Name: Elektrofizjologia izolowanych preparatów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych gryzoni umożliwia rejestrację danych wyjściowych sieci neuronowej układu oddechowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Poznaj metodę elektrofizjologiczną rejestracji rytmu oddechowego z izolowanego rdzenia kręgowego gryzoni. Technika ta umożliwia badanie wpływu farmakologicznych i genetycznych czynników na aktywność sieci neuronowej układu oddechowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy serdecznie dziękują Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 oraz Star Foundation for Children's Health Research, a także Fundacji Molly Towell za udostępnienie placówki badawczej i wsparcie finansowe. Autorzy serdecznie dziękują również dr Kinkeadowi Richardowi za korektę manuskryptu i porady.

Ta metoda wymagała użycia obiektów zwierzęcych, co zostało dozwolone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Laval (protokół # 2012-170).
1. Konfiguracja i przygotowanie

<ol>
	<li>Rozwiązania
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe płynu CSF zgodnie z następującymi przepisami: 7,17. W literaturze dostępne są inne przepisy z różnymi stężeniami. Roztwory podstawowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
		<ol>
			<li>Roztwór soli: dodać 75,39 g NaCl (129 mM wersja ostateczna); 2,5 g KCl (3,35 mM wersja ostateczna); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mM wersja ostateczna); 2,33 g MgCl2 (1,15 mM wersja ostateczna); 1,85 g CaCl2 (1,26 mM). Rozpuścić w 800 ml wody destylowanej, a następnie napełnić do 1 l wodą destylowaną.</li>
			<li>Roztwór wodorowęglanu: dodać 17,65 g NaHCO3 (21 mM końcowy). Rozpuścić w 900 ml wody destylowanej, a następnie napełnić do 1 l wodą destylowaną. Zmiany stężenia wodorowęglanów spowodują zmiany pH.</li>
			<li>Roztwór glukozy: dodać 54,06 g glukozy (30 mM wersja ostateczna). Rozpuścić w 400 ml wody destylowanej, a następnie napełnić do 500 ml wodą destylowaną.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować płyn mózgowo-rdzeniowy, rozcieńczając 100 ml roztworu soli, 100 ml roztworu wodorowęglanu i 50 ml roztworu glukozy w 1 litrze wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
		<li>Przygotuj szklaną elektrodę, podgrzewając i rozciągając szklaną rurkę, aż pęknie. Przeszlifuj końcówkę przed użyciem. Elektroda może być wielokrotnie używana, o ile pozostaje czysta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja eksperymentalna 
	Uwaga: Szczegóły konfiguracji przedstawiono na rysunku 2.
	<ol>
		<li>Włącz wzmacniacz, średnią ruchomą, system akwizycji danych, regulator temperatury i pompę. Sprawdź wzmocnienie sygnału (wzmocnienie = 10 000), filtrację (niski próg, 10 Hz; wysoki próg, 5 kHz) oraz częstotliwość próbkowania konwersji analogowo-cyfrowej surowego sygnału (2,5 kHz).</li>
		<li>Napełnij butelkę płynem CSF i bąbelkuj ją karbogenem (95%O2, 5% CO2). Indukować bąbelkowy i podgrzany przepływ płynu CSF w komorze rejestracyjnej (objętość 5 ml) z prędkością 4 ml/min. Utrzymywać temperaturę w komorze rejestracyjnej na poziomie 26 (± 1) °C. pH powinno wynosić 7,4 w tych standardowych warunkach.</li>
