Name: Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy system do oceny wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki, zachowujący mikrośrodowisko szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia długoterminowe monitorowanie żywotności komórek bez ich rozdzielania od stromy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez State of Florida's Bankhead-Coley Team Science Grant (2BT03), National Institutes of Health/National Cancer Institute (1R21CA164322-01) oraz Moffitt Cancer Center's Team Science Grant. Prace te były częściowo wspierane przez Translational Research Core Facility w H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, wyznaczonym przez NCI jako Kompleksowe Centrum Onkologiczne (P30-CA076292). Dostęp do komórek pierwotnych był możliwy dzięki Protokołowi Całkowitej Opieki Onkologicznej w Moffitt Cancer Center.

<ol><li>Salmon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+differential+sensitivity+of+human-tumor+stem+cells+to+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs.</a> N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).</li>
<li>Suggitt, M., Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+preclinical+anticancer+drug+screening%3A+empirical+to+target-driven+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches.</a> Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li>
<li>Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnitude+of+response+with+myeloma+frontline+therapy+does+not+predict+outcome%3A+importance+of+time+to+progression+in+southwest+oncology+group+chemotherapy+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials.</a> J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).</li>
<li>Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+complete+response+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The role of complete response in multiple myeloma.</a> Blood. 114, 3139-3146 (2009).</li>
<li>Khin, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+assay+for+chemosensitivity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma.</a> Cancer Res. 74, 56-67 (2014).</li>
<li>Misund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measurement+of+drug+sensitivity+of+myeloma+cells+co-cultured+with+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells.</a> J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).</li>
<li>Ramasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+experimental+model+to+evaluate+the+concomitant+effect+of+drugs+on+the+tumour+microenvironment+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells.</a> Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).</li>
<li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nat Med. 16, 483-489 (2010).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+bone+marrow+plasma+cell+infiltrates+in+multiple+myeloma%3A+the+added+value+of+CD138+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry.</a> Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).</li>
<li>Najar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+promote+or+suppress+the+proliferation+of+T+lymphocytes+from+cord+blood+and+peripheral+blood%3A+the+importance+of+low+cell+ratio+and+role+of+interleukin-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6.</a> Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).</li>
<li>Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+i+trialist%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase i trialist.</a> Lancet Oncol. 13, 236(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podsumowując, jest to potężna i wysokoprzepustowa metoda ilościowego określania chemowrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka szpiczaka szpiczaka szpiku kostnego oraz farmakodynamiki ex vivo leków w rekonstrukcji szpiku kostnego. Krytycznymi krokami w ramach tego protokołu są prawidłowe wysiew dołków i odpowiednie ogniskowanie (patrz rysunek 2 w celu uzyskania oczekiwanych wyników): upewnij się, że komórki MM i zrębu są równomiernie rozmieszczone, że komórki zrębu przylegają do dna studzienki, ...

