniają przekazywanie informacji i nie mają możliwości oceny transformacji informacji podczas jej przechodzenia przez wzgórze. Również projekcja siateczkowo-wzgórzowa, która może odgrywać rolę w modulacji uwagi6-9, jest obecna w tym wycinku. W tym miejscu demonstrujemy ulepszenia w stosunku do naszego poprzedniego przygotowania1, które pozwala badaczowi kontrolować różne dane wejściowe do wzgórza, aby dać unikalną perspektywę tego, jak wzgórze bramkuje i filtruje informacje. Łączymy ten nowatorski preparat plastrów z obrazowaniem autofluorescencji flawoprotein w celu oceny połączenia plastrów i analizy aktywacji na dużą skalę, obrazowaniem wapnia we wzgórzu do analizy populacji neuronów oraz rejestracją pojedynczych komórek w celu zmierzenia wpływu różnych danych wejściowych na poziomie pojedynczej komórki.
Aby pomóc w utrzymaniu tych rozległych połączeń, opracowaliśmy również szereg modyfikacji normalnej kotwicy wycinka (a.k.a. "harfy") do utrzymywania wycinka mózgu w miejscu oraz mostka do podnoszenia wycinka w celu zwiększenia perfuzji. Harfa została zaprojektowana w zmodyfikowanym kształcie podkowy, aby otaczać plasterek i umożliwiać dostosowywanie punktów mocowania strun harfy. Trzy sznurki są przymocowane w taki sposób, że i) jeden leży poziomo wzdłuż przyśrodkowej krawędzi wycinka, ii) jeden rozciąga się od krawędzi ogonowej IC do ogonowej krawędzi AC i iii) jeden rozciąga się po przekątnej od przyśrodkowej krawędzi wycinka do obszaru rostralnego do AC (patrz rysunek 1A). Małe wgłębienia w ramie do klejenia (klejem cyjanoakrylowym) strun harfy pozwalają na zmniejszenie nacisku na plaster, aby pomóc w utrzymaniu integralności plastra (patrz rysunek 1B). Korzystając z druku trójwymiarowego, jesteśmy w stanie zaprojektować harfy na zamówienie zgodnie z naszymi unikalnymi specyfikacjami, a także mosty, które pozwalają na idealny przepływ sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) powyżej i poniżej tkanki. Utrzymuje to również duże obszary, na których światło przenika do tkanki w elektrofizjologii klamry krostowej.

<table><tbody><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy</td><td>w mM: 206 sacharoza, 10,0 MgCl2, 11,0 glukoza, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0,5 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Niski poziom wapnia aCSF</td><td></td><td></td><td>w mM: 126 NaCl, 3,0 MgCl2, 10,0 glukoza, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>w mM: 126 NaCl, 2,0 MgCl2, 10,0 glukoza, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Izolator bodźców</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Partia: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Partia: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Partia: 1499369</td></tr><tr><td>Duże naczynie hodowlane</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13</td><td>Naczynie hodowlane 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Małe naczynie</td><td>hodowlane Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm Naczynie</td></tr><tr><td>hodowlane Podwyższona membrana hodowlana</td><td>Millicell</td><td>PICMORG50</td><td>Służy do utrzymania natlenionej perfuzji płynu po obu stronach plastra.</td></tr><tr><td>Kostka fluorescencyjna do obrazowania flawoprotein</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&ndash; Wzbudzenie 490 nm, dichroiczne 505 nm, długie przejście emisji 515 nm. Odkryliśmy, że sprawdzi się tu praktycznie każda kostka filtra białkowego z zieloną fluorescencją.</td></tr><tr><td>Kostka fluorescencyjna do obrazowania wapnia</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 wyjście 365 nm, XF2001 400 nm dichroiczne, XF3080 emisja 510 nm</td></tr><tr><td>Agar do blokowania mózgu</td><td></td><td></td><td>3% wagowo w wodzie</td></tr><tr><td>Viper si Stereo Lithium Apparatus</td><td>3D Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3d elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Zdolność mózgu do przetwarzania informacji sensorycznych opiera się zarówno na rosnących, jak i opadających zestawach projekcji. Do niedawna jedynym sposobem na zbadanie tych dwóch układów i ich interakcji było stosowanie preparatów in vivo. Duże postępy poczyniono w przypadku ostrych wycinków mózgu zawierających szlaki wzgórzowo-wzgórzowe i korowo-wzgórzowe w układzie somatosensorycznym, wzrokowym i słuchowym. Dzięki kluczowym udoskonaleniom naszej niedawnej modyfikacji wycinkasłuchowego korowo-wzgórzowego 1, jesteśmy w stanie bardziej wiarygodnie uchwycić projekcje między większością głównych słuchowych struktur śródmózgowia i przodomózgowia: wzgórkiem dolnym (IC), ciałem kolankowatym przyśrodkowym (MGB), jądrem siatkowatym wzgórza (TRN) i korą słuchową (AC). Mając zachowane fragmenty wszystkich tych połączeń, jesteśmy w stanie odpowiedzieć na szczegółowe pytania, które uzupełniają pytania, na które można odpowiedzieć za pomocą preparatów in vivo. Zastosowanie obrazowania autofluorescencji flawoprotein pozwala nam szybko ocenić łączność w dowolnym wycinku i pokierować wynikającym z tego eksperymentem. Korzystając z tego wycinka w połączeniu z technikami nagrywania i obrazowania, jesteśmy teraz lepiej przygotowani do zrozumienia, w jaki sposób przetwarzanie informacji zachodzi w każdym punkcie przodomózgowia słuchowego, gdy informacje docierają do kory mózgowej, oraz jaki jest wpływ zstępującej modulacji kory mózgowej. Druk 3D do budowy komponentów komory plastrowej umożliwia dwustronną perfuzję i szeroki dostęp do sieci w obrębie plastra oraz utrzymuje szerokie połączenia kluczowe dla pełnego wykorzystania tego preparatu.