		<li>Przechowywać 50 ml RT i pęcherzykowanego karbogenu aCSF w strzykawce o pojemności 50 ml w pobliżu komory rozwarstwiania.</li>
		<li>Włącz komputer i uruchom oprogramowanie do nagrywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekcja
<ol>
	<li>Zważ i wizualnie określ płeć zwierzęcia (samce mają większą odległość odbytu i narządów płciowych, podczas gdy samice mają krótką odległość odbytowo-genitalną; genitalia samców są często ciemne, podczas gdy żeńskie genitalia są różowe).</li>
	<li>Znieczulenie nowonarodzonych gryzoni należy zastosować jedną z następujących opcji: krioanestezjologia (całkowite zanurzenie zwierzęcia w lodzie na 4 – 5 minut 18), wstrzyknięcie (equitenzyna w dawce 4 ml/kg) 19 lub wdychanie lotnych środków znieczulających (izofluran 20 lub eter 21). Potwierdź odpowiednią płaszczyznę znieczulenia przy braku odruchu wycofania łapy.</li>
	<li>Połóż zwierzę na ławce, brzusznie twarzą w dół. Przeciąć rostralną część głowy na poziomie bregmy (widocznym przez skórę i czaszkę). Wykonaj ten krok natychmiast po znieczuleniu zwierzęcia.</li>
	<li>Przeciąć ciało koronalnie skalpelem pod przednimi członkami .</li>
	<li>Usuń skórę, mięśnie, tkankę tłuszczową i viscus za pomocą chirurgicznych i cienkich nożyczek i szczypiec. Ponieważ kości są miękkie w tym wieku, należy uważać, aby nie uszkodzić układu nerwowego. Wykonaj ten krok na ławce.</li>
	<li>Umieścić preparat w komorze rozwarstwiającej. Użyć płynu CSF przechowywanego w strzykawce w celu natlenienia preparatu. Od tego momentu do końca nagrania należy użyć mikroskopu.</li>
	<li>Na grzbietowej powierzchni preparatu przeciąć czaszkę i kręgi od części rostralnej do ogonowej wzdłuż osi środkowej za pomocą chirurgicznych i cienkich cienkich nożyczek i szczypiec. Otwórz przeciętą czaszkę i kręgi, aby odsłonić tkankę nerwową. Użyć płynu CSF umieszczonego w strzykawce w celu natlenienia preparatu.</li>
	<li>Za pomocą szczypiec usuń błonę pajęczynówki, cienką tkankę pokrywającą powierzchnię tkanki nerwowej. Utrzymuj pia mater i naczynia krwionośne przy tkance nerwowej. Użyć płynu CSF przechowywanego w strzykawce w celu natlenienia preparatu.</li>
	<li>Umieść preparat grzbietem do dołu i ostrożnie opuść pień mózgu i rdzeń kręgowy, przecinając nerwy i tkankę łączną nożyczkami, przytrzymując preparat na miejscu. Możliwe jest również podejście grzbietowe. Utrzymuj korzenie i nerwy tak długo, jak to możliwe. Usuń kości, aby odizolować pień mózgu i rdzeń kręgowy. Użyć płynu CSF przechowywanego w strzykawce w celu natlenienia preparatu.</li>
	<li>Usuń móżdżek i pozostałe struktury rostralne, dzieląc je skalpelem. Użyć aCSF przechowywanego w igle do natlenienia preparatu.</li>
	<li>Opcjonalnie, w zależności od projektu eksperymentalnego, usunąć most za pomocą skalpela przez odcinek koronalny przed tętnicą móżdżkową dolną 22. Należy pamiętać, że utrzymanie całego mostu spowolni rytm u szczurów i całkowicie go zahamuje u myszy. Preparaty, które obejmują tylko ogonową część mostu, wykazują aktywność podobną do oddechowej ze stabilną częstotliwością u nasady C4.</li>
</ol>
3. Nagrywanie
<ol>