Celem tej metody jest scharakteryzowanie wrażliwości komórek pierwotnych szpiczaka mnogiego (MM) na panel czynników ex vivo, jak najbardziej zbliżonych do warunków fizjologicznych, oraz z wystarczającą precyzją, aby wyniki te mogły być wykorzystane do identyfikacji subpopulacji opornych na chemoterapię w obrębie obciążenia guzem i ostatecznie do parametryzacji modeli obliczeniowych zaprojektowanych do oszacowania odpowiedzi klinicznej.
Modele obliczeniowe są potężnymi narzędziami do analizy złożonych systemów, takich jak interakcje rak-gospodarz-terapia. Jednak modele są tylko tak dobre, jak dane używane do ich parametryzacji. Niestety, większość danych dostępnych w literaturze nie może być wykorzystana w obecnej formie do parametryzacji takich modeli, ponieważ często są one uzyskiwane w wzajemnie wykluczających się warunkach eksperymentalnych. W związku z tym często wymagane są nowe eksperymenty w celu uzyskania potrzebnego zestawu parametrów eksperymentalnych. Większość testów żywotności jest jednak destrukcyjna, a zatem ograniczona do niewielkiej liczby punktów czasowych, często tylko jednego. To znacznie utrudnia wykorzystanie testów chemowrażliwości do parametryzacji modeli obliczeniowych, ponieważ takie eksperymenty nie dostarczają informacji na temat czasowej dynamiki systemu. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku pierwotnych komórek rakowych, które często są ograniczone do kilku milionów na próbkę i mają krótką żywotność po biopsji, co ogranicza liczbę dostępnych warunków eksperymentalnych. Ponadto większość testów żywotności wymaga oddzielenia raka od komórek nienowotworowych (zrębu) w momencie kwantyfikacji, co dodaje dodatkową pracę do protokołu, dodatkowo zaburza działanie komórek i ogranicza liczbę eksperymentów, które można przeprowadzić.
40 lat temu, Salmon i współpracownicy1 zaproponowali swój słynny test tworzenia kolonii in vitro do oceny chemowrażliwości komórek nowotworowych. Niestety, test ten okazał się mieszanym sukcesem ze względu na niewielką liczbę próbek pobranych od pacjentów ze szpiczakiem mnogim (MM), które były zdolne do tworzenia kolonii w warunkach kontrolnych: oszacowano, że tylko niewielka podgrupa od 0,001% do 0,1% komórek MM była zdolna do replikacji, określanej jako komórki macierzyste szpiczaka mnogiego2. To znacznie ograniczyło wskaźnik powodzenia testu i liczbę leków, które można było testować w tym samym czasie, nawet w nowszych modelach3. Kwestia ta jest o wiele ważniejsza teraz, gdy czynników szpiczakowatych (standardowych lub eksperymentalnych) jest więcej niż cztery dekady temu.
Głównym ograniczeniem tych wczesnych testów jest ich dychotomiczny wynik: albo pacjent jest "wrażliwy", albo "oporny" na dany lek. Nie podano informacji dotyczących stopnia wrażliwości i niejednorodności populacji nowotworów. W związku z tym pacjenci z małymi subpopulacjami szybko rosnących opornych komórek byliby klasyfikowani jako "wrażliwi" na terapię, ale wkrótce nastąpiłby nawrót, a zatem nie odnieśliby korzyści z leczenia. Biorąc pod uwagę znaczenie czasu trwania odpowiedzi w całkowitym przeżyciu (OS) pacjentów z rakiem4,5, jasne jest, dlaczego testy te nie były w stanie prawidłowo oszacować OS i konsekwentnie.
Aby obejść te ograniczenia i móc generować modele obliczeniowe specyficzne dla pacjenta, które szacowałyby spersonalizowaną odpowiedź kliniczną na panel leków, opracowaliśmy metodę nieniszczącego testowania wrażliwości na leki linii komórkowych szpiczaka mnogiego (MM) i pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego w rekonstrukcji ex vivo mikrośrodowiska szpiku kostnego, w tym macierz zewnątrzkomórkowa i zrąb6. Test ten miał jednak to ograniczenie, że polegał na konkretnym komercyjnym szkiełku mikroprzepływowym, którego wymiary i koszt ograniczały liczbę eksperymentów lub leków, które można było przeprowadzić jednocześnie w danym urządzeniu sprzętowym.
Opisany tutaj system rozszerza ten oryginalny test na wysokoprzepustową organotypową platformę dawka-odpowiedź, do badań przesiewowych in vitro leków, w oparciu o cyfrowy algorytm analizy obrazu w celu nieniszczącego ilościowego określenia żywotności komórek. Każda studzienka w płytkach 384 lub 1,536-dołkowych to rekonstrukcja 3D mikrośrodowiska szpiku kostnego, w tym pierwotnych komórek MM, macierzy zewnątrzkomórkowej oraz zrębu i czynników wzrostu pochodzących od pacjenta. Mikroskopia na żywo i cyfrowa analiza obrazu są wykorzystywane do wykrywania zdarzeń śmierci komórek w różnych stężeniach leków, które są wykorzystywane do generowania powierzchni dawka-odpowiedź. Na podstawie danych in vitro model matematyczny identyfikuje wielkość i wrażliwość chemiczną subpopulacji w obrębie obciążenia guzem pacjenta i może być wykorzystany do symulacji, w jaki sposób guz zareagowałby na lek (leki) w warunkach fizjologicznych w schemacie klinicznym6 (Figura 1).
Główne innowacje tej platformy to: (a) mała wymagana liczba komórek rakowych (1 000-10 000 na stężenie leku); b) ocena skuteczności leku w warunkach fizjologicznych (macierz zewnątrzkomórkowa, zrąb, czynniki wzrostu pochodzące od pacjenta); c) brak toksyczności wynikającej z markerów żywotności7 , ponieważ stosuje się tylko obrazowanie w jasnym polu, a zatem nie ma potrzeby transfekcji komórek za pomocą fluorescencji8 lub bioluminescencji9; d) ciągłe obrazowanie zapewnia działanie leku w funkcji stężenia i czasu ekspozycji (farmakodynamika); oraz (e) integracja między modelami ewolucyjnymi in vitro a obliczeniowymi modelami ewolucyjnymi w celu oszacowania wyniku klinicznego6 (Silva i wsp., w przygotowaniu).
Kluczowym czynnikiem, który pozwala algorytmowi cyfrowej analizy obrazu odróżnić raka od komórek zrębu, jest ich odmienne powinowactwo do dna studni: komórki MM nie przylegają i pozostają w zawieszeniu w macierzy, podczas gdy komórki zrębu przylegają do dna studzienki, a następnie rozciągają się.
To rozdzielenie następuje, mimo że MM i zrąb są wysiewane w tym samym czasie, i występuje podczas procesu inkubacji O/N. Wirowanie w wirówce po wysianiu płytki dodatkowo przyspiesza ten proces. W konsekwencji komórki MM pojawiają się na obrazie jako okrągłe, jasne dyski otoczone ciemnym pierścieniem, podczas gdy zrąb zachowuje niski profil i ciemniejszy odcień (ryc. 2). W związku z tym test w swojej obecnej formie najlepiej nadaje się do nieprzylegających komórek nowotworowych, chociaż można dokonać korekt w algorytmie, aby oddzielić raka i zrąb w oparciu o inne cechy morfologiczne, takie jak rozmiar i kształt. W tym protokole opisujemy dwa typy macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagen i macierz błony podstawnej), a także dwa typy kokultur, z (mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego) BMSC i HUVECS, reprezentującymi odpowiednio nisze śródmiąższowe i okołonaczyniowe szpiku kostnego.
Używając płytki 384-dołkowej, 5 stężeń na lek i dwóch powtórzeń, byliśmy w stanie przetestować do 31 różnych leków na próbce jednego pacjenta. W płytkach 1536-dołkowych liczba ta wynosi 127. Rysunek 3 przedstawia układ używany obecnie do ręcznego wysiewu komórek, podczas gdy rysunek uzupełniający 1 przedstawia optymalną dystrybucję przy użyciu pipetora zrobotyzowanego. W projekcie z rysunku 3 każda 384-dołkowa płytka może zawierać 3 próbki pacjenta z 7 różnymi lekami lub jedną próbkę pacjenta testowaną z 21 lekami. Każdy lek jest reprezentowany przez 5 stężeń, a każdy warunek jest umieszczany w duplikatach. Dla każdego zestawu 7 leków (np. dołki 36-39, 126-129 i 200-203) umieszcza się 4 studzienki kontrolne (bez dodatku leku). Aby zapewnić siłę działania stosowanych leków, ludzka linia komórkowa szpiczaka (np. H929 lub MM1. S) jest również wysiewany i odurzany w duplikatach w najwyższym stężeniu każdego z użytych leków (studzienki 76-89). Pozytywna kontrola linii komórkowych zapewnia, że stosowane leki mają odpowiednią siłę działania, ponieważ ich krzywe odpowiedzi na dawkę są porównywalne we wszystkich eksperymentach. W dwóch studzienkach umieszcza się linię komórkową szpiczaka w celu kontroli warunków środowiskowych, innymi słowy, w celu wykrycia ewentualnych problemów w inkubatorze laboratoryjnym podczas obrazowania (studzienki 75 i 90). Liczenie studzienek przebiega zygzakowato w celu zmniejszenia odległości pokonywanej przez zmotoryzowany stolik mikroskopu, co skraca czas akwizycji i zmniejsza zużycie sprzętu.