Przykład przekroju mózgu myszy obejmującego obszary wzgórzowo-korowe i kolikulalne, pobranego od myszy w 15. dobie po urodzeniu (P15), przedstawiono na rycinie 2. Idealny przekrój powinien zawierać cztery główne struktury słuchowe śródmózgowia i przedmózgowia: IC, MGB, TRN oraz AC, z których wszystkie są aktywowane podczas stymulacji IC (Rycina 2A). Wykorzystując analizę Fouriera, mierzy się moc widmową przy częstotliwości stymulacji elektrycznej, a połączone obszary mózgu wykazują aktyw...

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie skrawka korowego Calot Thal zawierającego cztery główne struktury słuchowe: kolus dolny, wzgórze słuchowe, część słuchową jądra siatkowatego wzgórza oraz korę słuchową. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie mózgu z myszy. Drugim krokiem jest zablokowanie mózgu w celu przygotowania go do krojenia.Następnie należy przekroić mózg, aby uzyskać plastry zawierające połączenie korowe Calota. Ostatnim krokiem jest zastosowanie obrazowania flawoprotein w celu oceny łączności. Ostatecznie plaster mózgu zawierający korowe połączenie carotalne może zostać wykorzystany w różnych eksperymentach, aby lepiej zrozumieć przetwarzanie informacji w obszarach słuchowych śródmózgowia i przedmózgowia. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy blokowania mózgu przed krojeniem są trudne do opanowania, gdyż wymagają złożonego cięcia pod podwójnym kątem, co jest niezbędne do uzyskania nienaruszonych projekcji.Technikę zaprezentuje BJ Slater, doktorant w moim laboratorium. Aby przygotować etap cięcia do krojenia, odetnij mały kawałek 3% agaru o objętości około jednego centymetra sześciennego, który posłuży jako podparcie dla mózgu, oraz drugi kawałek o wymiarach 1,5 centymetra na 1,5 milimetra na trzy milimetry, który posłuży jako wypustka do podtrzymania kolliculus inferior. Następnie przyklej podparcie do podstawki za pomocą kleju cyjanoakrylowego, a potem przyklej wypustkę po prawej stronie podparcia w taki sposób, aby tworzyły one kąt 80 stopni na szkiełku oznaczonym dwiema liniami pod kątem 90 stopni oraz linią ukośną pod kątem 17 stopni od lewego górnego do prawego dolnego rogu. Umieść mózg stroną grzbietową do góry w punkcie przecięcia dwóch linii. Za pomocą żyletki usuń od dwóch do czterech milimetrów z końca rostralnego mózgu, aby stworzyć płaską powierzchnię.Następnie należy położyć mózg stroną grzbietową do góry na nowo utworzonej płaskiej powierzchni. Należy wyrównać powierzchnię grzbietową mózgu z linią poziomą, a linię środkową mózgu z linią pionową zaznaczoną na szkiełku. Następnie należy ustawić ostrze żyletki wzdłuż linii pod kątem 17 stopni.Przechyl żyletkę pod kątem 30 stopni i usuń około trzech milimetrów prawej kory, wykonując podwójne cięcie ukośne, aby zamontować mózg na stole wibrotomu. Umieść mały kawałek papieru filtrującego na stronie brzusznej mózgu tak, aby jego dłuższy wymiar był prostopadły do linii środkowej. Ostrożnie nanieś niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego na obszar przed ogranicznikiem i na lewo od wypukłości.Następnie umieść mózg przecięty podwójnie po przekątnej na kleju w taki sposób, aby część przednia oraz tylna mózgu opierały się o wypukłość, a prawa strona mózgu przylegała do ogranicznika. W tej procedurze szybko umieść platformę do cięcia w wibratomie i przygotuj platformę z roztworem do cięcia. Następnie ustaw ostrze na wysokości górnej części mózgu.Usuń od 1 do 1,5 mm z górnej części mózgu. Następnie wykonuj kolejne przekroje o grubości od 300 do 500 µm, przesuwając się głębiej. Gdy widoczne będą wzgórze dolne, ciało nadprzesiękowe przyśrodkowe oraz boczny jądro ICT, zakręt zębaty powinien przybrać kształt litery C, a struktura powinna być odpowiednio wyrównana.Przygotuj około dwóch plastrów o grubości 600 µm. Są to plastry kory oczopląsowej. Następnie przenieś je do komory utrzymującej temperaturę 32 °C.Aby uzyskać obraz autofluorescencji flawoprotein, należy zbierać obrazy z częstotliwością 4 Hz przez 105 sekund. Oświetl tkankę światłem niebieskim o długości fali od 470 do 490 nanometrów i rejestruj sygnał powyżej 515 nanometrów, dbając o to, aby obraz nie był zbyt ciemny ani prześwietlony. Następnie zastosuj stymulację elektryczną w celu aktywacji tkanki, aby uzyskać obraz wapnia.Należy rejestrować obrazy z częstotliwością 10 Hz przez 25 sekund. Tkankę należy naświetlić światłem o długości fali 365 nm i zarejestrować fluorescencję powyżej 510 nm. Ponownie należy upewnić się, że obraz nie jest ani zbyt ciemny, ani prześwietlony.Następnie zastosuj stymulację elektryczną w celu aktywacji komórek. Na tym obrazie przedstawiono potwierdzenie połączenia kory z ciałemm smugowym w skrawku mózgu za pomocą autofluorescencji flawoprotein. Stymulację elektryczną o częstotliwości 0,05 Hz przyłożoną do kolumny dolnej obrazowano przy częstotliwości 4 Hz, a następnie przetworzono w celu pokazania mocy przy tej stymulacji.Częstotliwość, wzgórze słuchowe, jądro siatkowe wzgórza i kora słuchowa ulegają aktywacji synaptycznej. Oto niepołączony skrawek. Stymulacja elektryczna wzgórza dolnego z aktywacją była widoczna jedynie we wzgórzu słuchowym.Cały szlak nie został uchwycony, prawdopodobnie z powodu tego, że jeden z przekrojów znajdował się nieco poza płaszczyzną. Z projekcjami korowymi jądra ALAM. Obraz ten przedstawia nietypową aktywację kory słuchowej.Stymulacja elektryczna kolca dolnego aktywowała korę słuchową bez widocznego sygnału. W przypadku wzgórza słuchowego prawdopodobne jest, że wzgórze nadal było aktywowane, ale nie znajdowało się ono na powierzchni obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak uzyskać przekrój korowy wzgórza AAL oraz jak ocenić jego łączność.