	<li>Umieścić preparat w komorze rejestracyjnej brzusznie do góry. Preparat należy przymocować za pomocą szpilek w najniższej części rdzenia kręgowego i najbardziej rostralnej części pnia mózgu.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki połączonej igłą z elektrodą wywołać wgłębienie w elektrodzie (średnica szklanej końcówki: 150 - 225 μm) poprzez wyciągnięcie tłoka strzykawki, w celu częściowego napełnienia elektrody płynem CSF.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora ostrożnie umieść elektrodę blisko jednego z czwartych korzeni brzusznych. Inne korzenie brzuszne mogą również wykazywać aktywność podobną do oddechowej (np. XII nerw czaszkowy, korzeń brzuszny C1).</li>
	<li>Wywołaj wgłębienie w zbiorniku elektrody za pomocą strzykawki, wyciągając tłok, aby delikatnie zassać korzeń nerwowy. Następnie ostrożnie przesuń elektrodę, aby przyłożyć ją do rdzenia kręgowego. 
	Uwaga: Idealnie rozmiar korzonka odpowiada rozmiarowi otworu elektrody, tworząc w ten sposób uszczelnienie między wewnętrznymi i zewnętrznymi komorami elektrody. Ponieważ wzmacniacze różnicowe są powszechnie stosowane do takich nagrań, każdy otwór między wnętrzem elektrody a komorą nagraniową obniża jakość sygnału i utrudnia eliminację szumów tła.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie.</li>
	<li>Rejestrować rytm wytwarzany przez preparat w warunkach normoksyjnych (tj. płyn mózgowo-rdzeniowy bąbelkowany karbogenem: 95%O2 i 5% CO2 ) przez co najmniej 20 minut w celu określenia podstawowych parametrów preparatu.</li>
	<li>Zmień perfuzję z bąbelkowego aCSF z karbogenem na bodziec aCSF (tj. bąbelkowany 95% N2 i 5% CO2 dla bodźca hipoksji) na 15 minut. Zmień czas ekspozycji w zależności od protokołu eksperymentalnego. Zapisz czas ekspozycji w zapisie i karcie charakterystyki zwierzęcia. Jeśli to możliwe, należy używać rurek ze stali nierdzewnej między butelką CSF a komorą, aby uniknąć dyfuzji gazu na zewnątrz rurki.</li>
	<li>Przełącz perfuzję z powrotem na standardowy aCSF z pęcherzykami karbogenu na co najmniej 15 minut, aby uzyskać zapis regeneracji. Zapisz to w karcie danych dotyczących nagrywania i zwierzęcia.</li>
	<li>Zakończ nagrywanie.</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Na podstawie sygnału zintegrowanego obliczyć częstotliwość jako liczbę impulsów na minutę (wyrażoną w impulsach/min), amplitudę jako różnicę między linią bazową a szczytem impulsu (wyrażoną w mV), czas trwania impulsu jako czas trwania od początku do końca impulsu (wyrażony w s), obszar impulsu jako obszar pod krzywą impulsu na sygnale zintegrowanym (wyrażony w mV·s) (rysunek 3).</li>
	<li>Oblicz częstotliwość, amplitudę, czas trwania serii i obszar serii w warunkach normaloksycznych (linia wyjściowa), niedotlenionych (bodziec) i posthipoksyjnych (po bodźcu) jako średnią z ostatnich 5 minut nagrań dla każdego stanu. Nie należy analizować pierwszej części każdego warunku, ponieważ występuje opóźnienie między przełączeniem perfuzji a homogenizacją płynu mózgowo-rdzeniowego w komorze rejestracyjnej.</li>
	<li>Następnie należy wyrazić wartości powrotu do zdrowia po bodźcu (tj. niedotlenieniu) i po bodźcu (tj. po niedotlenieniu) jako procent wartości wyjściowych dla odpowiedniego zapisu. Wyraź wyniki jako średnie ± S.D.</li>
</ol>