<table><tbody><tr><td>EVOS FL AUTO</td><td>AMG</td><td>AMAFD1000 + AMC1000</td><td>Mikroskop cyfrowy wyposażony w zmotoryzowany inkubator stołowy i</td></tr> stołowy.<tr><td>Płytka 384-dołkowa CellBind</td><td>CORNING CLS3683</td><td>SIGMA</td> Płytki dołkowe <td>Corning CellBIND 384 Płytka 384-dołkowa, polistyrenowa, powierzchnia CellBIND, sterylna, przezroczysta płaska płytka,, z pokrywką</td></tr><tr><td>Płytka 1 536-dołkowa CellBind</td><td>CORNING</td><td>CLS3832 ALDRICH</td><td>Płytki dołkowe Corning 1 536, niska podstawa, obróbka powierzchniowa CellBIND, sterylne</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02 SIGMA</td><td>Do in vitro izolacji limfocytów z ludzkiej krwi obwodowej.</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne CD138</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-051-301</td><td>Kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałem do selekcji komórek CD138 +.</td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>&nbsp; 130-042-401</td><td>Kolumna do separacji komórek.</td></tr><tr><td>Separator MidiMACS</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td>Magnes do kolumny separacyjnej.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909 SIGMA</td><td>ECM Gel firmy Engelbreth-Holm-Swarm mysi mięsak</td></tr><tr><td>Getrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1413201</td><td>Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu bez LDEV</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Life Technologies</td><td>C-003-25P-B</td><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td>RPMI 1640 Medium + L-Glutamina + Czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>FBS Inaktywowana termicznie</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie amerykańskie</td></tr><tr><td>3,1 mg/ml Kolagen bydlęcy typu I</td> Zaawansowany roztwór kolagenu bydlęcego <td>Biomatrix</td><td>5005-B</td><td>, typ I, 3 mg/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Precyzyjny</td><td>zrobotyzowany system pipetowania</td> XS <td>BIOTEK</td><td>PRC3841</td></tr></tbody></table>

organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

W tej pracy opisujemy nowatorskie podejście, które łączy testy wrażliwości ex vivo na leki i cyfrową analizę obrazu w celu oszacowania chemowrażliwości i heterogeniczności komórek szpiczaka mnogiego (MM) pochodzących od pacjenta. Podejście to polega na wysiewaniu pierwotnych komórek szpica szpikowego świeżo wyekstrahowanych ze szpiku kostnego do komór mikroprzepływowych umieszczonych na płytkach wielodołkowych, z których każda składa się z rekonstrukcji mikrośrodowiska szpiku kostnego, w tym macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagen lub macierz błony podstawnej) i zrębu (mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta) lub komórki śródbłonka pochodzenia ludzkiego (HUVEC). Komory są odurzane różnymi środkami i stężeniami i są obrazowane sekwencyjnie przez 96 godzin za pomocą mikroskopii jasnego pola, w zmotoryzowanym mikroskopie wyposażonym w kamerę cyfrową. Oprogramowanie do cyfrowej analizy obrazu wykrywa żywe i martwe komórki na podstawie obecności lub braku ruchu błony i generuje krzywe zmian żywotności w funkcji stężenia leku i czasu ekspozycji. Używamy modelu obliczeniowego do określenia parametrów chemowrażliwości populacji guza na każdy lek, a także liczby subpopulacji obecnych jako miara niejednorodności guza. Te dostosowane do potrzeb pacjenta modele można następnie wykorzystać do symulacji schematów terapeutycznych i oszacowania odpowiedzi klinicznej.