modification-colliculo-thalamocortical-mouse-brain-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.

Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Film pokazuje przygotowanie kolikulo-wzgórzowo-korowych wycinków mózgu z mózgów mysich szczeniąt. Izolowany mózg jest ustawiany na zaznaczonym slajdzie i cięty pod kątem, aby wyrównać słuchowe śródmózgowie i przodomózgowie w tej samej płaszczyźnie. Mózg jest następnie krojony za pomocą wibratomu, a wycinki zawierające główne struktury słuchowe śródmózgowia i przodomózgowie są przenoszone do komory przetrzymywania w celu konserwacji.

Przygotowanie plastrów kollicyczno-wzgórzowo-korowych z mózgu szczeniaka myszy

Ten film demonstruje rejestrację aktywności neuronalnej mózgu przez okno optyczne u myszy transgenicznych. Myszy wyrażają białko fluorescencyjne, które umożliwia wykrywanie aktywności neuronalnej. Niewielka część czaszki jest ostrożnie usuwana w celu zainstalowania okna optycznego, a następnie czaszka jest pokrywana czarnym cementem, aby zablokować światło przed obrazowaniem.

Instalacja okien optycznych w mózgu myszy transgenicznych w celu zobrazowania aktywności neuronalnej

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Korzystając z rezonansu magnetycznego (człowieka), oprogramowania do obrazowania 3D i analizy immunohistologicznej, dokumentujemy zmiany w bocznych komorach mózgu. Podłużne mapowanie 3D zmian objętości komór bocznych i charakterystyka okołokomorowych zmian komórkowych, które zachodzą w ludzkim mózgu z powodu starzenia się lub choroby, są następnie modelowane u myszy.

Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Poznaj metodę przygotowania wycinków mózgu myszy obejmujących cztery główne struktury słuchowe z wykorzystaniem dwukątnego cięcia i obrazowania flawoproteinowego. Technika ta umożliwia zachowanie integralności połączeń w regionach słuchowych.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne (Wideo) | JoVE Journal

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Przeglądaj więcej filmów