<ol><li>Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+rhythm+of+breathing%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li>
<li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li>
<li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li>
<li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li>
<li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li>
<li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li>
<li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li>
<li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li>
<li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation%3A+an+approach+using+in+vitro+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li>
<li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li>
<li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li>
<li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator%3A+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li>
<li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li>
<li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li>
<li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li>
<li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions%3A+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li>
<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+agents%2Fmethods+for+anesthesia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li>
<li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li>
<li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li>
<li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane%2C+propofol%2C+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+on+extracellular+Ca2%2B%2FK%2B+antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li>
<li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT+acting+on+5-HT%281%2F2%29+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li>
<li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li>
<li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li>
<li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hokkaido+Igaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li>
<li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li>
<li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li>
<li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li>
<li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li>
<li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizations+of+eupnea%2C+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych ani konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Dokładna kwantyfikacja aktywności oddechowej może być trudna. Rzeczywiście, oddychanie jest funkcją, która może być zarówno automatyczna, jak i dobrowolna, i która jest modulowana w zależności od środowiska, potrzeb organizmu, stanu emocjonalnego i zachowania. Zaletą tej techniki jest izolacja elementów nerwowych odpowiedzialnych za wytwarzanie polecenia oddechowego. Tak więc zapisy elektrofizjologiczne preparatów pnia mózgu i rdzenia kręgowego oraz pletyzmografia są uzupełniającymi technikami badania całej neuronalnej s...

