Organotypowy wysokoprzepustowy system do charakteryzowania wrażliwości pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego na leki

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie chemosensytywności pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego w odniesieniu do panelu środków chemioterapeutycznych. Osiąga się to poprzez wstępne wymieszanie komórek szpiczaka mnogiego wyizolowanych ze świeżego aspiratu szpiku kostnego z prekulturąy pochodną od pacjenta stromą oraz kolagenem. W drugim kroku mieszanina CEL jest wysiewana na płytkę wielodołkową.

Następnie komórki poddaje się działaniu wybranych środków chemioterapeutycznych, a płytkę przenosi się do inkubatora mikroskopu z zmotoryzowanym stolikiem w celu sekwencyjnego obrazowania komórek w ciągu 96-godzinnego okresu inkubacji. W końcowym etapie można zastosować algorytm cyfrowej analizy obrazu w celu wygenerowania krzywych przeżywalności dla każdego leku i stężenia. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi testami przeżywalności końcowej jest możliwość przetestowania kilku środków chemioterapeutycznych w odniesieniu do jednej próbki pacjenta oraz możliwość longitudinalnego pomiaru przeżywalności komórek pacjenta przez kilka dni bez konieczności oddzielania komórek od stromy lub macierzy.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię nowotworów układu krwiotwórczego, ponieważ teoretycznie może ona zostać wykorzystana do przewidywania odpowiedzi klinicznej na konkretne schematy chemioterapii. Pomysł na ten protokół pojawił się, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że zastąpienie pierwotnych szkiełek mikroprzepływowych płytkami wielodołkowymi znacznie zredukuje koszty i czas potrzebny na przeprowadzenie eksperymentu. Aby przygotować kokultury pierwotnych komórek szpiczaka mnogiego i mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą pipety wielokanałowej, należy rozpocząć od zawieszenia komórek w RPMI 1640 w sześciokrotnym stężeniu końcowym.

Następnie zmieszać 50 µl każdego typu komórek ze świeżo przygotowanym kolagenem typu I do uzyskania końcowej objętości 300 µl. Następnie, używając pipety wielokanałowej, manualnie nanieść 8 µl mieszaniny macierzy komórkowej do centrum każdego dołka płytki 384-dołkowej, a następnie odwirować płytkę, aby skoncentrować wszystkie komórki w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.

Po wirowaniu inkubuj płytki w warunkach hodowli komórkowej przez jedną godzinę, aby umożliwić polimeryzację żelu. Następnie dodaj 80 µL uzupełnionej pożywki wzrostowej do każdego dołka i inkubuj płytkę przez noc, aby pozwolić stromie przylgnąć do dna płytki. Aby przygotować kokultury stromy szpiczaka mnogiego przy użyciu automatycznej pipety, należy rozpocząć od zawieszenia 300 µL komórek szpiczaka mnogiego CD138+ oraz 300 µL komórek stromalnych w pożywce RPMI 1640, przy sześciokrotnej końcowej pożądanej gęstości, zgodnie z powyższą demonstracją.

Następnie wymieszać oba typy komórek w probówce o pojemności 1,5 ml oznakowanej jako CD 1 38 positive i umieścić probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Dalej, zawiesić 60 µl odpowiedniej linii komórkowej szpiczaka mnogiego oraz 60 µl komórek zrębu w pożywce RPMI 1640 o sześciokrotnie większej gęstości niż docelowa, a następnie wymieszać oba typy komórek w drugiej probówce o pojemności 1,5 ml oznakowanej jako cell line i również inkubować w temperaturze 37 °C. W pipetatorze robotycznym wczytać plik skryptu wysiewania komórek.

Następnie umieść pudełko z końcówkami do pipety 200 µL w stanowisku A, płytkę mikrotitracyjną w stanowisku B oraz sterylną płytkę 384-dołkową w stanowisku E robota. Następnie wymieszaj mieszaninę komórek dodatnich CD138 z probówką świeżo przygotowanego medium wstępnie zmieszanego z CD138, a następnie przenieś 1,5 mL otrzymanego roztworu komórek do dołka numer jeden płytki mikrotitracyjnej.

Pozostałe komórki umieść w lodzie i uruchom program. Robot zasiaje pierwsze 176 studni płytki 384-dołkowej, a następnie zatrzyma się. Wykorzystaj ten czas na przeniesienie pozostałych komórek CD 1 38 dodatnich do studni numer dwa płytki mikrotitracyjnej, a następnie wznowij program.

Robot wykryje pozostałe 144 dołki płytki i ponownie się zatrzyma. Teraz należy wymieszać komórki z probówki z linią komórkową z probówką świeżo przygotowanej premiksem linii komórkowej i przenieść zawartość do dołka numer trzy płytki mikrotitracyjnej. Następnie należy ponownie wznowić program, umożliwiając robotowi zasianie pozostałych 64 dołków z 3 płytek 84-dołkowych.