Przebieg eksperymentu został krótko opisany na Rysunku 1. Jeśli wszystkie kroki zostaną wykonane pomyślnie, obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu powinny odpowiadać Rysunkowi 2: żywe komórki MM powinny być wyraźnie widoczne jako jasne dyski, natomiast komórki BMSC lub HUVEC powinny być ledwo widoczne i dobrze rozłożone w tle. Jak widać na Rysunku 2A, rozmiar komórek MM różni się w zależności od pacjenta, ale ogólnie są one mniejsze niż linie komórkowe. Ponieważ praktyczni...

Opisujemy wysokoprzepustowy test wrażliwości na leki dla pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego. Polega ona na rekonstrukcji mikrośrodowiska szpiku kostnego (w tym macierzy zewnątrzkomórkowej i zrębu) na płytkach wielodołkowych oraz nieinwazyjnej metodzie podłużnego oznaczania żywotności komórek.

Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie chemosensytywności pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego w odniesieniu do panelu środków chemioterapeutycznych. Osiąga się to poprzez wstępne wymieszanie komórek szpiczaka mnogiego wyizolowanych ze świeżego aspiratu szpiku kostnego z prekulturąy pochodną od pacjenta stromą oraz kolagenem. W drugim kroku mieszanina CEL jest wysiewana na płytkę wielodołkową.Następnie komórki poddaje się działaniu wybranych środków chemioterapeutycznych, a płytkę przenosi się do inkubatora mikroskopu z zmotoryzowanym stolikiem w celu sekwencyjnego obrazowania komórek w ciągu 96-godzinnego okresu inkubacji. W końcowym etapie można zastosować algorytm cyfrowej analizy obrazu w celu wygenerowania krzywych przeżywalności dla każdego leku i stężenia. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi testami przeżywalności końcowej jest możliwość przetestowania kilku środków chemioterapeutycznych w odniesieniu do jednej próbki pacjenta oraz możliwość longitudinalnego pomiaru przeżywalności komórek pacjenta przez kilka dni bez konieczności oddzielania komórek od stromy lub macierzy.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię nowotworów

an-organotypic-high-throughput-system-for-characterization-drug

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje test badający rolę komórek podobnych do neutrofili w ochronie komórek chłoniaka przed cytotoksycznością środków chemioterapeutycznych. Powstaje kokultura 3D, składająca się z chłoniaka i komórek podobnych do neutrofili, i wystawia się ją na działanie winkrystyny - leku stosowanego w chemioterapii. Bezpośredni kontakt z komórkami podobnymi do neutrofili indukuje regulację w górę białek antyapoptotycznych w komórkach chłoniaka, sprzyjając w ten sposób ich przetrwaniu w obecności...

Określanie roli komórek neutrofilopodobnych we wrażliwości komórek chłoniaka na badany lek

Ludzkie komórki szpiczaka mnogiego (MM) wymagają wspierającego mikrośrodowiska komórek mezenchymalnych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej do przetrwania i proliferacji. Stworzyliśmy model zarodka kurczaka in vivo z wszczepionym ludzkim szpiczakiem i komórkami mezenchymalnymi, aby zbadać wpływ leków przeciwnowotworowych na wzrost, inwazję i angiogenezę guza.

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Obecny raport podsumowuje protokół, który może być wykorzystany do modelowania wpływu niszy mikrośrodowiska szpiku kostnego na komórki białaczkowe, kładąc nacisk na wzbogacenie najbardziej chemoodpornej subpopulacji.

Modelowanie białaczki opornej na chemioterapię in vitro

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Wprowadzamy protokół do mierzenia reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna stanowi platformę do przeprowadzania średnio-wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na wycinkach tkanek pochodzących z nowotworów klinicznych lub mysich w warunkach ex vivo.

Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Ten protokół opisuje standaryzowaną ocenę wrażliwości leków na ukierunkowane inhibitory sygnalizacji w modelach organoidowych pochodzących od pacjentów z NSCLC.

Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Poznaj wysokoprzepustowy system do oceny wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki, zachowujący mikrośrodowisko szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia długoterminowe monitorowanie żywotności komórek bez ich rozdzielania od stromy.

Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

Przeglądaj więcej filmów