Oddychanie jest złożoną i istotną aktywnością kontrolowaną przez mózg, umożliwiającą pobieranie dwutlenku węgla (O2) i eliminację dwutlenku węgla (CO2). Centralny napęd oddechowy jest generowany przez złożoną sieć znajdującą się w pniu mózgu zarówno u ssaków1, płazów2, gadów3, ptaków4 i ryb5. Nawet jeśli badanie oddychania może być przetwarzane in vivo, precyzyjne badania mechanistyczne wymagają bezpośredniego dostępu do sieci kontroli oddechu. W tym celu Adrian i Buytendijk opracowali zredukowany preparat dla złotych rybek, w którym elektrody umieszczone na powierzchni pnia mózgu rejestrują generowany rytm związany z wentylacją skrzeli 5. Podejście to zostało następnie zaadaptowane przez Suzue w 1984 roku 6 do stosowania u nowonarodzonych gryzoni. Pojawienie się tego preparatu doprowadziło do znacznych postępów w neurobiologii układu oddechowego. Ponieważ jest to stosunkowo proste, przedstawiona tutaj technika jest podatna na szeroki zakres podstawowych badań rytmicznych zachowań motorycznych i ich pochodzenia u nowonarodzonych gryzoni.
Ogólnym celem tej metody jest rejestrowanie neuronalnej korelatu aktywności wdechowej, rytmu podobnego do oddechu, zwanego fikcyjnym oddychaniem, wytwarzanego przez sieć oddechową. Metoda ta może być stosowana w szerokim zakresie celów badawczych, ukierunkowanych na reakcje wdechowe na zmiany układu oddechowego lub farmakologię zarówno u dzikich zwierząt typu 7, jak i transgenicznych 8. Biorąc pod uwagę, że eksperymenty są przeprowadzane w niskiej temperaturze, bez aferentów sensorycznych i w warunkach, w których stężenia glukozy iO2 w aCSF są wysokie, pojawiły się pytania dotyczące fizjologicznego znaczenia zarejestrowanego sygnału. Chociaż istnieją wyraźne różnice między warunkami in vivo i in vitro (np. częstotliwość wybuchów wdechowych), faktem jest, że obecność podstawowych elementów sieci oddechowej 6 umożliwia badanie silnego rytmu związanego z istotną funkcją homeostazy 9,10.
Uzasadnieniem rozwoju i użycia tej techniki jest ułatwienie bezpośredniego dostępu do elementów pnia mózgu sieci oddechowej, które są trudno dostępne in vivo, zwłaszcza u noworodków. Pień mózgu jest umieszczany w ściśle kontrolowanych warunkach: zarejestrowany rytm nie jest modulowany przez obwodowe doprowadzające sygnały wejściowe z płuc lub ciał szyjnych, co pozwala na skupienie się badania na samym ośrodkowym napędzie oddechowym 11. W ten sposób dostęp ten jest wykorzystywany do stosowania bodźców i rejestrowania sygnału wyjściowego. W przeciwieństwie do zapisów pletyzmograficznych, rytm oddechowy jest modulowany przez wszystkie jego składowe w całym organizmie (np. wzdęcia płuc, chemosensory obwodowe), co utrudnia stosowanie precyzyjnych bodźców.
U nowonarodzonego szczura, protokół polega na rejestrowaniu czwartego sygnału korzenia brzusznego na izolowanym pniu mózgu i skróconym rdzeniu kręgowym, utrzymywanym w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF). Rytm generowany przez preparaty pnia mózgu i rdzenia kręgowego składa się z pojedynczych powolnych impulsów, które są powiązane z sygnałem wdechowym 9. Izolowane preparaty rdzenia kręgowego pnia mózgu można łatwo zarejestrować u szczurów od 0 do 4 dnia po urodzeniu (P0 - P4) 7. Podejście to jest powszechnie stosowane do oceny niedotlenienia sieci oddechowej, a także odpowiedzi na hiperkapnię, kwasicę lub leki. Przedstawiono tutaj protokół ostrej hipoksji. Stymulację tę uzyskuje się przez wycofanieO2 w aCSF; Podejście to jest powszechnie stosowane do oceny tolerancji i reakcji na zniewagi niedotlenienia. Protokół wywołuje depresję rytmu od pierwszej minuty do końca ekspozycji na hipoksję (ryc. 1)12. Ta depresja jest odwrócona podczas rekonwalescencji po niedotlenieniu 12. Jeśli chodzi o projekt eksperymentalny, ważne jest, aby zauważyć, że most, znajdujący się w rostralnej części pnia mózgu, działa hamująco na generator rytmu 8. W związku z tym preparaty pełnego pnia mózgu i rostralnego rdzenia kręgowego wykazują niższy rytm. Włączenie mostu do wyizolowanej próbki do zapisu określa się zgodnie z celem eksperymentu 13; Badanie wpływu mostu na sieć rdzenia przedłużonego wymagałoby nagrań z mostem i bez niego w celu porównania wyników 14. Ponadto jedną z zalet tej techniki jest możliwość rozszerzenia części rostralnej preparatu o okolice śródmózgowia i/lub międzymózgowia 15,16, co pozwala na ocenę wpływu tych obszarów na sieć oddechową mostkowo-szpikową.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td>Zastosowanie pod maską</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioshop</td><td>MAG510</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>SPM306</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Linde</td><td>343-02-0006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda ssąca</td><td>AM Systems, Everett, WA, USA</td><td>model 573000</td><td></td></tr><tr><td>Różnicowy wzmacniacz prądu przemiennego</td><td>AM Systems, Everett, WA, USA</td><td>model 1700</td><td></td></tr><tr><td>Średnia ruchoma</td><td>CWE, Ardmore, PA, USA</td><td>model MA-821</td><td></td></tr><tr><td>System</td> <td>akwizycji danychDataq Instruments, Akron, OH, USA</td><td>model DI-720</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie LabChart</td><td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie pryzmatyczne</td><td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora prosektoryjna</td><td>Plastikowe pudełko (np. Skrzynka Petriego) zrobi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora nagraniowa</td><td>Domowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>baza Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td><td>Kite-R</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>MINIPULS 3</td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Komputer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> domowej roboty</tbody></table>