Po zasianiu ostatniej studzienki, odwiruj komórki i przenieś kokultury do inkubatora do hodowli komórkowych w celu polimeryzacji kolagenu. Po godzinie załaduj do robota skrypt warstwy medium, a następnie umieść pudełko z końcówkami do pipety 120 µL w stacji A, rezerwuar z 31 mL medium RPMI 1640 uzupełnionego o płodową surowicę bydlęcą, osocze pacjenta i antybiotyki w stacji B oraz płytkę 84-dołkową CED 3 w stacji E. Następnie uruchom program. Robot przeniesie 81 µL uzupełnionego medium do każdej studzienki.

Po zakończeniu pracy robota należy przenieść komórki do inkubatora, aby umożliwić przyleganie stromy do podłoża przez noc. W celu potraktowania wysianych komórek wybranym lekiem, należy najpierw załadować skrypt płytkowy dla warstwy medium w interfejsie użytkownika automatycznej pipety. Następnie należy umieścić pudełko z końcówkami do pipety 120 µL w stanowisku A, zbiornik zawierający 21 mL RPMI 1640 uzupełnionego o plazmę pacjenta z FPS oraz antybiotyki w stanowisku B oraz pustą płytkę 384-dołkową w stanowisku E i uruchomić program; automatyczna pipeta doda 30 µL medium do wszystkich dołków.

Trzy płytki 84-dołkowe. Następnie, zgodnie z szablonem, do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej (w tym do kontrolnego) należy dodać 200 µL leku w stężeniu 20-krotnie przekraczającym stężenie maksymalne. Do dołka kontrolnego należy dodać medium uzupełnione o FPS, osocze pacjenta oraz antybiotyki.

Następnie umieść pudełko z końcówkami do pipety 120 µL w stacji A, płytkę mikrotitracyjną z lekami w stacji B oraz płytkę 3×84-dołkową z pożywką w stacji C i uruchom program dozowania leków. Robotyczny pipetator przygotuje rozcieńczenie szeregowe od 1 do 3, zgodnie z ilustracją na tej rysunku. Teraz umieść nowe pudełko z końcówkami do pipety 120 µL w stacji A, płytkę 3×84-dołkową z rozcieńczonym lekiem w stacji B oraz płytkę 3×84-dołkową z wysianymi komórkami w stacji C i uruchom program dodawania leków.

Robotyczna pipeta przeniesie 8 µL leku z każdej studzienki płytki z lekiem do odpowiadającej jej studzienki w płytce z komórkami. Po potraktowaniu ostatniej studzienki należy natychmiast przenieść płytkę z komórkami do inkubatora mikroskopu cyfrowego. Następnie, aby obrazować komórki, należy oczyścić wnętrze inkubatora laboratoryjnego wilgotną chusteczką nasączoną etanolem i ostrożnie zamienić pokrywkę płytki z pokrywką inkubatora.

Następnie wykonaj kroki w oprogramowaniu w celu dodania punktów orientacyjnych dla obszarów zainteresowania, które mają być obrazowane sukcesywnie podczas eksperymentu. Na koniec, używając obiektywu o powiększeniu 5x lub 10x, ustaw ostrość na komórki, aż komórki szpiczaka mnogiego będą widoczne jako jasne dyski otoczone ciemnym pierścieniem, a komórki zrębowe staną się ledwie widoczne. W tym eksperymencie żywe komórki szpiczaka mnogiego zostały zabarwione pseudokolorem zielonym; pod koniec eksperymentu, przy najwyższym stężeniu leku, gdy wszystkie komórki szpiczaka mnogiego obumarły, w komórkach zrębowych oraz komórkach śródbłonka żyły pępkowej człowieka obserwowano znikomy lub żaden sygnał zielony.

Następnie wykorzystano oprogramowanie robota, aby rozpocząć monitorowanie stopniowego spadku żywotności wynikającego z ekspozycji na różne stężenia leków w czasie. Przed rozpoczęciem procesu obrazowania ważne jest dokładne obejrzenie wszystkich zasianych studzienek, ponieważ artefakty mogą wprowadzić w błąd oprogramowanie do analizy obrazu i doprowadzić do błędnych wyników. Na przykład, w tym przypadku pokazano wynik nadmiernej gęstości komórek zrębu lub zbyt długiego czasu między trypsynizacją a sianiem, co doprowadziło do powstania skupisk komórek, jak widać na tym obrazie.

Jeśli linie komórkowe zostaną wysiane w zbyt wysokich gęstościach, podczas replikacji będą tworzyć kolonie, co obniży dokładność algorytmu cyfrowej analizy obrazu, ponieważ rozróżnienie poszczególnych komórek stanie się coraz trudniejsze; w tym przypadku wysiano zbyt mało komórek szpiczaka mnogiego, gdy liczba komórek szpiczaka mnogiego uzyskanych z aspiratu szpiku kostnego była niższa niż 500 000. Przed wysianiem komórek konieczne jest określenie objętości martwej stosowanej probówki i uwzględnienie tej objętości w obliczeniach rozcieńczeń. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu dwóch do trzech godzin.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o przechowywaniu wymieszanego medium zawierającego kolagen w lodzie, aby zapobiec polimeryzacji przed przygotowaniem komórek. Pomogło to również w zbadaniu, w jaki sposób heterogeniczność wrażliwości na chemioterapię w obrębie masy guza może determinować głębokość i czas trwania odpowiedzi pacjenta.