elektrofizjologia izolowanych preparatów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych gryzoni umożliwia rejestrację danych wyjściowych sieci neuronowej układu oddechowego

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Chociaż dobrze wiadomo, że centralny napęd oddechowy znajduje się w pniu mózgu, kilka aspektów jego podstawowej funkcji, rozwoju i reakcji na bodźce pozostaje do pełnego zrozumienia. Aby przezwyciężyć trudności w dostępie do pnia mózgu u całego zwierzęcia, przeprowadza się izolację pnia mózgu i części rdzenia kręgowego. Preparat ten jest utrzymywany w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym, w którym gazy, stężenia i temperatura są kontrolowane i monitorowane. Sygnał wyjściowy z sieci oddechowej jest rejestrowany przez elektrodę ssącą umieszczoną na czwartym korzeniu brzusznym. W ten sposób bodźce mogą być bezpośrednio stosowane do pnia mózgu, a efekt może być bezpośrednio rejestrowany. Zarejestrowany sygnał jest powiązany z sygnałem wdechowym wysyłanym do przepony przez nerw przeponowy i można go opisać jako impulsy (około 8 impulsów na minutę). Analiza tych impulsów (częstotliwość, amplituda, długość i obszar pod krzywą) pozwala na precyzyjne scharakteryzowanie wpływu bodźca na sieć oddechową. Głównym ograniczeniem tej metody jest żywotność preparatu poza wczesnymi etapami poporodowymi. W związku z tym metoda ta w dużym stopniu koncentruje się na badaniu całej sieci bez peryferyjnych danych wejściowych u nowonarodzonego szczura.

Jak wspomniano we wstępie, jedną z najważniejszych zalet tej techniki jest bezpośredni dostęp do pnia mózgu w celu zastosowania różnych bodźców. Jako przykład zastosowano tutaj hipoksję. Rysunek 1.A.B. przedstawia pełny zapis protokołu, obejmujący warunki normoksji i hipoksji. Rysunek 1.C.E. przedstawia rytm zarejestrowany w warunkach normoksji (t.j. aCSF napowietrzany 95% O2 i 5% CO2 w temperaturze 26 °C). Jak wcześniej wykazano w tej kon...

Centralny napęd oddechowy znajduje się w pniu mózgu. Spontaniczny sygnał motoryczny układu oddechowego z izolowanego rdzenia kręgowego pnia mózgu jest rejestrowany poprzez umieszczenie elektrody na czwartym korzeniu brzusznym. To eksperymentalne podejście jest cenne dla badań farmakologicznych lub oceny wyzwań oddechowych i manipulacji genetycznych dotyczących rytmicznych zachowań motorycznych.

Elektrofizjologia izolowanych preparatów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych gryzoni umożliwia rejestrację danych wyjściowych sieci neuronowej układu oddechowego

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja rytmu generowanego przez jądra oddechowe pnia mózgu w warunkach braku obwodowych bodźców w różnych stanach. Osiąga się to najpierw poprzez usunięcie szyi i górnej części grzbietu szczura, w których znajduje się pień mózgu. Drugim krokiem jest izolacja układu nerwowego oraz usunięcie kości czaszki i kręgów.Następnie umieść elektrodę na czwartym korzeniu brzusznym i rozpocznij rejestrację. Ostatecznie rejestracje elektrofizjologiczne przeprowadza się na izolowanym pniu mózgu i rdzeniu kręgowym. Preparaty te służą do wykazania rytmu generowanego przez pień mózgu w odpowiedzi na różne bodźce.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie badań nad układem oddechowym, na przykład czy dana cząsteczka bierze udział w regulacji rytmu. Kontrola Generation R określa, jaki efekt wywierają stosowane środki medyczne na jądra oddechowe. Należy rozpocząć tę procedurę od umieszczenia znieczulonego noworodka szczura na szalce.Należy niezwłocznie odciąć stronę rostralną głowy na poziomie bgma, w przekroju czołowym, używając skalpela. Następnie należy odciąć tułów poniżej kończyn przednich w przekroju czołowym. W dalszej kolejności nale

electrophysiology-on-isolated-brainstem-spinal-cord-preparations-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego

Prezentacja sposobu wykonania i zastosowania zewnątrzkomórkowej elektrody ssącej używanej do pomiarów elektrofizjologicznych w rdzonach kręgowych noworodków gryzoni in...

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych

Ten film pokazuje nagrania elektrofizjologiczne izolowanych preparatów rdzenia mózgowo-rdzeniowego od nowonarodzonych gryzoni. Preparat umieszcza się w komorze rejestracyjnej, a wyrzuty wdechowe z pnia mózgu rejestruje się w warunkach natlenienia i niedotlenienia za pomocą czwartego korzenia nerwu brzusznego w rdzeniu kręgowym.

Zapisy elektrofizjologiczne preparatów pnia mózgu i rdzenia kręgowego od nowonarodzonego gryzonia

Opisano metodę chirurgiczną polegającą na uwidocznieniu brzusznej czaszki u nowonarodzonych szczurów. Stosując to podejście, możliwe jest otwarcie kraniotomii w celu przeprowadzenia ostrej elektrofizjologii i eksperymentów z mikroskopią dwufotonową w pniu mózgu znieczulonych młodych.

Metoda wykonania kraniotomii na brzusznej czaszce noworodków gryzoni

Ta procedura wykonuje długotrwałe wewnątrzkomórkowe zapisy in vivo z pojedynczych neuronów podczas fizjologicznie istotnych stanów mózgowych i po całkowitym zniesieniu trwających czynności elektrycznych, co skutkuje izoelektrycznym stanem mózgu. Stałe fizjologiczne zwierzęcia są dokładnie monitorowane podczas przejścia w stan sztucznej śpiączki.

Indukcja izoelektrycznego stanu mózgu w celu zbadania wpływu endogennej aktywności synaptycznej na pobudliwość neuronów in vivo

Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę przeznaczoną do rejestrowania elektroencefalografii (EEG) u swobodnie poruszających się noworodków z padaczką i opisujemy jej procedury, cechy i zastosowania. Ta metoda pozwala na rejestrację EEG przez więcej niż 1 tydzień.

Rejestracja EEG u noworodków szczurów poruszających się w swobodnym ruchu przy użyciu nowej metody

W tym badaniu przedstawiono metodologię wykonywania wielomiejscowych zapisów elektrofizjologicznych in vivo ze szlaku hiperbezpośredniego w znieczuleniu uretanowym.

Ostre zapisy elektrofizjologiczne in vivo lokalnych potencjałów pola i aktywności wielocząsteczkowej ze szlaku hiperbezpośredniego u znieczulonych szczurów

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Ten protokół zarówno wizualnie komunikuje przygotowanie pnia mózgu i rdzenia kręgowego, jak i wyjaśnia przygotowanie przekrojów poprzecznych pnia mózgu w kompleksowy sposób krok po kroku. Został on zaprojektowany w celu zwiększenia odtwarzalności i zwiększenia prawdopodobieństwa uzyskania żywotnych, długotrwałych, rytmicznie aktywnych wycinków do rejestrowania wyjścia neuronalnego z obszarów oddechowych pnia mózgu.

Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania in vivo, wysokiej gęstości nagrań pojedynczych neuronów z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Podejście to jest stosowane do pomiaru potencjału czynnościowego neuronów w brzuszno-bocznej szarości okołowodociągowej - regionie pnia mózgu nieaktywnym podczas snu z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) - przed i podczas znieczulenia ogólnego.

Ostre jednojednostkowe nagrania wieloelektrodowe z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową

Poznaj metodę elektrofizjologiczną rejestracji rytmu oddechowego z izolowanego rdzenia kręgowego gryzoni. Technika ta umożliwia badanie wpływu farmakologicznych i genetycznych czynników na aktywność sieci neuronowej układu oddechowego.

Elektrofizjologia izolowanych preparatów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych gryzoni umożliwia rejestrację danych wyjściowych sieci neuronowej układu oddechowego (Wideo) | JoVE Journal

Elektrofizjologia izolowanych preparatów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych gryzoni umożliwia rejestrację danych wyjściowych sieci neuronowej układu oddechowego

Przeglądaj więcej filmów